运动生物化学实验指导

运动生物化学实验指导 实验一   实验基本技术操作一、实验目的（一）了解实验室规则及注意事项。（二）学习运动生物化学实验常用仪器的使用及清洗方法。（三）学习721型分光光度计的使用方法。二、实验原理运动生物化学是研究人体运动时体内的化学变化。运动生物化学的实验方法基本上是化学的方法，用定量及定性的分析方法来观察机体内物质代谢的规律，所以实验时必须做到定性的洁净及定量的精确，因此实验取样要准确、样品要无污染。对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。配制各种浓度的CuSO4溶液，然后在780nm波长下比色，测定各种浓度的CuSO4溶液吸光度值，并制作曲线图。三、实验器材试管、CuSO4溶液、蒸馏水、721分光光度计、移液管、吸耳球等。四、实验步骤（一）玻璃仪器的清洗。（二）使用移液管的移液操作及721分光光度计的使用。取4支大试管，编号，按表7-1进行操作：表7-1 CuSO4溶液的测定 空白管试管1试管2试管3CuSO4溶液(ml)01.02.03.0蒸馏水(ml)4.03.02.01.0充分混匀后，以空白管调零，780nm波长比色以CuSO4溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，将3种不同浓度的CuSO4溶液的光密度值分别点在坐标纸上，通过3点绘制成曲线图，并对实验结果进行分析。五、注意事项（一）玻璃仪器清洗后注意检查，管壁不能留有水珠。（二）使用移液管吸取液体时一定要缓慢平稳，不要太快、太猛。六、作业与思考（一）玻璃仪器的清洗有哪些基本要求？  实验二   血红蛋白的测定血红蛋白（Hb）是红细胞中的一种重要蛋白质，1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。Hb的主要生理功能是运输氧气（O2）、二氧化碳（CO2）和对酸性物质（H+）起缓冲作用，参与体内的酸碱平衡调节。运动时机体需氧增加，故血红蛋白增加，有利于为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO2，而且也能起中和酸性的作用。如果血红蛋白下降，氧供应减少，影响运动能力。运动员安静时血红蛋白值与正常人没有明显差异。一般人Hb的正常值男性为120-160g/L；女性110-150g/L。临床上常用判断贫血的标准，即成年男性低于120g/L；成年女性低于110g/L；而14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120g/L作为贫血。 血红蛋白的含量与运动员的身体机能状态、训练水平、运动负荷等关系密切，因此血红蛋白的含量高低直接影响运动员的身体机能和运动能力，尤其对耐力运动员的专项素质能力。运动员在大运动量开始时，血红蛋白浓度出现明显下降，经过一段时间训练后，运动员身体机能逐渐适应大运动量训练，血红蛋白逐渐回升。若训练一个阶段后Hb水平仍未回升或还有继续下降的趋势，应及时注意调整运动量，并加强营养补充。因此，定期测定Hb的含量，有助于了解运动员的对负荷的适应、身体机能水平及营养状态等情况。一、实验目的（一）学习取微量血的方法及血样的处理。（二）掌握血红蛋白的测定方法。（三）掌握运动训练中血红蛋白指标应用的评价及价值。（四）巩固721分光光度计的使用方法。二、实验原理（高铁氰化钾法）血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氰离子结合成棕红色氰化高铁血红蛋白。氰化高铁血红蛋白在540nm处有一个吸收峰，通过比色可以测定其光密度值，从而计算出血红蛋白浓度。氰化高铁血红蛋白测定法是国际血液学标准化学委员会确定的检测血红蛋白含量的标准方法。三、实验器材（一）氰化高铁血红蛋白稀释液：高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g、磷酸二氢钾0.12g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml，置于棕色瓶中，瓶口塞紧后保存于冷暗处或冰箱，注意不能冷冻，至少可稳定1个月。（二）氰化高铁血红蛋白标准液：（试剂盒）。（三）95%酒精、75%酒精。（四）一次性采血针、吸血管、棉球、试管、移液管、吸耳球、721分光光度计等。四、实验步骤  取3支大试管编号，按表7-2进行操作。  表7-2 血红蛋白的测定 空白管标准管测定管氰化高铁血红蛋白稀释液(ml)5.05.05.0新鲜手指血(ml)——0.02氰化高铁血红蛋白标准液(ml)—0.02—充分混匀后，放置3min，以空白管调零，在540nm波长处比色，读取测定管及标准管光密度OD值对实验结果进行计算，并分析讨论。  血红蛋白（g%）＝OD测／OD标×C标五、注意事项（一）试剂含有氰化物，为剧毒药品，配制和保存时必须严格注意安全。实验后一定要洗手，并注意药品的处理，不能乱倒。（二）取血部位对血红蛋白测定结果有很大影响，最好取手指血测定血红蛋白。同时，取血时注意擦干、消毒采血部位，用自然流出的第二滴血。最好固定采血部位。（三）一次性采血针应一人一针，严防交叉感染。六、作业与思考 （一）运动训练对血红蛋白含量有何影响？（二）在训练周期中如何运用血红蛋白指标来评定？  实验三   血尿素的测定尿素是体内蛋白质、氨基酸分解代谢的终产物。体内蛋白质和氨基酸分解代谢产生氨，氨代谢的主要去路是在肝脏合成尿素后释放进入血液，然后经血液循环至肾脏排出体外。正常生理活动时，尿素的生成和排泄处于平衡状态，使血尿素浓度保持相对稳定。正常人血尿素安静值为3.2～7.0mmol/L。运动员的安静值与普通人一致。一般在30min以内运动时，血尿素变化不大，超过30min以上的运动蛋白质和氨基酸分解代谢加强参与供能，尿素生成增多，血尿素含量也较明显增加。身体对运动负荷的适应性越差，运动时生成的尿素就越多。在训练期可每天或隔天、或大运动量训练后次日晨测定血尿素，来评定运动员身体机能状况；也可测定每周一晨的血尿素以了解机体的恢复情况。所以，血尿素氮可作为评定运动负荷量、机能状况及机体疲劳程度的重要指标。一、实验目的（一）学习血尿素氮的测定方法，熟练微量血的采集技术。（二）掌握血尿素氮指标在运动实践中的应用。（三）学习离心机的使用方法。二、实验原理在强酸性的条件下，去蛋白血滤液中的尿素与二乙酰一肟和硫氨脲共热，生成粉红色的二嗪化衍生物，其颜色深浅在一定范围内与尿素含量成正比，通过与同样处理的尿素氮标准溶液比色，可求出血尿素氮的含量。