第6章 生物反应器

第6章生物反应器生物加工过程中，细胞培养装置即生物反应器或发酵罐是最重要的的反应设备。顾名思义，生物反应器就是指提供适宜细胞生长和产物形成的各种条件，促进细胞的新陈代谢，在低消耗下获得高产量的一种反应设备。一个优良的发酵罐应具备的条件：结构简单;不易染菌;良好的液体混合性能;较高的传质传热速率;单位时间单位体积的生产能力高;同时还应具有配套而又可靠的检测和控制仪表。对于好气性发酵罐，则要求溶氧系数(KLa)高及传递1kg氧所耗的功率小。 工业生产用的发酵罐趋向大型化，谷氨酸生产罐已达480m3罐；SCP的发酵罐容积已达2600m3；抗生素的发酵罐容积已达400m3，处理废水的生化反应器的容积甚至超过2700m3。另一趋势是自动化。 6.1通风发酵罐一、通用式发酵罐又称机械搅拌通气式发酵罐，使之既有机械搅拌装置，又有压缩空气分布装置的发酵罐。其几何尺寸如下： 1、工作原理是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，提高发酵液的溶解氧。一个好的通用式发酵罐的基本条件：具有适宜的径高比；通常H/D=2～4，罐身长有利于氧的溶解能承受一定压力；水压试验压力为工作压力的1.5倍，即0.38MPa搅拌通风装置要能使气泡分散细碎，气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧，提高氧的利用率具有足够的冷却面积；罐内应抛光，尽量减少死角，使灭菌彻底，避免染菌；搅拌器的轴封应严密，尽量减少泄漏。 2、结构特点发酵罐主要部件包括罐身、搅拌器、轴封、消泡器、联轴器、空气分布器、挡板、冷却装置、人孔及视镜等。1)罐体罐体由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，材料为碳钢或不锈钢。罐体需承受一定压力，通常灭菌的压力为0.25MPa(绝对大气压)。因此，制造完毕，要进行水压试验，压力为0.38MPa，以保证罐体不渗漏。罐顶装有视镜及灯镜、进料管、补料管、排气管、接种管和压力表接管，排气管应尽可能靠近罐顶中心位置。为避免灭菌死角，在罐体上的管路越少越好，如将进料口、补料口和接种口可会为一个接管口。在罐身上有冷却水进出管、进空气管、温度计管和测检仪表接口。 2)搅拌器和搅拌轴其作用一是打碎空气气泡，增加气－液接触界面，以提高气－液间的传质速率；二是为了使发酵液充分混和，液体中的固形物料保持悬浮状态。搅拌器可以使被搅拌的液体产生轴向和径向流动，不同型式的搅拌器产生的两种流向侧重也不相同。对于发酵来讲，希望以径向液流为主，同时兼顾轴向翻动。因此，为了避免气泡在阻力较小的搅拌器中心部位沿着轴周边上升逸出，大多数发酵罐采用圆盘涡轮式搅拌器。叶片有平叶式、弯叶式和箭叶式三种，叶片数量一般为六个，少至三个，多至八个。 各种搅拌器的能力比较：对粉碎气泡而言：平叶>弯叶>剪叶；对混合而言：则相反，即剪叶>弯叶>平叶；对溶氧而言：弯叶比其它2种都大。(a)(b)(c)图6-4常用的涡轮式搅拌器.(a)六平叶；(b)六弯叶；(c)六箭叶 由全部径向流搅拌器向径向流和轴向流组合的搅拌器转变 搅拌叶之间的距离不得小于最小搅拌叶的直径。轴流式搅拌叶的直径约为径流式搅拌叶直径的1.3倍。径流式搅拌叶直径为罐直径的0.3一0.4倍，高效轴流搅拌叶直径为罐直径的0.4一0.65倍。空气分配器位于最底部的搅拌叶之下。 由于变频减速器价格昂贵，目前国内大多数生产规模的发酵罐采用不变速搅拌。目前一些新建的生物制药厂，已采用变速搅拌，它能根据不同发酵阶段对氧的需求不同而调节搅拌转速，节约搅拌所消耗的电能。搅拌轴一般从罐顶伸入罐内(上伸轴)，但对容积大于100m3以上的大型发酵罐，也可采用下伸轴。