毕业论文---自制番茄汁中微生物的检测及分析

武汉生物工程学院WUHANBIOENGINEERINGINSTITUTE学士学位论文自制番茄汁中微生物的检测及分析 题目类别毕业论文系别生物工程系专业班级07014103学生姓名刘聪指导老师邹笑笑辅导老师李佑喜起止时间2010.10-2011.5论文提交时间2011年5月1 目录摘要II关键字IIAbstractIIIKeywordsIII0.引言11.研究现状11.1番茄汁的营养价值11.2番茄汁的国内外研究现状11.3研究内容和目的12.实验材料和方法22.1实验材料22.2试验方法33.结果与分析33.1番茄汁中的主要微生物33.2番茄汁中主要微生物的菌落数53.3番茄汁中部分微生物的鉴定63.4微生物对番茄汁质量的影响…………………………………………………………….74.讨论74.1试验中分离两株芽孢杆菌的分析……………………………………………………….74.2实验中大肠杆菌的计数………………………………………………………………….74.3番茄汁中微生物的预防措施…………………………………………………………….84.4家庭自制番茄汁应注意的问题………………………………………………………….8参考文献9致谢10III 自制番茄汁中微生物的检测及分析摘要番茄是属于营养丰富、色泽鲜艳的浆果类果蔬，原产地在南美，现已成为我国主产果蔬品种。它含有丰富的维他命C和维他命A以及叶酸、钾等主要的营养素，特别是它所含的茄红素，对人体的健康更有益处。番茄汁是番茄加工后的一种饮品，不仅继承了番茄的各种营养成分，还有更加美味的口感，是休闲保健的佳品。在家里自制番茄汁也成为了一种潮流，但是由于个人卫生或加工方法的原因会导致果汁被微生物污染变质或营养流失，本文将着重从番茄汁中微生物群落的组成来分析并解决这类问题。关键字番茄汁；微生物；检测；鉴定III HomemadetomatojuiceofmicrobesintestingandanalysisAbstractTomatobelongstotherichnutritionandlustersbrightberryfruitandvegetable,originofourcountryinSouthAmerica,hasnowbecomemainlyproducedfruitandvegetablevarieties.ItcontainsrichvitaminCandvitaminAandfolicacid,potassiumandothermajornutrients,particularlyitscontainlycopene,tothehealthofhumanbodyismorebeneficial.Tomatojuiceisakindofprocessedtomatoesdrinks,notonlyinheritedthetomatoes,andvariousnutrientsmoredelicioustaste,istheleisurehealthtotaste.Inhomemadetomatojuicehasalsobecomeakindoftrend,butthankstopersonalhygieneorprocessingmethodreasoncanleadtojuicedeteriorationornutrients,thispaperwillmainlyinthemicrobialcommunityfromtomatojuicecompositionanalysisandsolvethiskindofproblem.KeywordsTomatojuice;Microbial;Detection;Appraisal.III 0引言番茄，别名西红柿、洋柿子，古名报喜三元、六月柿。