三、实验器材（一）1%氟化钠溶液。（二）10%三氯乙酸溶液。（三）二乙酰一肟-硫氨脲溶液：称取二乙酰一肟600mg，硫氨脲30mg，加蒸馏水溶解并加至100mL，置棕色瓶中，冰箱保存。（四）尿素氮标准贮存液（1mg/mL）：精确称取干燥分析纯尿素0.2143g，用1%H2SO4溶解并稀释100mL，冰箱保存。（五）尿素氮标准应用液（0.01mg/mL）：准确取标准贮存液1mL，加1%H2SO4稀释至100mL。（六）混合酸液：浓磷酸（85%~87%）3.5mL、浓硫酸8mL，慢慢滴加于80mL水中，冷却加水至100mL。（七）空白液：取1份1%NaF液和3份10%的三氯乙酸混合而成。（八）一次性采血针、吸血管、消毒棉球、试管、移液管、吸耳球、水浴箱、离心管、离心机、721分光光度计等。四、实验步骤（一）制备无蛋白血滤液：取2支离心管，按表3-1操作。取指尖血0.02mL，立即置于含1%氟化钠0.48mL的离心管中，加入10%三氯醋酸1.5mL，充分摇匀。立即以3000r/min的转速离心15min，分离血清。表7-3 无蛋白血滤液的制备 离心管1%NaF溶液（ml）0.48新鲜手指血（ml）0.02 立刻摇匀10%三氯乙酸(ml）1.5充分混匀，离心5min（3000r/min），将上清液倒入另一离心管中（二）取3支大试管，标明“空白管”、“标准管”、“测定管”，按表3-2操作。表7-4 血尿素氮的测定 空白管标准管测定管空白液(ml)0.5——尿素氮标准应用液(ml)—0.5—去蛋白血滤液(ml)——0.5二乙酰一肟-硫氨脲溶液(ml)0.50.50.5混合酸液(ml)3.03.03.0充分摇匀后，沸水浴10min，置于流水中冷却至室温，以空白管调零，在500nm波长处比色，读取测定管及标准管光密度OD值对实验结果进行计算，并分析讨论。     五、注意事项（一）沸水浴时间对显色程度影响很大，应该严格控制好水浴时间，以水浴10min为宜。（二）二乙酰一肟硫氨脲溶液不能久置，若有结晶析出应该重新配制。（三）运动实践中利用这一指标评定机能恢复状况时，应分别在运动前、运动后即刻及次日晨取血。若评定一个训练周期情况时，应在周期初始、中间及结束时分别取晨血跟踪测试。（四）血尿素含量超过40mg%时，应将样品稀释后重新测定。六、作业与思考（一）测定血尿素含量有什么实际意义？（二）血尿素含量变化与身体机能有什么关系？（三）如何通过测定血尿素氮浓度控制训练负荷？  实验四   血乳酸的测定乳酸是体内糖无氧酵解的终产物。储存在肌肉中的糖原和葡萄糖，在无氧的条件下分解成乳酸。乳酸经扩散进入血液，称为血乳酸。在正常情况下，乳酸的生成与消除处于动态平衡中，正常人安静时血乳酸浓度保持在1～2mmol/L，运动员血乳酸安静值与正常人无差异，但在比赛前情绪紧张时，运动员的血乳酸安静值有可能出现升高至3mmol/L，这与体内的肾上腺分泌增多有关。剧烈运动时，肌肉内糖的无氧分解加强，血乳酸浓度显著升高。运动时血乳酸浓度的变化与所动用的能量系统有关。以磷酸原系统供能为主的运动，血乳酸生成量较少，血乳酸一般不超过4mmol/L；以糖酵解系统供能为主的运动，血乳酸可达15mmol/L以上；而以有氧氧化系统供能为主的运动，血乳酸在4mmol/L左右。 速度耐力性运动项目的高水平运动员，运动成绩好者，运动后血乳酸最大浓度值也高；耐力性运动项目的运动员，在完成相同亚极量运动负荷时，优秀运动员运动后血乳酸相对较低。根据这一特点可用以评定运动员训练水平或选材。可根据运动后血乳酸的消除速率来评定运动员有氧代谢能力，若恢复速度快，表示有氧代谢能力强。因此，血乳酸含量的测定，对于从事体育工作的人来说是很重要的。一、实验目的（一）掌握血乳酸的测定方法。（二）初步掌握血乳酸的运动生物化学评定方法及意义。（三）学习用掌式血乳酸分析仪测定血乳酸。二、实验原理去蛋白血滤液，加浓硫酸共热，可使乳酸氧化成乙醛，在酮离子存在时，乙醛与对羟基联苯作用生成紫红色复合物，其显色程度与乳酸浓度成正比，故通过比色可以测定其光密度值，从而计算出血液中乳酸的含量。三、实验器材（一）1%氟化钠溶液：1g氟化钠溶液溶于100ml蒸馏水中。（二）10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水中。（三）浓H2SO4（分析纯、比重：1.838）（四）4%CuS04溶液：4gCuS04溶于100ml蒸馏水中。（五）对羟基联苯试剂：将1.5g对羟基联苯溶于10ml的5%NaOH溶液中，待溶解后加水稀释至100ml，冷却后贮存于棕色瓶中。（六）乳酸标准贮存液(1ml含1mg)：称取乳酸锂106.6mg，溶于约10ml水中，加H2SO4（浓）2滴，移至100ml容量瓶，用水稀释至刻度，混匀。置于冰箱保存。（七）乳酸标准应用液(1ml含10µg)：取1ml乳酸标准贮存液，用100ml容量瓶加蒸馏水稀释至刻度即成。此液临用时配制。（八）乳酸空白液：取1%氟化钠溶液和10%三氯乙酸溶液按1∶3体积比混合而成。（九）台式离心机、恒温水浴箱、水浴锅、离心管、721分光光度计、试管、移液管、滴管、吸血管、一次性采血针、消毒棉球、血乳酸分析仪。四、实验步骤（一）制备无蛋白血滤液：取2支离心管，按实验三表7-5操作。表7-5 无蛋白血滤液的制备 离心管1%NaF溶液（ml）0.48新鲜手指血（ml）0.02立刻摇匀10%三氯乙酸(ml）1.5充分混匀，离心5min（3000r/min），将上清液倒入另一离心管中（二）取3支大试管，标明“空白管”、“标准管”、“测定管”，按表7-6操作。表7-6 血乳酸的测定 空白管标准管测定管乳酸空白液（ml）0.50——乳酸标准应用液（ml）—0.50—无蛋白血滤液（ml）——0.504%CuS04溶液（滴）111浓硫酸（ml）试管放于冷水中，各加3ml，边加边摇匀 置沸水浴5min，冷水浴冷却至15ºC以下对羟基联苯溶液（滴）222充分摇匀，置37ºC水浴保温15min，每隔5min振摇一次试管。然后沸水浴90s，用冷水冷却至室温。以空白管调零，在560nm波长处比色，读取测定管及标准管光密度OD值。（三）用掌式血乳酸分析仪测定血乳酸。对实验结果进行计算，并分析讨论。血乳酸（mg%）=OD测/OD标×100血乳酸（mmol/L）=血乳酸（mg%）/9五、注意事项（一）浓硫酸对显色影响很大，必须选用纯净浓硫酸。加浓硫酸时，应把试管放入冷水中，慢慢滴加，要边加边摇匀。浓硫酸有强的氧化性和腐蚀性，使用时要小心。（二）严格控制水浴时保温温度和保温时间，以确保实验结果的准确性。（三）滴加对羟基联苯时，试管应充分冷却，滴加时应滴加在液面上，并立即摇匀，防止附着于管壁上。