其好处是使发酵罐重心降低，轴的长度缩短，稳定性提高，传动噪音也可大为减弱，而且罐顶空间可充分用来安装高效的机械消泡器及其它自控部件。当采用下伸轴时，对轴封的要求更为严格，故通常采取双端面轴封，并用灭菌空气来进行防漏和冷却。 3)挡板其作用是为防止发酵液随搅拌器运转而产生旋涡，以提高混合效果。挡板的数量由“全挡板条件”而确定，即在搅拌罐中增加挡板或其它附件时，搅拌功率不再增加，而旋涡基本消失。式中W––挡板宽度，m;D––罐直径，m;mb––挡板数。由于发酵罐内除挡板外，立式冷却蛇管等装置也起一定的挡板作用，因此一般发酵罐中安装4块挡板，挡板宽度为(1/8~1/12)D已足够满足全挡板条件。 4)空气分布器其作用是将无菌空气引入到发酵液中同时初步分散气泡。国内传统发酵罐大多采用单管，且管口向下，但近年来国外发酵罐大都采用环形管。5)冷却装置5m3以下的发酵罐传热装置夹套夹套和蛇管在发酵过程中，细胞呼吸和机械搅拌都将产生一定热量，为了保证发酵在一定温度下进行，必须将这些热量及时移去，因此需要设置冷却装置。5m3以上的发酵罐增设为了增强夹套的传热效果，采用外蛇管作为传热装置。它是把半圆形的型钢或角钢制成螺旋形焊于发酵罐的外壁上面成的 6)消泡器(a)(b)图6-5消泡器的结构.耙式消泡器；直径约为罐径的0.8-0.9，以不妨碍旋转为原则半封闭涡轮消泡器；对上伸轴，因搅拌转速低，其效果不佳；对下伸轴，因单独由罐顶安装，转速可较高，效果好，消沫器直径约为罐径的1/2，叶端速度为12-18m/s。 二、机械搅拌自吸式发酵罐利用机械搅拌的高速旋转而吸入空气的一种发酵罐。它无需其它气源供应压缩空气。最初应用于醋酸发酵，如今已应用于抗生素、维生素、有机酸、酶制剂、酵母等发酵。例如，广东江门甘化工厂采用自吸式发酵罐连续发酵生产药用酵母。1.工作原理转子启动前，液体浸没转子，当电机启动使转子转动时，因转子高速旋转，液体、空气在离心力的作用下，被甩向叶轮(定子)外缘，在转子中心处形成负压，吸入空气。此时，通过导向叶轮而使气液均匀分布甩出，并使空气在循环的发酵液中分裂成细微的气泡，在湍流状态下混合、翻腾、扩散，因此自吸式充气装置在搅拌的同时完成了充气作用。 (罐体)(六叶轮导轮)图6-6机械搅拌自吸式发酵罐.1空气进口；2导轮；3叶轮；4皮带；5搅拌轴；6转子转动方向；7空气进入方向；8空气排出方向 2.结构特点主要由罐体、搅拌器(转子)、导轮(定子)、电机等组成。其关键部件是搅拌器和导轮。导轮的形式有多种，如九叶轮、六叶轮、四叶轮、三叶轮等，叶轮均为空心。3.特点优点是利用机械搅拌的抽吸作用将空气吸入反应器内，达到既通风又搅拌的目的，省去了压缩机。缺点：吸程一般不高，必须采用低阻力高效的空气除菌装置；因空气直接吸入反应器内，不适宜无菌要求较高的发酵；因进罐空气处于负压，因而增加了染菌的机会；因搅拌器转速甚高，对细胞剪切损伤大，不适于对剪切敏感的细胞培养。 三、气升式发酵罐是指利用空气的提升作用而使发酵液循环的一类发酵罐。其最大特点就是没有机械搅拌。是近20年才发展起来的一种新型的发酵罐。气升式发酵罐鼓泡式发酵罐气升环流式发酵罐内循环气升环流式发酵罐外循环气升环流式发酵罐内外循环气升环流式发酵罐 (一）鼓泡式发酵罐是借鼓入空气而提供混合与传质的功率的一种发酵罐，又称为空气搅拌高位反应器。最先的鼓泡式发酵罐结构简单，只是一个从底部鼓入空气的圆筒。后来为了提高传质效果，出现了各种形式的改进型。如多层筛板鼓泡式发酵罐。 图6-7鼓泡式发酵罐1排气口；2人孔；3排料口；4空气入口；5筛板；6降液管多层筛板的作用：在于阻截气泡，使之在多孔板下聚集而形成气层，气体通过多孔板时，又被重新分散为小气泡，这样空气在反应器内经多次聚并与分散，一方面延长了空气与培养液的接触时间，另一方面不断形成新的气液界面，减小了液膜阻力，提高了氧的利用率。