复方血栓通胶囊微生物限度检查法验证

复方血栓通胶囊微生物限度检查法验证【摘要】目的建立复方血栓通胶囊微生物限度检查方法。方法采用《中国药典》(2010年版)一部微生物限度检查法对复方血栓通胶囊微生物限度检查进行验证。结果复方血栓通胶囊对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌有抑制作用,不适宜采用平皿法检查。因此选择用培养基稀释法消除其抑菌活性。结论本品细菌数检查可用培养基稀释法；霉菌和酵母菌数可用常规法；大肠埃希菌检查可常规法进行检测。【关键词】复方血栓通胶囊；微生物限度；抑菌活性；培养基稀释法复方血栓通胶囊是国家火炬计划重大项目的成果，是全国为数不多的单品种年销售数亿元的中成药。复方血栓通胶囊由三七、黄芪、丹参、玄参经科学方法提取有效成分制成；功效活血化瘀,益气养阴；用于血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉阻塞、稳定性劳累型心绞痛等。由于功效显著，应用广泛，被载入《中国药典》。复方血栓通胶囊为不含原药粉的口服制剂，微生物限度检查包括细菌、霉菌和酵母菌、控制菌中的大肠埃希菌。为了保证用药安全，确立可靠的微生物限度检验方法，作者按照《中国药典》微生物限度检查方法［1］规定，对该品的微生物限度的检查法进行了验证。现报告如下。7 1实验材料1.1仪器及样品JYT-2架盘天平，LRH-150B型生化培养箱，隔水式电热恒温培养箱，MLS-3750高压蒸汽灭菌器，洁净工作台，三角瓶，培养皿等。复方血栓通胶囊(广东众生药业股份有限公司100901101001101201)1.2培养基稀释剂及试剂营养琼脂培养基和对照培养基,玫瑰红钠琼脂培养基和对照培养基,改良马丁培养基,营养肉汤培养基,胆盐乳糖培养基和和对照培养基，4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基和对照培养基,麦康凯琼脂培养基和对照培养基，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等,均来源于中国生物制品检定所。1.3试验用菌种大肠埃希菌(Escherichiacoli)［CMCC(B)44102］,金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)［CMCC(B)26003］,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)［CMCC(B)63501］,白色念珠菌(Candidaalbicans)［CMCC(F)98001］，以上菌种均来源于中国生物制品检定所,黑曲霉(Aspermlillusnimler)［CMCC(F)98003］菌种来源于广东省药品检验所。所有菌种均为不超5代的菌株。2方法和结果2.1细菌、霉菌及酵母菌检查法的验证7 2.1.1菌液的制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24~48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数约为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5d，加入5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液，备用。2.1.2供试液的制备取样品10g，置已灭菌的三角瓶中,分别加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混合均匀,制成1�∶�10的样品稀释液。平皿法直接取稀释液为供试液。2.1.3培养基的适用性检查按照《中国药典》(2010版)相关规定检查，培养基上的菌落平均数不小于对照的菌落平均数的70%，形态大小与对照的一致，判定培养基的适用性检查符合规定。2.1.4验证方法2.1.4.1平皿(常规)法2.1.4.1.1试验组取供试液1ml和50~100cfu的试验菌各1ml,分别注入平皿中7 立即倾注相应琼脂培养基,每株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌数。2.1.4.1.2试验菌液组取已制备好含50~100cfu的试验菌液各1ml分别注入平皿中，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿立即倾注营养琼脂培养基，30~35℃培养3d，计数；加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。23~28℃培养5d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。2.1.4.1.3供试品对照组取供试液1ml注入平皿中,立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基15~20ml,每种培养基平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。2.1.4.2培养基稀释法2.1.4.2.1试验组取供试液1ml分别等量注入五个平皿中，并分别加入50~100cfu的试验菌各1ml,立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按培养基稀释法测定其菌数。2.1.4.2.2试验菌液组取已制备好含50~100cfu的试验菌液各1ml分别注入平皿中，加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿立即倾注营养琼脂培养基，30℃~35℃培养3d，计数；加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基。23℃~28℃培养5d，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。2.1.4.2.3供试品对照组取供试液17 ml分别等量注入五个平皿中,立即倾注营养琼脂培养基15~20ml,平行制备2份，按平皿法测定其菌数。2.1.5回收率计算回收率(%)=试验组平均菌数-供试品对照组平均菌数试验菌液组平均菌数×100%2.1.5.1平皿法检测的结果金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌试验组的回收率70%，霉菌及酵母菌检查可采用平皿法。见表1。2.1.5.2培养基稀释法检测的结果大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌试验组的回收率均>70%，见表2。表明该产品的抑菌活性消除，细菌数检查可采用培养基稀释法。2.2大肠埃希菌(控制菌)检查法的验证2.2.1菌液制备取大肠埃希菌斜面培养基少许,接种5ml营养肉汤培养基内,置30~35℃培养24h,取均匀培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌数约为10~100cfu的菌悬液,在2~8℃保存,备用。2.2.2大肠埃希菌检查用培养基的适用性检查按照《中国药典》(2010版)相关规定检查，培养基的促生长能力、抑制能力和指示能力均符合要求，判培养基的适用性检查符合规定2.2.3验证方法试验组：取1:10供试液107 ml和上述含10~100cfu大肠埃希菌液1ml；阳性对照组：取含10~100cfu大肠埃希菌液1ml；阴性对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液10ml；分别加入盛有100ml胆盐乳糖增菌液的三角瓶中，培养24h.分别取上述培养物0.2ml,分别接种至含5mlMUG培养基的试管内,置30~35℃培养,于5h,24h在365nm紫外线下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后,沿培养管的管壁加入5滴靛基质试液，观察液面颜色。结果详见表3。从表3可以看出，试验组、阳性对照组均检出大肠埃希菌,阴性对照组为无菌生长。表明常规法检出大肠埃希菌，供试液对大肠埃希菌无抑制作用，阴性供试液对本法无干扰，适用于该产品的大肠埃希菌检查。3讨论《中国药典》2010版规定微生物限度检查法中细菌数、霉菌和酵母菌数计数验证方法验证的回收率应不低于70%,采用平皿法对复方血栓通胶囊验证时，金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌试验组的回收率70%。即该产品对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌有抑制作用,不适宜采用平皿法检查。在改用培养基稀释法(1→5)后，大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌试验组的回收率均>70%。因此,检查该品种的细菌数可考虑采用培养基稀释法或其他方法。参考文献［1］7 国家药典委员会，中国药典一部附录.北京：中国医药科技出版社，2010:79-84.注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文7