（四）血乳酸测定时取样时间非常重要，安静值应在早晨起床前安静时采样；运动后血乳酸的测定应根据不同运动项目而定，一般运动强度较低的运动在运动后20s左右取样，中等强度运动在运动后1～6min取样，大强度运动在运动后3～12min取样。在实际测试时，可多选几次采血时间（如1、3、5……分钟）间隔采样。六、作业与思考（一）测定血乳酸时应如何控制采血样的时间？（二）如何运用血乳酸指标监控运动强度？（三）如何运用血乳酸指标评定运动员有氧代谢能力和无氧代谢能力？ 实验五   尿肌酐的测定人体90%肌酸存在于肌肉，而且大部分以磷酸肌酸的形式存在于肌肉中。磷酸肌酸脱去磷酸后生成肌酐，肌酐随尿液排出即为尿肌酐。正常人尿肌酐日排出量相当稳定，成年男子日排出量约1.0～1.8g，女性为0.7～1.0g，不受食物蛋白质含量和尿量的影响。24h每千克体重排出的尿肌酐毫克数称为尿肌酐系数。正常人尿肌酐系数为：男子18~32mg/kg体重，10~25mg/kg体重。运动员尿肌酐系数高于常人，一般为25~40mg/kg体重。不同项目的运动员尿肌酐系数也不同，力量和速度项目运动员，肌肉发达，其尿肌酐系数也高，且尿肌酐的日排出量与运动成绩高度相关。尿肌酐日排出与肌肉中磷酸肌酸和肌酸的含量有关。因此，测定尿肌酐含量可以间接了解骨骼肌中磷酸肌酸的含量。运动员经过一个阶段训练后，尿肌酐系数可能增加，这反映肌肉的磷酸肌酸浓度或肌肉发达程度提高。尿肌酐系数可作为运动员力量素质与速度素质的评定、运动选材、训练效果的指标。一、实验目的（一）学习尿肌酐的测定方法。（二）掌握尿肌酐系数指标的计算及在运动实践中的作用。二、实验原理（碱性苦味酸法）尿中的肌酐在碱性溶液中与苦味酸作用，生成橙红色的苦味酸肌酐复合物，其生成量与肌酐含量成正比，通过比色可以测定尿中肌酐含量。三、实验器材（一）饱和苦味酸溶液：取苦味酸15g，置于大烧杯中，加蒸馏水1000ml，温热助溶，冷后如有结晶析出，表示已达饱和，取上清液备用。 （二）10%的氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠100g，加蒸馏水溶解，冷却用蒸馏水稀释至1000ml。（三）碱性苦味酸溶液：取饱和苦味酸溶液5份，加10%氢氧化钠1份，临用前20min新鲜配制！（四）肌酐标准贮存液(1mg/1mL)：精确称取纯肌酐0.1g，置于100ml容量瓶内，以10%盐酸溶解稀释至刻度。保存于冰箱中。（五）肌酐标准应用液（0.1mg/ml）：精确吸取肌酐标准贮存液10ml，置于100ml容量瓶中，加10%盐酸10ml，再加蒸馏水稀释至刻度。加甲苯或氯仿数滴防腐。此液可存一周以上。（六）试管、移液管、721分光光度计等。四、实验步骤（一）制备稀释尿液（1∶100）：收集受试者24h尿液，混匀后取0.1ml尿液置于大试管中，加9.9ml蒸馏水，摇匀。（二）取3支大试管，标明“空白管”、“标准管”、“测定管”，按表7-7操作。表7-7 尿肌酐的测定 空白管标准管测定管肌酐标准应用液(ml)—0.5—稀释尿液（1∶100）(ml)——510%NaOH溶液(ml)0.20.20.2蒸馏水(ml)5.04.5—碱性苦味酸试剂(ml)111充分摇匀后，放置10min，以空白管调零，在520nm波长处比色，读取测定管及标准管光密度OD值对实验结果进行计算，并分析讨论。      五、注意事项（一）显色反应在10～15min内完成，若时间过长，尿液中其他物质也能与碱性苦味酸起反应而影响结果。（二）若尿液样品浓度过高，应重新稀释尿液，结果乘以稀释倍数即可。（三）肌酐与碱性苦味酸反应所显颜色要渐渐褪色，故宜在半小时内进行比色，读取结果。六、作业与思考（一）如何利用尿肌酐测定来评价运动员有机能？（二）日肌酐排泄量增高，是否能表明尿肌酐系数增高？为什么？ 实验六   尿蛋白的测定尿蛋白是指尿中蛋白质而言，尿蛋白的主要成分是白蛋白。正常人尿内含有微量蛋白质，在2mg%以内，成年人每昼夜排出的总量约10-100mg，偶尔可达150mg。安静状态与，运动员的尿蛋白含量与正常人含量无差别。 由于运动而出现尿中蛋白质增加的现象称为运动性蛋白尿。在体育运动或训练后，尿中蛋白质的排出量可能达到250mg以上。测定运动员运动后尿中蛋白质的数量，可以用来评定运动员体机能状态、运动强度和运动量及恢复情况等。评定一次训练课的运动负荷量时，一般采集晨起安静时尿液与运动后15min的尿液进行比较。若运动量大，尤其是运动强度越大，尿蛋白生成量也越多。而观察身体机能状况及身体恢复情况，要采集运动后4h或次日晨尿液进行评定。若运动后4h或次日晨尿蛋白下降至正常值，说明机能已经恢复；若仍处于较高水平，则说明机能尚未恢复。运动性蛋白尿的数量受多种因素的影响，如运动身体机能状态、训练手段、情绪、环境、年龄等，且存在个体差异，因此，在一个训练周期中可进行跟踪测试，根据个体尿蛋白变化规律评定训练负荷、系统监测机体对训练负荷的适应情况。一、实验目的（一）学习尿蛋白的测定方法。（二）掌握尿蛋白指标在运动训练中的应用。（三）学会用尿液分析仪测定尿液中各种指标。二、实验原理（磺基水杨酸比浊法）磺基水杨酸为蛋白沉淀剂。在酸性条件下，含蛋白质的尿液和磺基水杨酸生成不溶性蛋白质盐而呈白色浑浊。在一定范围内，其浑浊度与蛋白质含量成正比，通过与标准蛋白液比较，可粗略求出尿中蛋白质的含量。三、实验器材（一）3%磺基水杨酸溶液：称取磺基水杨酸3g，加蒸馏水溶解并稀释至100ml，溶解后贮棕色瓶备用。（二）不同浓度的标准系列混浊液：自制或购置。（三）移液管、试管、自动尿八项分析仪。四、实验步骤（一）用塑料杯留取尿液。（二）取与标准比浊管口径相同的小试管，加入尿液0.5ml（约10滴），加入3%磺基水杨酸溶液1.5ml，摇匀，放置3min后与系列标准管比浊，即可得出尿蛋白含量。（三）用自动尿液分析仪测定尿蛋白值。五、注意事项（一）正常人安静时本试验呈阴性反应。但尿中盐类结晶较多时也出现假阳性反应，可先加热原尿，使其浑浊消失，再加入磺基水杨酸溶液。（二）标准比浊管在使用前应充分摇匀。六、作业与思考（一）测定运动员尿蛋白排泄量有什么实际意义？（二）在一次大强度运动训练或比赛后，何时取尿比较理想？（三）尿蛋白一次测定值增高，能否肯定其身体机能下降，为什么？ 实验七   温度和pH对酶活性影响实验  酶的催化作用受温度的影响很大。酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行。在其他条件恒定下，酶活性达最大时的温度称此酶的最适温度。