环境微生物学实验指导书

实验一显微镜的原理及其使用方法一．目的1、学习普通光学显微镜的基本原理2、学习掌握光学显微镜的使用方法3、结合实验室提供的实验装片观察微生物的形态，并学习测量微生物大小的方法二、实验器材1、微生物实验装片2、显微镜、目镜测微尺、物镜测微尺（镜台测微尺）、载玻片，盖玻片等三、实验步骤（一）显微镜的结构和各部分的作用其构造包括机械和光学两部分。机械部分主要包括：1、镜筒镜筒长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有三个接物镜。2、载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。3、调节器镜筒内旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节接物镜与所需观察物体之间的距离。光学部分主要包括1、接目镜一般使用的显微镜具有2~3个接目镜，其上常刻有“5×”或“10×”或“15×”等数字及符号，表示使用时可以放大5倍，10倍，15倍。观察微生物时常用10倍或15倍的接目镜。2、接物镜接物镜装在回转板上，可分低倍镜，高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40（或45）100（或90）。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如，用放大40倍的接物镜与放大10倍的接目镜所得的物象的放大倍数为400，如果用放大15倍的接目镜则放大倍数为40×15=600。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。油镜的放大倍数最大（90或100）。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，所以自标本玻片透过的光线，因介质密度（从玻片至空气，再进入油镜）不同，有些光线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使进入个别光线过少，物象显现不清楚，所以为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率相仿的镜油。因为这种接物镜使用是要加镜油，所以我们叫它油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油所以我们叫它干镜。使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体的观察，不进行染色。在观察细小动物时，低倍镜主要用来区别动物的种类和看出它们的活动状态，而高倍镜则可以看出动物的结构特征，低倍镜容易看到物体的全貌，油镜在大多数情况下使用来观察染色的涂片。3、集光器集光器在载物台的下面用来集合由反光镜反射来的光线。它可以上下调整，中央装有光圈，用以调节光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。4、反光镜装在显微镜的最下方，有平凹两面，可自由转动方向，以反射光线至集光器。（二）显微镜使用和保护的方法1、低倍镜的使用法（1）置显微镜于固定的桌几上，窗外不宜有阻碍视线之物。 （2）拨动回转板，把低倍镜移到镜筒的正下方，和镜筒连接而对直。（3）拨动反光镜向着光线的来源处，用眼对准接目镜仔细观察，若视野完全为白色，这是光线已经通到镜里的表示。（4）把载玻片放到载物台上，要观察的标本放到圆孔的最中央。（5）将粗调节器向下旋转，同时眼睛注视接物镜，以防接物镜和载玻片相碰，当接物镜的尖端距载玻片0.5mm时要停止。（6）把粗调节器向上旋转，左眼向目镜里观察。如标本显出，但不十分清楚，可用细调节器调节，到完全清楚。（7）假如因旋转粗调节器太快，致使超过焦点，标本不能出现，不应在眼睛注视接目镜的同时向下旋转粗调节器，必须从第（5）条做起，以方因为没有把握的旋转，使接物镜与载玻片接触。（8）在观察时，最好两眼都能同时睁开。如用左眼看显微镜，右眼看桌上纸张，可以一面看一面画出看到的图象。