是营养丰富、色泽鲜艳的浆果类果蔬，具有特殊风味。番茄汁是一种天然果蔬饮料，营养比较丰富，色、香、味俱佳，是现代饮食生活较理想的饮料之一。番茄汁含有维生素A、C、柠檬酸、叶酸、食物纤维、糖和水。番茄汁还是一种可以补充人体所需各种矿物质的碱性饮料。此外，番茄汁还富含食物纤维，不溶性果胶和水溶性果胶，这些都是对人体有益的营养成分，而且低糖也是番茄汁的一大特点，所以番茄汁不仅是营养价值较高的天然饮料，而且是一种低热饮料。家庭自制番茄汁不仅方便快捷，而且休闲保健，是家庭自制果汁饮品的首选。1研究现状1.1番茄汁的营养价值和保健功能番茄汁饮料具有独特的颜色和适口的酸味，常作为开胃饮料。番茄汁中含有多种营养成分，据分析，每100g新鲜番茄汁中含有蛋白质0.7-0.9g、脂肪0.2-0.3g、碳水化合物2-4g、钙8-10mg、磷22-26mg、铁0.6-0.9mg、镁15-18mg、钾240-270mg、钠8-10mg、胡萝卜素0.3-0.5mg、硫胺素0.3-0.4mg、核黄素0.01-0.02mg、烟酸0.5-0.7mg、抗坏血酸10-25mg，柠檬酸、苹果酸约占总量的0.3％-0.6％不等。此外，番茄汁中还富含丰富的食物纤维，含有纤维素、半纤维素等不溶性食物纤维，不溶性果胶和水溶性果胶，一般认为，不溶于水的食物成分能刺激消化道，增加粪便的容量，缩短食物在肠道内的停留时间，对预防痔疮和便秘有很好的效果。果胶能降低胆固醇，对预防动脉硬化、糖尿病等成人病也有很好的作用，现代饮食生活中有必要增加食物纤维的摄入量。番茄中还含有各种果蔬当中含量最高的番茄红素。番茄红素是食物中一种天然色素成分，由于被发现具有抗氧化性、抑制突变、降低核酸损伤、降低心血管疾病以及预防癌症等多种功能，日益受到营养学界的关注。经科学证明：日常饮食中多食包括番茄或番茄制品，可减少患前列腺癌的危险，因为番茄中包含一种高效的抗毒物质。因此日常饮食生活中，应多吃番茄或喝番茄汁，这对人体的健康是很有益的[9]。1.2番茄汁的国内外研究现状营养学家认为，经常饮用番茄汁，可以大大增强机体的抗病毒能力。经常食用番茄不仅可以为人们提供多种天然的维生素、矿物质和纤维素，而且对强身健体，防病治病亦有一定的功效。目前，国内外已经有大量有关蔬菜具有抗突变作用的报道。赵五红、杨守林等以经典的PCE微核率(MN)和染色体畸变率(CA)为指标，通过两种途径考察了番茄汁与MN率和CA率之间的关系，研究发现番茄汁具有抗突变作用。浙江大学医学营养与食品卫生研究所的一项研究显示，番茄汁对糖尿病大鼠的糖尿病症状有一定的改善作用。因此，饮用番茄汁能降低血糖，改善糖尿病症状。番茄汁还有防血栓的作用，最新一期的《美国医疗协会期刊》指出：糖尿病患者应该每天喝一些番茄汁。因番茄汁可以稀释II型糖尿病患者血液，从而预防血栓的形成，减少患者并发心脏病的几率。日本也有研究发现，番茄含有的番茄红素具有显著的抗氧化和抗癌作用，不含番茄红素的番茄汁具有很好的美白作用[4]。1.3研究内容和目的9 番茄汁的营养价值和保健功能已经毋庸置疑，番茄汁饮料市场必将具有广阔的发展前景，但因为番茄的大多数品种都不耐贮藏，所以在工业生产中为了增加保质期或改善风味，不可避免的要加入一些添加剂，然而添加剂的加入势必会破坏番茄汁中的营养成分，而且工业加工中为了便于贮藏增加产品保质期，也会对原料进行灭菌，由于番茄汁是热敏性饮料，不管采用什么样的灭菌手段，肯定都是会对番茄中营养成分造成破坏，如果营养成分被破坏那饮用番茄汁饮料的保健功效就达不到了，因此家庭自制番茄汁饮料因为能方便快捷的喝到新鲜的番茄汁俨然已经成为了一种时尚和潮流，但由于个人卫生或压榨手段的原因，大部分的营养成分可以被保留下来，但长期饮用被微生物污染的番茄汁对人体也会产生危害，本文就着重研究和讨论了在家庭自制番茄汁的工艺中存在的各种微生物及其危害和合理的加工和饮用方法。