低于最适温度，随着温度升高，催化反应速度也会加快；但高于最适温度，随着温度升高，反应速度反而逐渐下降，直至酶蛋白变性失活。人体内大多数酶的最适温度在37℃度左右。 环境pH对酶的催化活性影响显著。在一定条件下，酶活性达最高时的pH值称为该酶的最适pH，每一种酶都有一个最适的pH，此时它的催化反应速度最快。在低于最适pH值时，随着pH值的升高，酶的催化能力也相应升高；高于最适pH值时，随着pH值的升高，酶的活性逐渐下降。不同酶的最适pH不同，如唾液淀粉酶的最适pH为6.6～6.8。酶活性的发挥受许多因素的影响。从安静状态到运动状态，体内物质与能量代谢的速率会随着酶活性的改变而增强，以满足体能需求。激烈运动时，乳酸等大量酸性物质的生成可引起内环境酸化，使酶活性受抑，从而导致肌肉等组织做功能力下降。体内某些酶的活性可随着长期运动训练而发生适应性变化，表现为运动能力提高，对运动员提供的某些营养措施（如补充微量元素，服用碱性运动饮料等）都是基于发挥酶活力的原理。一、实验目的（一）学会测定酶最适pH的方法。（二）学会测定温度对酶活性影响的方法及原理。（三）了解温度及pH对酶活性的影响。二、实验原理唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解成分子大小不同的糊精和麦芽糖，它们遇碘呈现不同颜色。直链淀粉遇碘呈蓝色；糊精按分子大小的顺序遇碘呈蓝色、紫色、暗红色；最小分子量的糊精和麦芽糖遇碘不变色。由于在不同温度和不同pH下，唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉水解的程度不同，可以从酶反应混合物所遇碘所呈现的颜色来判断酶的活性。三、实验器材（一）0.5%淀粉液（以0.3%NaCl的作溶剂）。（二）碘化钾—碘溶液：碘4g，碘化钾16g，加蒸馏水至100ml。棕色瓶保存。（三）pH5.0的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液。（四）pH6.8的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液。（五）pH8.0的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液。（六）试管、烧杯、水浴锅、恒温水浴、移液管、试管架、滤纸、酒精灯等。四、实验步骤（一）制备稀释唾液：用一次性杯取少许唾液。取唾液0.4ml放入烧杯，加水39.6ml，混匀，过滤备用。（二）制备煮沸唾液：取烧杯中的稀释唾液10ml于试管中，沸水浴5min。（三）取六支试管并编号，分别按表7-8、表7-9操作。表7-8 温度对酶活性的影响 1号管2号管3号管0.5%淀粉液（ml）2.02.02.0水浴2min37℃37℃0℃煮沸唾液（ml）1.0——稀释唾液（ml）—1.01.0充分摇匀，水浴20min37℃37℃0℃碘液（滴）111观察并记录各管颜色，判断淀粉水解程度 表7-9 pH对酶活性的影响 4号管5号管6号管pH5.0的缓冲液（ml）3.0——pH6.8的缓冲液（ml）—3.0—pH8.0的缓冲液——3.0 0.5%淀粉液（ml）2.02.02.0稀释唾液（ml）2.02.02.0充分摇匀，同时水浴37℃，水浴15min碘液（滴）111观察并记录各管颜色，判断不同pH对淀粉水解和淀粉酶活性的影响，并确定淀粉的最适pH值。五、注意事项严格控制温度及保温时间。六、作业与思考（一）什么是酶的最适温度？有何实践意义？（二）PH对酶活性有何影响？什么是酶反应的最适pH？ 实验八   血糖的测定正常人血液中的葡萄糖(血糖)含量为4.4~6.6mmol/L（80～120mg/dL），当血糖低于3.8mmol/L时，临床上称为低血糖；血糖高于7.2mmol/L时，临床上称为高血糖；血糖浓度8.8mmol/L为称肾糖尿阈，高于此值时，肾小球滤过的葡萄糖在肾小管不能被全部吸收，糖由尿中排出。饱食或大量食糖后，大量葡萄糖进入血液，使血糖浓度增高，糖原的合成速度也随之增大，但血糖浓度不久即恢复正常值。运动员安静时与普通人血糖正常值无差异，运动时会随运动强度和持续时间出现变化。短时间激烈运动时，主要依靠肌糖原分解供能，血糖供能很少，血糖值变化不大；长时间运动时骨骼肌吸收利用血糖的过程加强、速度加快，血糖有下降现象，但下降程度因人而异。血糖是评定运动耐力素质，监控耐力训练的生化指标之一。一、实验目的（一）了解正常人血液中的血糖含量及其变化。（二）学习血糖定量测定的方法。（三）了解运动训练时血糖的变化。二、实验原理（葡萄糖氧化酶法）葡萄糖能被葡萄糖氧化酶（GOD）氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢，后者与苯酚及4-氨基安替比林在过氧化酶（POD）作用下产生红色醌类化合物，其颜色深浅与葡萄糖浓度成正比。通过比色可以计算出葡萄糖的含量。三、实验器材（一）一次性采血针、吸血管、消毒棉球、移液管，离心管和试管、水浴锅、离心机和721分光光度计。    （二）酶制剂。 （三）1%氟化钠溶液。（四）10%三氯乙酸溶液。（五）0.25%苯甲酸溶液：称取苯甲酸2.5g，加入煮沸的蒸馏水1000ml中，使其成为饱和溶液，冷却后取上清液备用。  （六）0.1%苯酚溶液：用蒸馏水把1%苯酚溶液稀释至0.1%苯酚溶液。（七）酶酚混合液的制备：将0.1%苯酚溶液与等量的酶试剂混合。（八）葡萄糖标准储存液（10mg=1ml）：称取纯无水葡萄糖（预先置80℃烤箱干燥至恒重，移置干燥器内保存）1g，溶解于0.25%苯甲酸溶液80mL中，移置100mL容量瓶中，再加苯甲酸溶液至刻度。 （九）葡萄糖标准应用液（1.0ml=1.0mg）：取葡萄糖标准储备液10mL，置于100mL容量瓶中，加0.25%苯甲酸溶液稀释至刻度。四、实验步骤（一）制备无蛋白血滤液：取3支离心管，标明“运动前”、“运动中”、“运动后”，按表7-10操作。1．运动前取血：取指尖或耳垂血0.02mL，立即置于含1%氟化钠0.48mL的离心管中，加入10%三氯醋酸1.5mL，充分摇匀，注明“运动前”。立即以3000r/min的转速离心15min，分离血清。2．运动中取血：蹬台阶运动，以30次/分的速度连续运动3min后立即取血，方法同上。3．运动后取血：运动后休息15分钟，再次取血，处理方法同上。表7-10 无蛋白血滤液的制备 运动前运动中运动后1%NaF溶液（ml）0.480.480.48新鲜手指血（ml）0.020.020.02立刻摇匀10%三氯乙酸(ml）1.51.51.5充分混匀，离心5min（3000r/min），分别将上清液倒入另外的离心管中（二）取3支大试管按下表7-11进行操作。