2．高倍镜的使用方法（1）使用高倍镜以前，先用低倍镜检查，把要观察的标本放到视野正中。（2）拨动回转板使高倍和低倍两镜头互相对换，当高倍镜移动到载玻片时，往往镜头十分靠近载玻片。这时必须注意是否因为高倍镜靠近的缘故使载玻片也随着移动。如果载玻片有移动的现象，则应立即停止推动转向板，把高倍镜退回原处，再按照使用低倍镜的方法，矫正标本的位置，然后旋转调节器，使镜筒稍微向上，再对换高倍镜。（3）当高倍镜已被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的标本，往往不是分清楚，这时可旋转细调节器，上下移动，但不要过分移动。3、油镜的使用方法（1）如用高倍镜放大，倍数还不够，则须油镜，用它之前先用高倍镜检查，把要观察的物体放到视野之中。（2）用油镜时，在载玻片上加一滴镜油，然后拨动回转板对换高倍镜和油镜，使油镜和油接触，后用接目镜观察，假如不清晰，可旋转调节器，但不要粗调节器。（3）用过油镜后，必须用擦镜纸或软绸将载玻片和油镜所粘着的油拭净，必要时用少许二甲苯擦拭。4、显微镜的保护方法（1）显微镜应放在干燥的地方，使用时须避免强烈的日光照射（2）接物镜或接目镜不清洁时，应用擦镜纸或软绸擦拭。（3）用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。（三）目镜测微尺和物镜测微尺及其使用方法1、目镜测微尺是一圆玻片，其中央用精确的刻度，刻度的大小，随使用的接目镜和接物镜的倍数及筒长而改变，使用前应用物测微尺进行标定。2、物镜测微尺，厚玻片，中央有圆盖玻片，上有100等份刻度，每等分的长度为1/100mm，使用时先将目测微尺装在接目镜的隔板上，使刻度朝下，把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，用平常观测的方法，先找到物测微尺的刻度，再移动物测微尺与目测微尺使两者的第一线重合，顺着刻度找出另一条重合线。然后计算物测微尺的每一小格有目测微尺的小格若干个，计算后者刻度表示的长度，如物测微尺的一小格相当于目测微尺的5格，则目测微尺在此种条件下，每格的长为2um，如在同样条件下测量物体，而物体的长为目测微尺的两小格，宽为半小格，知物体的大小为1um×4um。 实验二活性污泥中微生物相的观察一、目的1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法。2、观察活性污泥法曝气池混合液中不同微生物的形态，学习微生物图的绘制。3、学习压滴法制片技术。二、实验器材1、活性污泥法曝气池混合液。2、显微镜、擦镜纸、吸水纸、小量筒、滴管等。三、实验内容及操作步骤活性污泥法曝气池中的活性污泥和生物膜法构筑物中的生物膜是生物法处理废水的工作主体，它们有细菌，霉菌，酵母菌，放线菌，原生动物等微生物，以及后生动物如轮虫，线虫等与废水中的固体物质所组成，本实验主要是观察活性污泥和生物膜的结构及菌胶团的形状和辨认活性污泥和生物膜的组成之一—原生动物的形态特征和运动方式等。1、标本的制备（1）活性污泥1）取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央（如污泥较少可待沉淀后观察，如沉淀教多要稀释后进行观察）2）小心的用洗净的盖玻片覆盖，这样，就制成了活性污泥的标本，加盖玻片时应使其中央已接触到水滴后放下，否则会在片内形成气泡，影响观察。（2）生物膜1）从生物膜法的构筑物内刮取生物膜一小块，用蒸馏水稀释，制成供显微镜观察用的菌液。对于用石子做滤料的生物滤池，也可取石子一小块，置于干净的烧杯中，加蒸馏水少许和玻璃珠，摇荡数分钟，使滤料上的生物膜脱落在水中，去掉滤料再摇荡数分钟，做成菌液。2）取菌液一小滴，置于干净的载玻片中央，用干净的盖玻片盖上。2、显微镜的观察（1）低倍镜的观察1）在选定的接目镜下，利用低倍镜，确定目测微尺一格的长度2）观察所制备的微生物标本玻片，画出所见原生动物，菌胶团等微生物的形态草图。选择一个原生动物，量出其尺寸。3）记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。