2实验材料和方法2.1实验材料2.1.1番茄汁的来源本实验所选用的番茄汁是家庭方法自制的番茄汁，而番茄则是市场上购买的。2.1.2主要培养基营养琼脂培养基，孟加拉红培养基，乳糖胆盐发酵管，伊红美蓝培养基。2.1.3主要实验试剂和仪器75％酒精、0.5％番红水溶液、0.5％孔雀绿水溶液、美蓝染液、碘液、试管、锥形瓶、培养皿、烧杯、移液枪、电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌锅、电子分析天平、光学显微镜、冰箱、无菌实验台、榨汁机、电炉。2.2实验方法2.2.1番茄汁的制备⑴市场上购买新鲜度好，色泽鲜艳的番茄2个。⑵取一个番茄，在一般的环境下将其表皮洗干净，并用热水烫过之后去皮。⑶放入榨汁机中打成番茄浆。⑷用灭过菌的纱布过滤番茄浆，留下虑下的番茄汁，并加如适量蜂蜜调味。⑸将制成的番茄汁分别放入两个无菌试管中，分别记为A1、A2并置于4℃的冰箱中保存。⑹把所有的仪器都用高温灭菌并在使用前进行酒精消毒，然后在无菌环境下进行上述的操作，得到的番茄汁也分别装入两个无菌试管中，分别记为A3、A4，并置于4℃冰箱中保存。2.2.2培养基的配制⑴营养琼脂培养基的配制，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂14.0g，蒸馏水1000ml，调节pH7.0±0.2，121℃高压灭菌15min备用。⑵孟加拉红培养基的配制，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g，1/3000孟加拉红溶液100ml，琼脂20.0g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min备用。氯霉素用少量乙醇溶解后加入培养基中。⑶伊红美蓝培养基的配制，蛋白胨10.0g,乳糖10.0g，磷酸氢二钾2.0g，琼脂30g，2%伊红水溶液20ml，0.5%美蓝水溶液13ml，蒸馏水1000ml，调节pH为7.1-7.4,115℃灭菌20min备用。⑷9 乳糖胆盐发酵管的配制，蛋白胨20.0g，猪胆盐5.0g，乳糖10.0g，0.04%溴甲酚紫水溶液25ml，蒸馏水1000ml，调节pH到7.4，分装24管每管10ml，并放入一个小倒管，115℃灭菌15min。2.2.3番茄汁的处理及培养基的分装⑴把A1、A2、A3、A4试管中的番茄汁全部取出，并选取编号为A2、A4的试管换上硅胶塞进行微波杀菌处理。选取1000W的微波功率对样品进行灭菌，灭菌完后取出在冷水中迅速冷却[7]。⑵分别对A1、A2、A3、A4四份样品进行梯度稀释，选取10-1,10-2，10-3三个稀释度准备接种。⑶把实验分为3部分进行，分别为细菌的检测、霉菌酵母的检测、大肠杆菌的检测。营养琼脂培养基和孟加拉红培养基分别倒入24个培养皿中准备涂布。2.2.4番茄汁中细菌总数的检测[10](1)将A1、A2、A3、A4四份样品的3个稀释度分别吸取1ml接种到用于细菌检测的营养琼脂培养基上，一个稀释度接种两个培养基，并做上标记，如A1样品的三个稀释度分别记为A1-Q1、A1-Q1’、A1-Q2、A1-Q2’、A1-Q3、A1-Q3’；A2样品的三个稀释度则记为A2-Q1、A2-Q1’、A2-Q2、A2-Q2’、A2-Q3、A2-Q3’。