表7-11 血糖的测定 空白管标准管测定管（前）测定管（中）测定管（后）血清（ml）——0.020.020.02葡萄糖标准应用液（ml）—0.02———酶酚混合液（ml）3.03.03.03.03.0各管摇匀，置于37℃水浴中保温20min，冷却至室温，以空白管调零，在505nm波长处比色，读取测定管及标准管光密度OD值。对实验结果进行计算，并分析讨论。葡萄糖（mg%）=OD测／OD标×100葡萄糖（mmol/L）=葡萄糖（mg%）×0.0555五、注意事项（一）本法不需去除蛋白质，对葡萄糖有特异性，并不受其他糖存在的影响，亦可用于尿糖测定。（二）本法标本用量小，取样时力求准确。（三）应在取血样后30min内分离血清，以避免血糖进行糖酵解等，降低血糖浓度，从而影响血糖的测定。六、作业与思考（一）人体血糖浓度的变化对什么运动项目影响最为明显？  （二）不同强度运动对血糖值有何影响？ 实验九   尿胆原的测定尿胆原是体内血红蛋白分解的产物。在一般情况下，每天由红细胞破坏而释放出来的血红蛋白约8g，经过代谢约产生280mg胆色素，其中有部分代谢产物以尿胆原形式排出体外。一般早晨安静时尿中尿胆原＜2mg%为正常。尿胆原排泄量与肾小管管腔的酸碱度、胆红素形成量和肝功能下降有关。 由于尿胆原的排泄量与血红素形成量有关，运动员在大运动负荷时，体内溶血的增多，尿胆原排出随之增加，因此，在尿胆原增多的同时，应加测血红蛋白指标，观察血红蛋白是否下降。在评定运动员身体机能时，应将血红蛋白和尿胆原两项指标结合运用，以使评定结果更客观、可靠。应用尿胆原进行评定时，可在星期一晨起取耳血测血红蛋白，取尿液测尿胆原，测定值是安静值，可以作为运动值和恢复值的对照。晨安静时尿中尿胆原＜2mg%为正常，说明机体适应训练，疲劳可恢复大运动负荷、机体疲劳或机能下降时，晨尿中尿胆原排泄量会明显增加。当尿胆原在安静状态下高于2mg%，且连续了2～3d，就应注意运动负荷量的调整。大运动量训练后次日晨取血、尿，测定血红蛋白和尿胆原值，并记录主观疲劳感。若血红蛋白稳定、尿胆原变化不大、主诉无疲劳感时，表示身体对运动训练负荷适应；若血红蛋白值下降、尿胆原排出量增多、晨起主诉有疲劳感时，则应减轻训练负荷的强度或负荷量。一、实验目的（一）学习尿胆素原的测定方法。（二）了解尿胆素原指标在运动中的意义。二、实验原理尿液内的尿胆素原在酸性条件下，与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,与其颜色深浅与尿胆素原含量成正比，与人工配制的标准液比色，可求得尿胆原的含量。三、实验器材（一）对二甲氨基苯甲醛。（二）欧氏醛试剂：称取对二甲氨基苯甲醛1.0g，溶解于150ml50%盐酸液中。（三）4%氯化金溶液。（四）10%溴化钠溶液。四、实验步骤（一）人工标准液配制法如下表。 取3只100ml试剂瓶，标号，按表7-12进行操作。表7-12 人工标准液配制 标准液Ⅰ标准液Ⅱ标准液Ⅲ4%氯化金溶液（ml）11110%溴化钠溶液（ml）111蒸馏水（ml）132858相当于尿胆原量（mg%）0.92.48.2（二）尿液预处理：取1只大试管加入新鲜尿液10ml，加无水氯化钙0.4g，混合后过滤，除去可能存在的胆色素。（三）取1只大试管，加尿滤液5ml，欧氏醛试剂1ml，混合后放置5min，使其完全显色，与最接近色度的人工标准比色，以蒸馏水为空白管调零，在520nm波长处比色，读取测定管的光密度OD值。对实验结果进行计算，并分析讨论。尿胆素原mg%=OD测／OD标×C标五、注意事项（一）正常人尿胆原排出量每天波动很大，夜间和上午量少，午后则迅速增加，在午后2～4点达最高峰。留取标本的时间最好在下午2～4时，并记录尿量。（二）尿液标本必须新鲜，以免尿胆原氧化成尿胆素。若测定24h尿胆原，可用有色容器留尿，每100ml加无水碳酸钠5g，并加入纯石油醚或甲苯10ml防腐。 （三）测定尿胆原前不能服用抗生素，以免改变肠道菌群，使尿胆原的产生抑制。六、作业与思考  （一）如何用尿胆原来评定运动员身体机能？ 实验十   运动负荷的综合评定一、实验目的学会用血乳酸、尿蛋白等多项生物化学指标对无氧运动或有氧运动的运动强度、运动负荷等进行综合评定。二、实验原理在运动负荷的评定中，单一生物化学指标难以说明问题，只有多指标的综合评定，才能起到互相补充，扬长避短的作用。一般地说，目前常采用血乳酸、尿蛋白等评定运动负荷强度；采用血红蛋白、血尿素、尿胆原等评定负荷量。评定运动负荷的生物化学指标除了要多项测试，还要进行综合评价，所以不仅要测定运动后的生化指标变化，还要测定运动前的生化指标的量，对运动前后的生化指标相差绝对值进行综合评定。采用不同运动方式运动，机体的主要供能系统有所侧重，运动后各指标的变化也不同。短时间大强度运动（10s以内）基本上依靠磷酸原供能系统供能，运动后血乳酸浓度的变化不太大；运动时间在10s到几十秒钟的大强度运动则主要依靠糖酵解系统供能为主，运动后血乳酸浓度会出现大幅度的升高；而长时间的低、中强度运动以糖和脂肪的有氧氧化为主，运动后血乳酸浓度上升较少。三、实验器材体院实验室现有的简便仪器，如尿液分析仪、血乳酸分析仪等。四、实验步骤将教学班分为若干组，每组5-6人，每组随机抽取2～3人为受试者，其余担任测试工作。例如受试者进行准备活动后，可分别进行3种运动：（1）10s原地快跑；（2）原地高抬腿慢跑3min；（3）3000m以上距离的长跑运动。（一）分别于运动前安静时、运动后3~5min取血，测定血乳酸。（二）运动前安静时和运动后15~20min取尿，测定尿蛋白。将实验结果填入表7-13中。表7-13 运动负荷的综合评定   姓名血乳酸(mmol/L)尿蛋白(mg%)安静运动后3~5min安静运动后15~20min方案一     方案二     方案三     对实验结果进行分析讨论。分析3种运动方式运动后各指标的变化及其原因，进而了解3种不同运动方式的运动强度。五、注意事项注意控制好血乳酸、尿蛋白取样的时间。   实验十一  运动生化指标的综合应用一、实验目的（一）能够综合应用所学的运动生物化学实验知识和技能，去解决一些实际问题。（二）初步了解科研实验的基本要求和程序，提高学生分析问题、解决问题的能力，提高创新的能力。 二、实验原理运动时机体的物质代谢和能量代谢发生变化，导致血、尿、汗和唾液中某些成分发生改变。测定某些生化指标可了解机体的变化规律，从而对运动人体机能做出定性或定量的分析。为了科学地、准确地评定运动人体机能，应采用多个生化指标的综合评定。