（2）高倍镜观察1）改用高倍镜观察，画出微生物草图，并与用低倍镜所看到的比较，注意其不同点。2）记下显微镜的放大倍数。 实验三细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等不同微生物形态的观察一、目的1、进一步掌握显微镜的使用方法。2、观察几个典型细菌的形态和构造（示范片）。3、观察霉菌、酵母菌、藻类、原生动物和微型后生动物的形态和构造，以便找出它们之间及与细菌之间的区别点。二、实验器材1、显微镜、擦镜纸、镜油、二甲苯等。2、示范片（1）葡萄状球菌涂片、大肠杆菌涂片（2）曲霉装片、酵母菌涂片、草履虫装片、轮虫装片、绿虫藻装片、小球藻装片三、实验内容和方法（一）复习显微镜的使用方法，重点放在油镜的使用部分。（二）严格按照显微镜的使用方法，依次逐个观察细菌的形态和构造及霉菌、酵母菌、藻类、原生动物和微型后生动物的形态和构造，分别绘出其形态和构造。 实验四培养基的制备——普通牛肉膏蛋白胨固体培养基一、实验目的1、学会玻璃器皿的洗涤和灭菌的准备工作2、掌握培养基配制和无菌水置备方法二、实验器材1、养皿、试管、吸管、锥形瓶，烧杯等2、纱布、棉花、报纸、牛皮纸3、PH试纸6~8.4、洗液、10%的HCL、10%NaOH4、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水三、实验内容（一）玻璃器皿的洗刷与包装1、洗刷玻璃器皿在使用前要进行洗刷。培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管可以用洗液浸泡，再用水清洗，洗刷干净的玻璃器皿可放在烘箱中烘干。2、包装（1）培养皿由一底一盖组成一套，按实验所需的套数一起用牛皮纸包装（2）吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成1~1.5cm长的棉塞，以防细菌吸进口中，并避免将口中的细菌吹入管内。棉花要塞的松紧适宜，吸时既能通气又不会使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管尖端放在4~5cm宽的长纸条上的一端，吸管与纸条约成45°，折叠包装纸包住尖端，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即旋转式包在管子外面，余下纸头折叠大结，按照实验需要，可单支包装或多支包装，以备灭菌。培养皿和吸管也有放在特制容器内灭菌（3）试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花堵塞，作好的棉塞，四周应紧帖管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物会沿棉塞皱折进入。棉塞不能过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的2/3应在管内或瓶口，上端露出少许，以便拔出，棉塞的大小及形状应如图所示，在制作培养基的过程中，如不小心将棉塞粘上培养基上，应用清洁棉花重做待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包装，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内以备灭菌（二）培养基的制备1、步骤（1）配制溶液按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需的水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶解的原料如蛋白胨、肉膏、琼脂等需加热溶解，这时，当原料全部溶解后应加水补充因蒸发所损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。（2）调整pH值用pH试纸测定培养基溶液的pH试纸。按要求以10%HCL或10%的NaOH调整到所需的pH值。