答案分子生物学作业一

《分子生物学》作业第2-4章/第8章1.什么是SNP？试述研究SNP的意义。2.ORF 3.调节基因 4.请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。 5.简述酵母双杂交技术的原理。6.分子克隆技术包括哪些基本步骤？目的基因和载体连接主要有哪些方法？7.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。8.举例说明载体应具备的基本要素以及双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。9.有哪些常用的探针标记物？如何进行探针的标记？10.影响核酸分子杂交的因素有那些？如何进行杂交条件的优化？答：1.SNP是单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。由于其在染色体上的分布具有相对均一性而密度又远高于微卫星DNA位点，且其二态性较STR更易于实现快速高通量自动化检测，故被认为是最具应用潜力的新一代遗传标志物，其在后基因组时代针对人类复杂性状疾病和药物遗传学研究中将起到越来越重要的作用。2.ORF（Openreadingframe）开放阅读框,是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。3.具有调节其他基因性状功能的基因，称为调节基因。包括决定阻抑物、阻抑物蛋白、其他环状AMP受容蛋白质等控制性物质结构的基因、阻抑物作用部位的操纵基因、RNA多聚酶以及它的促进物质的作用部位启动区等等。4.最常用的流程是基于凝胶的工作流程，通过样品制备、样品标记、双向电泳分离、图像获取、图像分析，到抠点、酶切、点靶和MALDI-TOF蛋白质鉴定从而获得蛋白质性质数据。4 5.酵母双杂交系统巧妙地利用真核生物转录调控因子的组件式结构特征，这些蛋白质往往有两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（DNAbindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定的基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。6.分子克隆包括以下几个步骤：（1）目的基因的获取（2）载体的选择（3）目的基因和载体的酶切与连接（4）重组DNA导入受体细胞（5）重组体的筛选和鉴定目的基因和载体的连接方法有：①粘性末端连接②平末端连接③人工结构连接④同聚物加尾连接。7.主要工具酶有：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶Ⅰ、反转录酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶和末端脱氧核糖核苷酰转移酶。限制性核酸内切酶主要作用：（1）在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段；切割载体形成切口，使目的基因能插入载体；（2）分析限制性片段长度多态性，用于遗传病的诊断、法医DNA指纹分析等；(3)用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。DNA聚合酶Ⅰ作用：（1）5’→3’聚合酶活性；（2）3’→5’核酸外切酶活性；（3）5’→3’核酸外切酶活性。反转录酶作用：（1）反转录作用；（2）核酸酶H的水解作用；（3）依赖DNA的DNA聚合酶作用。DNA连接酶作用：主要是催化两个互补黏性末端或平末端的两条双链DNA分子的5’磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同黏性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。碱性磷酸酶作用：（1）除去DNA片段上的5’4 磷酸，以防自身连接；（2）在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5’端的磷酸。多核苷酸激酶作用：催化核酸分子末端磷酸化的酶类。如T4多核苷酸激酶，可通过磷酸化或磷交换的方式，将ATP分子5’位的磷酸基团转移到DNA或RNA的5’端。末端脱氧核糖核苷酰转移酶作用：（1）在载体或目的基因3’末端加上互补的同质多聚尾，形成人工黏性末端，便于DNA重组连接；（2）用于DNA3’末端的同位素探针标记。8.载体具备要素：1.能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。2.带有遗传筛选标记。3有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。.双抗生素筛选原理：某些质粒载体如pBR322质粒中具有Amp和Tet抗性基因，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列（在Tetr基因序列内）时，则此质粒由Tetr变为Tets。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能生长的细菌只是含有空载体，从而筛选出含有目的基因的工程菌。蓝白斑筛选的原理：某些质粒载体带有lacZ’基因，该基因编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸，IPTG可诱导lacZ’基因的表达而生成α-肽，其能与宿主细胞所编码的缺陷性β-半乳糖苷酶实现所谓的α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶活力。该酶能催化X-gal形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ’基因中的MCS时，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，从而可以将其筛选出来。9.常用探针标记物有：32P、35S、3H、131I、125I、生物素、地高辛、辣根过氧化物酶、荧光素及光敏生物素等。探针的标记方法有：（1）缺口翻译法或切口平移法；（2）随机引物法；（3）末端标记法；（4）反转录标记法；（5）化学修饰标记法；（6）酶促反应标记法。10.影响核酸分子杂交的因素有：（1）核酸分子的浓度与长度；（2）温度；（3）离子强度；（4）甲酰胺；（5）核酸分子的复杂性；（6）非特异性杂交反应等。4 杂交条件的优化涉及到：（1）探针的选择；（2）探针的标记方法；（3）探针的浓度；（4）杂交最适温度；（5）杂交反应时间；（6）洗膜温度；（7）杂交液的优化。4