常用的生化指标有血乳酸、血尿素、血红蛋白、尿蛋白、尿肌酐、血睾酮等。三、实验器材试管、移液管、取血针、721分光光度计、血乳酸分析仪、尿八项分析仪等常用生化仪器。四、实验步骤（一）选题。把学生分成若干个小组，4～6人为一小组，要求每小组自行选一个题目或自拟题目。运用两个或两个以上的生化指标，设计并解决下列运动训练中的实际问题。1．评定运动后的身体机能状况。常采用尿蛋白、血尿素、血红蛋白等评定机能状况。2．评定训练课的负荷安排。采用血红蛋白、血尿素、尿胆原评定负荷量。3．监测比赛的运动强度。常采用血乳酸、尿蛋白、CK等评定运动强度。4．评定训练后的恢复状况。常采用血乳酸、血尿素、尿蛋白等评定。（二）查阅文献资料。了解所选运动项目的供能过程及生化特点；选择两种或两种以上的生化指标，能反映该运动项目训练情况。（三）进行实验设计。根据已学的运动生物化学知识和相关文献资料，每一个学生各自进行实验设计方案。实验设计的内容包括：题目、实验目的、实验对象、运动方式、实验器材、实验观察的生化指标及其测试方法等。（四）实施实验过程及生物化学指标的测定，并对实验结果进行讨论分析。（根据人力、物力和课时的实际情况，可只进行实验设计而不进行具体的实验实施的方式。）（五）以小论文的形式完成实验报告。五、注意事项（一）学生要复习所学的能量供应、运动员机能评定等相关理论知识，在规定的时间内（实验课前一周）完成实验过程的设计，经任课教师审核合格后，才能实施实验。（二）注意各生物化学指标的适宜测试时间。六、作业与思考（一）根据自己的实验设计和实验结果分析，以小论文的形式写一篇实验报告或按设计性实验格式完成实验作业。  参考文献张蕴琨,丁树哲等.运动生物化学实验.北京：高等教育出版社，2006.张蕴琨,丁树哲等.运动生物化学.北京：高等教育出版社，2006.冯连世,李开刚等.运动员机能评定常用生理生化指标方法及应用.北京:人民体育出版社,2002.冯美云等.运动生物化学.北京:人民体育出版社,1999.林文弢等.运动生物化学.北京:人民体育出版社,1999.张爱芳等.生物化学与运动生物化学实验及习题集.北京:北京体育大学出版社,2006. 附                          一、实验室规则及注意事项（一）实验课前应认真预习实验指导，弄清实验目的、原理、操作步骤及注意事项等，有问题及时提出，准备充分后开始实验。 （二）严格按照实验指导的操作规程进行实验，并随时记录实验过程中所观察到的每一现象及实验数据。实验后进行整理、分析，并写出实验报告。（三）杜绝在实验室内嬉戏打闹，大声喧哗。（四）药品架及实验室要保持整洁，保证试剂药品的纯净。试剂用后立即盖好放回原处。移液管不能混用，试剂瓶盖不能盖错。（五）爱护实验仪器设备，注意安全操作，若有损坏仪器或意外事故发生应该立即报告实验指导老师。（六）实验完毕后，清洗整理所用器皿，搞好室内卫生。将废纸、棉球、碎玻璃等杂物倒入污物桶，统一处理。必须切断仪器的电源。二、常用玻璃仪器的使用及清洗方法（一）常用玻璃仪器的使用1．移液管（吸管）移液管或吸管是用来准确地移取一定体积的液体的玻璃仪器。移液管一般有无分度移液管和分度移液管（刻度吸管）两种。其中无分度移液管有1ml、5ml、10ml、20ml、50ml等不同规格，只能量取全容量的溶液。分度移液管有0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml等不同规格，供准确量取液体之用。分度吸管有完全流出式、吹出式和不完全流出式3种。完全流出式分度吸管的使用方法同无分度吸管一样，当吸管内的溶液不能再自动流出时，把容器倾斜约15º，使吸管的尖嘴与器内壁相接触片刻，流出溶液的体积即等于吸管的标准容量；吹出式吸管，管上标有“吹”字样，残留在尖嘴内的溶液，最后应当吹出；不完全流出式吸管，其刻度自上而下排列。使用时溶液流到最下标线即应该停止，流出溶液的体积即为吸管的标准。（1）首先选择与所要量取溶液容量相近的移液管(注：移液管规格要稍大于或等于所要量取的容量)。另外，在加同种试剂于不同试管中、且所取量不同时，应选择一支与最大取液量接近的刻度吸管。注意观察移液管刻度数字的排布。使用时，洗净的移液管要用被吸取的溶液洗涤3次，以除去管内残留的水分。可倒少许溶液于一干净而干燥的小烧杯中，用移液管吸取少量溶液，将移液管横卧转动，使溶液流过管内标线下所有的内壁，然后使管直立将溶液由尖嘴口放出。（2）使用移液管时，一般左手拿洗耳球，右手拇指及中指拿住移液管或吸管的上端标线以上部位，使管下端伸入液面约lcm。不应伸入太深，以免外壁沾有过多液体；也不应伸入太浅，以免液面下降时吸入空气。这时，左手用洗耳球轻轻吸上液体，眼睛注意移液管中液面上升情况，移液管或吸管则随容器中液体的液面下降而下降，以便保持尖嘴在液面下约lcm。当液体上升到刻度标线以上时，迅速用右手食指压紧管口。（3）放下吸耳球，将移液管从液体内取出，靠在盛溶液的容器壁上，然后稍微放松食指，同时轻轻转动移液管(或吸管)，使标线以上的液体流回去。当液面的弯月形最低点与标线相切时，就按紧管口，使液体不再流出。（4）取出移液管移入准备接受液体的容器中，使其出口尖端接触器内壁，让接受容器倾斜而移液管保持直立。松开食指，使液体自然地顺壁流下。（5）待液体全部流尽后约等15秒，取出移液管。移液管尖部位仍留有少量溶液，除特别注明“吹”字的以外，其他移液管尖部位留存的溶液不能吹入接受容器中。2．容量瓶容量瓶又称为量瓶，属于精密量器，带有玻璃磨口塞或塑料塞。颈上有环形标线，表示在所指温度（一般为20℃）下，当液体充满到标线时凹面液体体积与瓶上所注明的体积相等。容量瓶主要用来配制一定体积和一定浓度的溶液，常用的为5ml、10ml、50ml、100ml、500ml、1000ml等不同规格。 容量瓶在洗涤前应先检查其密合性。瓶中加入自来水，盖好瓶塞，左手按住塞子，右手把持住瓶底边缘，把瓶子倒立片刻，观察瓶塞有无漏水现象。如果不漏，将瓶直立，瓶塞转动约180º后，再倒过来试一次。容量瓶应用根细绳把塞子系在瓶颈上，以避免打破塞子。在配制溶液前，应先把称好的固体溶质在烧杯中溶解，然后再把溶液沿着玻璃棒从烧杯中转移到容量瓶中。用蒸馏水洗涤烧杯2~3次，把洗涤液也转移入容量瓶中，以保证溶质全部转移。缓慢地加入蒸馏水，加到接近标线1cm处。等1-2min，使附在瓶上的水流下。然后用滴管加水，直至溶液的弯月面与标线相切为止。加水时，视线平视标线。水充满到标线后，盖好瓶塞。将容量瓶倒转，等气泡上升后，轻轻振荡。 再倒转过来。重复操作多次，就能使瓶中溶液混匀。容量瓶不能加热，热溶液应冷却至室温后，才能注入容量瓶中，否则会造成体积误差。