其中A1-Q1、A1-Q1’为一个样品在一个稀释度下的平行试验。⑵将上述的24个培养基倒置于35℃的恒温培养箱中2d，并观察记录菌落特征和生长情况。2.2.5番茄汁中霉菌酵母的检测[15](1)将A1、A2、A3、A4四份样品的3个稀释度分别吸取1ml接种到用于霉菌酵母检测的孟加拉红培养基上，方法同上，同样做24份并做好标记，如A1样品的三个稀释度分别记为A1-M1，A1-M1’、A1-M2、A1-M2’、A1-M3、A1-M3’。(2)将上述24个培养基倒置于25-28℃的恒温箱中3-5d，并观察记录菌落的特征和生长情况。⑶霉菌的菌落较大且有菌丝，酵母菌的菌落较小且边缘光滑整齐，无菌丝。2.2.6番茄汁中大肠杆菌的检测[11]⑴将A1、A2、A3、A4四份样品的三个稀释度分别取1ml接种于乳糖胆盐发酵管中，一个稀释度的一种样品分别接种两管，并做好标记，如A1-R1，A1-R1’、A1-R2、A1-R2’、A1-R3、A1-R3’。⑵将上述24支乳糖胆盐发酵管置于35℃的恒温培养箱中培养2d，并观察记录管内的小倒管内是否有气泡。⑶如果观察到小倒管内有气泡，则将有气泡的发酵管的编号记下，取相应稀释度的原菌液1ml接种于伊红美蓝琼脂培养基平板上，并置于35℃的恒温箱内培养18-24h，然后取出观察菌落的形态。⑷在上述平板上，挑取1-2个可疑的大肠杆菌菌落进行革兰氏染色，并进行镜检确认。⑸大肠杆菌菌落在伊红美蓝琼脂培养基上中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。大肠杆菌为革兰氏阴性菌，进行革兰氏染色应为红色，而革兰氏阴性菌则为紫色。3结果与分析3.1番茄汁中的主要微生物通过梯度稀释法和涂布平板,对番茄汁中细菌总数、霉菌、酵母、大肠杆菌9 进行了检测和计数。其菌落形态和发酵管如图1～图4图1乳糖胆盐发酵管图3加拉红培养基上的微生物形态（小的为酵母菌，大的为霉菌）9 图4孟加拉红培养基上霉菌酵母的形态（小的为酵母，大的为霉菌）3.2番茄汁中主要微生物的菌落数把自制番茄汁经过微波加热灭菌处理和未经处理的样品经10-1,10-2,10-3梯度稀释后同时接种于不同培养基分别检测细菌总数、霉菌数、酵母菌数和大肠杆菌数。根据每个平板的菌落特征，统计各微生物菌落的数量，由于10-3稀释度下菌落数过少，没有可比性，所以没有记录下此稀释度下的菌落数，余下结果见表1。表12种稀释度下从番茄汁中分离得的微生物菌落数　菌种名称样品编号细菌霉菌酵母大肠杆菌稀释度10-1稀释度10-2稀释度10-1稀释度10-2稀释度10-1稀释度10-2稀释度10-1稀释度10-2A11691111433137254-1‘55810341123202-A22617-9---2’323-3---A3348576118412--3‘352521477101-A4471--4---4’3-2-2---9 从表1可知,采用微波灭菌过的样品明显微生物减少了，而用基本消毒法杀毒后的样品微生物的数量也有显著的减少，由于番茄汁的pH为4.0左右，大多数的细菌都不能生长，只有少数的耐酸菌和霉菌酵母可以生长，所以在家庭自制番茄汁时，应注意器具的清洗和个人的卫生，并且有条件的可以选择微波加热灭菌，从而保存较长的时间，一般情况下最好是现榨现喝，既新鲜可口也可避免微生物污染而变质。3.3番茄汁中部分微生物的鉴定从营养琼脂培养基和孟加拉红培养基上随即选取了两对菌落形态不同的菌种进行鉴定，对比内容如表2、表3。经阅读相关文献[1]并通过对菌落形态、革兰氏染色结果及镜检结果分析可知，细菌a、b均属芽孢杆菌。