（3）过滤用纱布或棉花过滤均可，如培养基的杂质很少，可省略过滤（4）分装将培养基分装在试管和锥形瓶内，要使培养基直接流入管内和瓶内，注意不要沾污管壁，并避免沾湿棉塞，装入的培养基量视管子的大小而定，一般制备斜面培养基时每支试管装入的量为容量的1/4~1/3。（5）斜面培养基的制作 将装有琼脂的培养基的试管进行灭菌后，趁热搁置在木条或木棒上，使试管呈适当的斜度，待培养基凝固后呈斜面。2、营养琼脂的培养基它是一种固体培养基，本实验制备后可供细菌总数测定使用。（1）成分蛋白胨2.5g牛肉膏0.75g氯化钠1.25g琼脂2.5~5g蒸馏水250ml（1）制法1）将上列成分混合后，煮沸到琼脂完全溶解，在加热过程中要不断搅拌2）用蒸馏水补充蒸发损失的水分3）调整溶液的pH值为7.4~7.64）趁热用纱布过滤，并分装在试管中，每管装约10~15ml，如装在锥形瓶则要用250ml，以装100ml左右为宜，管口或瓶口均用棉花塞住5）置高压蒸汽灭菌器中，以121°c灭菌20分钟，然后储存在阴暗处备用（三）无菌水的制备在试管或瓶内先盛适量的自来水，使其灭菌后，其水量恰为9ml或99ml，此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得，也可先将管或瓶灭菌，再用灭菌的吸管取灭菌的自来水9ml或99ml加入管或瓶中，无菌水常用来稀释水样。 实验五灭菌和消毒一、实验目的1、学习灭菌的准备工作。2、学习掌握高压蒸汽灭菌技术二、实验器材3、培养皿、试管、吸管、锥形瓶，烧杯等；4、纱布、棉花、报纸、牛皮纸；5、高压蒸汽灭菌器、烘箱、冰箱、电炉。三、实验内容1、加水热源为煤气灯或电炉者，需先加水到器内底层隔板以下1/3处，有加水口的从加水口加入，由玻璃管看水位到水线停止，若热源为蒸汽不必加水2、把需要灭菌的器物放入灭菌器内，关严灭菌器盖，不要漏气。3、打开出气口。4、点火如热源为蒸汽，则应慢慢打开蒸汽进口，不要让蒸汽过猛冲入灭菌器内5、器内的水沸腾后，蒸汽逐渐驱除内部原有冷空气，如灭菌器装有温度计，当到了100度时，证明器内已经充满了蒸汽，可以关闭出气口，如没有温度计，则当出气口排出的蒸汽特别猛烈时认为冷空气被全部驱除，可以关闭出气口，应当特别注意，如果冷空气没有排尽，器内虽然到达一定的气压，但不会到达所需的温度6、关闭出气口后，器内的蒸汽将不断增多，压力和温度不断升高，当蒸汽压达到所需的压力时，即为灭菌时间开始，这时要调整火力的大小，以维持所需的压力。灭菌时间的长短有灭菌物体所决定，玻璃器皿，无菌水营养琼脂培养基可用1kg/cm²（121°c）的压力灭菌20分钟，含糖的培养基用0.7kg/cm²（115°c）的压力20分钟。7、灭菌的时间达到，停止加热。8、等压力计指数到了0时，打开出气口，如果过早打开，培养基会因为压力骤减，温度并不会很快下降，导致培养基翻腾，沾污棉塞。9、揭开器盖，取出灭菌的物品，将剩余的水放掉。10、待灭菌物冷却后，取出置于冰箱内放置待用。 实验六水中细菌总数的测定一、实验目的1、学习水中细菌总数的测定方法；2、学习无菌操作技术；3、学习平板菌落计数的方法和原理。二、实验器材和材料1、无菌培养皿、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌试管、无菌水；2、营养琼脂培养基；3、接种环、酒精灯、恒温箱等。三、实验内容和方法（一）、生活饮用水以无菌操作方法，用无菌移液管吸取1ml充分混匀的水样注入无菌培养皿中，倾注入约15ml已经融化并冷却至45度左右的营养琼脂培养基，平放于桌子上旋摇培养皿，使水样与培养基充分混合均匀，冷凝后成平板。每个水样倒三个平板。另取一个无菌培养皿做空白对照。将上述所有平板倒置于37度恒温培养箱中培养24h，计数菌落数。算出三个平皿上生长的菌落数的平均值即为1ml水样中的细菌总数。（二）水源水1、水样稀释在无菌操作条件下，以10倍稀释法稀释水样，视水体污染程度定稀释倍数。2、接种用无菌移液管吸取3个适宜浓度的稀释液1ml（或0.5ml）加入培养皿内，再倒培养基，冷凝成平板后倒置37度温箱中培养24h。3、计数将培养24h的平板取出进行菌落计数，查表换算出相应的细菌总数。要求：按照上面所列各实验目的、实验器材和实验内容、方法，结合教材实验一、实验二、实验六、实验十一进行实验预习