如用容量瓶稀释溶液，则用移液管或吸量管移取一定体积的溶液于容量瓶中，加水至标线，按前述方法混匀溶液。容量瓶不宜长期保存试剂溶液，尤其是碱性溶液，它会侵蚀瓶壁并使瓶塞粘住，无法打开。如配好的溶液需作保存时，应转移至磨口试剂瓶中，不要将容量瓶当作试剂瓶使用。容量瓶使用完毕应立即用水冲洗干净。如长期不用，磨口处应洗净擦干，并用纸片将磨口隔开。3．烧杯烧杯主要用于配制溶液，煮沸、蒸发、浓缩溶液，进行化学反应以及少量物质的制备等，是用硬质玻璃或特硬玻璃制成的。用烧杯加热时不能用火焰直接加热，应垫以石棉网。用烧杯加热液体时，液体量以不超过烧杯容量的1/3为宜。烧杯可选用水浴、油浴或砂浴等加热方式，加热腐蚀性液体时应加盖表面皿。4．试剂瓶试剂瓶用于盛装试剂，有广口瓶、细口瓶和滴瓶三种。每个试剂瓶上都必须贴有标签，标明内存试剂的名称、浓度、纯度等。试剂瓶的瓶塞和滴管不可调换，应保持原配。使用时广口瓶、细口瓶的瓶塞应倒置桌面上。使用滴管取液时，先取出滴管，捏紧胶头，排除空气和液体，再从瓶中吸取适量的液体。不要将溶液吸入胶头，也不要将滴管放置其它地方。5．试管试管常用于定性试验，盛取少量药品，便于操作和观察。试管分为普通试管和硬质试管。普通试管只能用于不加热的实验，或进行沸点不高的溶液实验；硬质试管适用于加热固体。用试管加热时，盛取的液体不应超过1/3，不需加热时不要超过1/2，加热试管内的固体物质时，管口应向下倾斜，以防凝结水回流至试管底部而使试管破裂。试管口不能对向人。振荡试管时用拇指、食指、中指夹持管的上端，用腕力甩动试管底部。（二）常用玻璃仪器的清洗方法1．一般的玻璃仪器（如烧杯、烧瓶等）（1）首先使用烧杯配制好洗衣粉溶液或去污粉，倒入待洗玻璃仪器中。（2）选择适当的刷子，反复刷洗玻璃仪器内、外。（3）刷洗完后，用自来水冲洗干净，再使用少量蒸馏水重复3次冲洗玻璃仪器。（4）检查玻璃仪器是否洗干净，以倒置时，玻璃仪器壁上不带有水珠为准。2．精密或难洗的仪器（如滴定管、移液管、容量瓶、比色管等）：先用自来水冲洗、沥干后，再放入铬酸洗液中浸泡过夜，然后用自来水清洗，最后用蒸馏水冲洗3次。应严格要求玻璃仪器壁上不挂水珠，以免影响所量液体的体积。吸取时还必须用所取溶液润洗2~3次，确保所取溶液浓度不变。 3．洗刷仪器时，应首先将手用肥皂洗净，免得手上的油污物粘附在仪器壁上，增加洗刷的困难。4．玻璃仪器的干燥一般采用自然干燥法，试管洗完后倒置斜插入试管架中，移液管插入移液管架中，如有特殊需要可在烘箱中干燥，但有刻度的玻璃仪器不能在烘箱中干燥。 三、常用生物化学分析方法——分光光度法（721分光光度计）（一）分光光度法的基本原理及使用1．分光光度法的基本原理比色分析也是运动生化中常用的分析方法。朗伯-比尔（La-mbert-Beer）定律是比色分析法的基本原理，这个定律是指有色溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度间的定量关系。分光光度计的基本工作原理是基于物质对光(对光的波长)的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带，所以，当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些波长的光线就会被溶液吸收。在一定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系，即符合比尔定律。    有色物质的显色，是由于它对光线的吸收具有选择性。因为白光实际上是波长在400nm-750nm的电磁波，它是由紫、靛、蓝、绿、黄、橙、红等光混合而成的。当白光通过溶液时，如果溶液对各种波长的光都不吸收，则溶液透明无色；如果溶液对某些波长的光吸收较少而对其它波长的光吸收较多，则溶液呈现这种吸收较少而透过较多的光的颜色。例如，溶液吸收了红光，透过蓝绿光较多，则溶液呈现蓝绿色；吸收了黄色光，而透过蓝色光较多，则溶液呈现蓝色；上述事实说明溶液呈现的颜色是它所吸收光色的互补色，吸收愈多，颜色愈深。2．21型分光光度计的结构 721型分光光度计允许的测定波长范围在360～800nm，其构造比较简单，测定的灵敏度和精密度较高。因此，应用比较广泛。721型分光光度计基本结构示意图如下。         721型分光光度计的仪器，从光源灯发出的连续辐射光线，射到聚光透镜上，会聚后，再经过平面镜转角90°，反射至入射狭缝。由此入射到单色器内，狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上，当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜。光线进入棱镜后，进行色散。色散后回来的光线，再经过准直镜反射，就会聚在出光狭缝上，再通过聚光镜后进入比色杯，光线一部分被吸收，透过的光进入光电管，产生相应的光电流，经放大后在微安表上读出。              3．721型分光光度计的使用方法（1）预热仪器。接通电源，打开电源开关，指示灯亮，打开比色皿暗箱盖，预热20min。 （2）选择波长。转动波长选择旋钮，选择所需的单色光波长。（3）固定灵敏度档。用灵敏度旋钮选择适当的灵敏档。其选择原则是保证能使空白档调到“100”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。（4）调节“0”电位器旋钮使检流计指针在透光率“0”；然后将比色皿暗箱盖合上，使光电管受光，调节“100%”电位器旋钮使检流计指针在透光率“100%”附近。（5）取清洁比色皿，手指捏住比色皿的毛玻璃面，将空白或对照液及测定液分别装入比色皿内，大约占比色皿的3/4容积。比色皿外壁的溶液，必须用软绸布或擦镜纸擦干，然后分别放入比色皿架中，比色皿架位于比色皿暗箱内，它有四个小格，第一小格放空白或对照，后面三格放测定液，放好用比色皿架上的定位夹使比色皿靠在同一面上，减少测定中的误差。（6）测定。拉动比色皿架拉杆使测定液进入光路，此时检流计指针移动，最后停止不动，指针所指的读数即为测定液的读数。检流计上同时刻有按透光率换算的吸光度（光密度）值，一般读取测定液的吸光度。（7）关机。实验结束，切断电源，取出比色皿，洗干净并烘干，用软纸把比色皿座架及暗箱擦干净，盖上比色皿暗箱盖。4．721型分光光度计使用和维护中应注意事项（1）连续使用仪器的时间不应超过2小时，最好是间歇0.5小时后，再继续使用。 当不测定时必须将比色皿暗箱打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。