其中a属于巨大芽孢杆菌；b则属于枯草芽孢杆菌[12]。霉菌c属于青霉属中的霉菌，d属于曲霉属中的霉菌[15]。　ab菌落形状圆形圆形菌落边缘整齐不甚整齐表面略有光泽皱纹状，无光泽颜色白色乳白色气味不明显不明显革兰氏染色阳性阳性镜检形态杆状杆状芽孢中间芽孢，芽孢不大于菌体中间或一端芽孢，芽孢不大于菌体表2琼脂培养基上两种不同细菌的比较　cd大小（直径）1.6cm4.2cm表面形状中心突出有明显的辐射条纹棉絮状菌落质地硬软厚度-4-5mm气味无发霉味背面黄色明显辐射条纹白色颜色蓝色浅黄色表3孟加拉红培养基上两种不同霉菌的比较3.4微生物对番茄汁质量的影响[2]3.4.1细菌的影响常见的在果汁中的细菌有乳酸菌、醋酸菌和丁酸菌。乳酸菌在厌氧条件下可迅速繁殖，并能使果汁腐败，而且乳酸菌耐酸，对低酸性果汁极具危害性，但在有氧环境或温度低于8℃时9 不生长。醋酸菌和丁酸菌则是耐高酸的细菌，但是因为其生长需要充足的空气，所以很少参与果汁的腐败。由于这类细菌也常附着于果实表面，有时也能使番茄汁产生乙酸而腐败。3.4.2酵母菌的影响酵母是引起番茄汁发酵腐败的重要菌类，在果实上发现的酵母种类很复杂，任何一种酵母都可能在果汁中发现，但果实上的酵母仅有一部分能对果汁发生作用，不同的酵母具有各种不同的特征，且在缺氧的环境中，酵母较其他微生物更易生长。由于酵母菌对于番茄汁的危害很普遍，研究也很透彻，本文就没有对酵母菌进行更深入的研究。3.4.3霉菌的影响许多霉菌都能使果实腐败，也能在果汁中发现。果汁中最为常见的霉菌是青霉属，这些霉菌具有一定的耐热性，会产生臭味和霉味，并可破坏果胶使果汁澄清，也常使酸类的成分改变或生成新的酸，导致风味恶化，有些霉菌也可因生产色素而使番茄汁变色。4讨论4.1实验中分离出两株芽孢杆菌的分析实验中分离出的巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，按照菌种的特性来看，芽孢杆菌属于耐酸耐高温的细菌，在营养琼脂培养基上生长应该是不会产生芽孢的，但实验中镜检观察到了芽孢的产生，根据笔者分析，由于这两种细菌的最适生长PH都为7.0左右，而番茄汁的PH为4.0左右，由于PH过低的原因导致这两种芽孢杆菌生长缓慢并可能产出休眠体—芽孢，所以镜检时可以看到芽孢产生。4.2实验中大肠杆菌的计数由于本实验只是为了对不同制做方法下番茄汁大肠杆菌的数量做比较，并且受到实验条件的限制，所以没有采用国标的9管发酵查MPN表的方法得到更精确的数据，而只是对大肠杆菌菌落进行了计数，这样依然可以得到实验所需要的相关数据，并可以进行比较。4.3番茄汁中微生物的预防措施番茄是一种很容易变质且不能长时间储存的果蔬产品，因而番茄汁也不能长时间储存，否则会被微生物污染而变质，因此针对各种引起变质微生物的生理习性，我们可以运用低温密封储存和微波高温灭菌的方法对一些微生物进行预防和灭菌。4.4家庭自制番茄汁应注意的问题番茄汁风味佳美，具有很高的营养价值也易于被人体吸收，因而家庭自制番茄汁已经成为了一种时尚和潮流，但由于原料、加工工艺或个人卫生等原因会导致带有一些微生物，所以在家庭自制番茄汁时，应注意以下几点：①在榨汁之前要对番茄进行清洗。②对榨汁机、杯子、纱布、人体等都要进行消毒。③有条件的可以把番茄汁进行微波杀菌。④新鲜的番茄汁最好马上喝完，这样营养成分还没有流失，微生物还没有与番茄汁发生反应而变质。⑤如果喝不完了要用保鲜膜封好放入冰箱中保存，时间也不能太久。以上是一些建议，希望广大番茄汁爱好者能用正确的方法饮用好的果汁。9 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