（2）比色皿每次使用完毕后，要用去离子水洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。在日常使用中应注意保护比色皿的透光面，使其不受损坏或产生划痕，以免影响透光率。（3）仪器要防震、防潮、防腐蚀。在日常使用中，应经常注意单色器上的防潮硅胶(在仪器的底部)是否变色，如硅胶的颜色已变红，应立即取出烘干或更换。在移动仪器时，应注意小心轻放。四、样本的采集（一）血液样本的采集1．消毒：用75%的酒精消毒无名指或耳垂，然后以干棉球拭干手指上的酒精。2．刺取血部位：手拿一次性采血针，手的动作幅度不能过大，以免引起别人的胆怯心理。以手腕摆动的力量迅速刺入手指，切口的深浅适度，约2mm左右，稍加挤压血液能流出。3．取血：用干棉球擦去第一滴血，接着进行血样收集。用吸血管尖置于血滴下缘，吸管取水平位并向下略作倾斜，依靠毛细吸血管的虹吸作用吸入血液达所需20µl的刻度。4．校正：用干棉签拭去毛细吸血管表面的血液和吸出多于所需刻度的血液。 5．备吹：将毛细管吸血的一端置于试管的液面以下，用小吸头套住毛细管的另一端。6．加液：轻轻按压吸头，使血液进入液体，并将吸血管反复吸洗三次，以保证采血量的准确。7．混匀：摇匀试管里的血液。（二）尿标本的采集和保存1．新鲜尿液：一般定性试验，用一次性的塑料杯采集清晨尿100ml左右，置于清洁容器中，尽快送检。一般应在取样后2h内完成检测。2．24小时尿液如作定量检查，则应收集24小时尿，其方法如下：上午7时，嘱待测人排尽尿，弃去。从7时到次日上午7时整，嘱待测人将每次排出尿液，一并收集于清洁大容器中。然后，将尿充分混匀后，用量筒量尿液记下，从中取尿100—200ml,置于清洁容器中送检，收集24小时尿时，应加防腐剂，以免微生物生长造成尿化学成分的改变。防腐剂的种类很多，定量检查一般用甲苯比较好，先加少量甲苯于一经消毒液浸泡后用开水清洗过的清洁容器内，在留尿过程中，甲苯会在尿面形成一薄层，防止微生物进入尿中，但如果容器不清洁，或在留完标本后再加甲苯则无效。五、离心技术的原理和操作离心机的种类很多，根据转速不同，可以分为低速离心机、高速离心机和超速离心机，转速少于6000r/min的为低速离心机，低于25000r/min的为高速离心机，超过30000r/min的是超速离心机；根据用途不同，还可以将离心机分为分析离心机和制备离心机。一般实验室装备的离心机其最大转速约为4000r/min左右的台式或落地式离心机。离心机的原理是在离心力场的作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度。其适用微生物菌体、大分子蛋白质、酶反应液或各种提取液，常常是由固相（固形物）与液相组成的悬浮液。（一）一般离心机的使用方法1.离心前：1）将离心机置于平坦和结实的地面或实验台面上。2）检查离心机调整旋钮是否处于“0”位。3）取出所有套管，起动空载的离心机，以检查离心机是否转动平衡。4）检查套管内软垫是否完好，有无其它异物。5）离心管与套管是否匹配。2.平衡：将装有待离心液体的离心管分别放入两个完整的并且配备了橡皮软垫的离心套管之中。置天平两侧配平，向较轻一侧离心套管内用滴管加水，直至平衡。装入离心管中的液体量以距管口1～2cm为宜，以免在离心时液体甩出，失去平衡。3.离心：将已配平的两个套管对称地放置于离心机的离心平台上。盖好上盖，开启电源。调节定时旋纽于所需要的时间（分钟）。缓慢地转动调速旋钮，使指针指向所需的转速。4.离心完毕，将调速旅钮置于“0”位，关闭电源开关，待惯性转动停止后，取出离心管和离心套管。5.离心结束后，倒去离心套管内的平衡用水并将套管倒置于干燥处晾干。（二）使用离心机的注意事项1.离心管的放置：标明离心管的号码，对称性地放置离心管。若试管数量是单数，则取另一只离心管装上等量的自来水，一起对称性的放置，盖上盖子，旋紧盖子的旋钮。2.检查电源开关，插上电源，将转速开关和时间旋钮均调到零。3.离心机启动后，如有不正常噪音或震动，应立即切断电源，分析原因，排除故障。4.在使用过程中，应尽量避免试液洒在机器上面及转头里面，用毕及时清理，擦拭干净。5.离心机运转过程中严禁开盖，严禁用手或其他物体迫使离心机转头停转。六、自动尿八项分析仪（MA－4210）的使用技术 自动尿八项分析仪（MA－4210）是一种半自动分析仪器，用于化验尿液中亚硝酸盐Nit、pH值、葡萄糖Glu、蛋白质Pro、潜血BLD、尿酮体u-KET、胆红素Bil、尿胆原URO。（一）操作步骤1.开启电源，将试剂条支架插入支架槽内，仪器进行自检。2.将标准试纸条放在支架上，进行仪器校准。当标准试纸条测定结果与仪器的规定一致时，即可进行样品测定。3.按开始键，在5s内将浸有尿液的尿八项试纸条放入试纸条支架内，进行测量。4.每个样品测定20s后，仪器自动打印出测量结果。5.测定完毕后，将试纸条支架进行清洗，擦干。6.关闭电源。（二）注意事项1.仪器预热，使其稳定。2.新鲜的尿液在常温下测试。3.测试结束后，将试剂条架用清水冲洗，用软纸擦干。试纸筒盖严，保持试纸条的干燥、防潮。4.试剂条应在有效期内使用。5.浸尿后的试剂带应在“20”以前放在试剂带架上。6.使用干净的取样杯，使用新鲜的尿液。7.试剂带浸入尿样的时间为2秒，所有试剂垫包括参考垫在内全部浸入尿样中。8.仪器使用的最佳湿度是20℃－25℃，室温和尿样最好维持在这个范围。9.尿液中含有维生素C，可以造成葡萄糖和（或）潜血含量低的假象。（三）尿中各指标的正常值及意义　　表7-14 尿中各指标的正常值及意义检测项目正常值应用及意义亚硝酸盐NIT阴性当尿液中有大肠杆菌增殖时，可呈阳性，如膀胱炎、肾盂肾炎等。尿葡萄糖Glu阴性或50mg/dl以下运动员中出现尿糖多数是属于饮食原因或为一过性的。病理性尿糖常见于糖尿病病、甲状腺机能亢进等。尿蛋白PRO阴性或15mg/dl以下尿蛋白的生成量与运动量有关，尤其是运动强度关系密切。运动强度越大，尿蛋白生成量越多。尿潜血BLD阴性或0大运动负荷量、大训练强度都可造成尿潜血的出现，表明机体对训练量不适应，或机体承受负荷量的能力下降。一旦出现阳性时，应及时调整训练量。尿酮体KET阴性或15mg/dl以下测定尿酮体，可以了解糖原消耗和脂肪供能能力的大小，这对了解运动员糖和脂肪代谢情况以及训练程度都有帮助。胆红素BIL阴性一般情况下运动员中较少见。尿胆原URO弱阳性或2mg/dl以下单独使用该指标时，主要用于评定疲劳后机能恢复状态。应结合运用血红蛋白和尿胆原指标来评定运动员机能。PH值6.5－7.0 尿液酸碱度受饮食、药物、疾病的影响较大。