特点：结构简单，造价较低，动力消耗少，避免了机械搅拌反应器中轴封不严密造成的杂菌污染，高径比大(6~10:1)。鼓泡发酵罐较适用于粘度低、含固量少、需氧量较低的培养液发酵过程。 （二）气升环流式发酵罐是一类带导流装置的鼓泡式发酵罐。常见的有内循环、外循环和内外循环式气升罐。图6-8气升环流式发酵罐.左：隔板式；中：外循环式；右：内循环式 1、工作原理通入空气的一侧，液体因其平均密度下降而上升，不通空气的一侧因密度大而下降，因而在发酵罐内液体形成环流。这大大强化了氧的传递。2、特点高径比大；能耗低；结构简单；没有轴封；与通用式发酵罐相比，在同样能耗下氧的传递能力高得多；无搅拌剪切对细胞的损伤作用。适用于耗氧量大的各种发酵，尤其对剪切敏感的细胞培养。不适用于高粘度或固含量大的发酵。 3、几何尺寸的影响对内循环气升式反应器，高径比H/Dt一般采用8~12。相同条件下，高径比越大，气泡在反应器内的停留时间越长、气含率越高、罐顶与罐底的压差越大、提升力就越大、循环量越大，因此，氧的传递效率就越高。但是高径比过大，又将延长循环周期和混合时间，导致细胞的缺氧区的停留时间过长，从而影响发酵。A.高径比H/DtB.导流筒与反应器直径比Dr/DtA0的增加，导致液体循环速度的增大，而混合时间则降低。C.导流筒上边缘与液面的距离A0一般Dr/Dt=0.8~0.9时，对气含率、传质系数、混合时间和循环量最有利。 (三)气升罐与通用式发酵罐的比较这是2种最典型的发酵罐，由于通用式发酵罐研究的比较成熟，在实验室、小试、中试和大生产中通常都使用这类发酵罐。但目前也有少数工业生产已开始使用气升罐，如我国周口味精厂已建成100T气升罐用于味精生产。因此，气升罐具有更好的应用前景。两者的主要区别在于：功率消耗气升罐比通用式罐低；单位体积培养液功率消耗：通用式罐包括机械搅拌功率和通气功率2部分，而且前者约占90%；而气升罐只有通气功率，这比通用式罐的总功率要小得多。氧传递速率：单位体积培养液的总功率相同时，气升罐的氧传递速率比通用式罐高。结构：气升罐比通用式罐简单，且没有机械轴封。气升罐对细胞的剪切作用比通用式罐要小得多。 四、喷射自吸式发酵罐是指利用喷射吸气装置吸入空气而进行气液混合的一类发酵罐。图6-9喷射自吸式发酵罐结构 1、工作原理发酵液经泵压送至吸气装置中，收缩段中液体流速迅速增大，形成真空，从而吸入空气，并使气泡分散，与液体混合均匀，从而提高溶氧。2、结构由罐体、循环管、泵和吸气装置组成。关键部件是吸气装置。4、缺点由于空气直接被吸入发酵罐中，不适用于无菌要求较高的发酵。3、优点三相混合与分散良好；溶氧速率高；能耗低；无需提供压缩空气。 厌氧菌的氧化与有机物的还原耦合，因而形成较少的ATP，其细胞得率比需氧菌少许多。6.2厌氧发酵罐由于微生物分为好氧与厌氧两大类，故发酵罐也分为两大类。酒精、啤酒、丙酮、丁醇及乳酸等均是厌氧发酵产品。一、厌氧发酵过程 葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA丁酰CoA乳酸CO2甲酸盐H2乙醛乙醇丙酮异丙醇乙酰乙酰CoACO2CO2乙酰乙酰CoACO2丁醇丁酸草酰乙酸CO2CO2琥珀酸3-羟基丁酮丁二醇乙酸 1、乙醇发酵酵母细菌 2、乳酸发酵同型乳酸发酵异型乳酸发酵仅产生乳酸。同型乳酸发酵菌主要有链球菌属、小球菌属和若干乳酸杆菌属除产生乳酸外，还形成其它副产物。异型发酵菌主要有假丝酵母和若干乳酸杆菌属，其副产物因菌种而异，有的是乙醇和CO2，有的是乙酸和CO2 3、丙酸发酵丙酸杆菌丙酸梭菌能利用葡萄糖和乳酸只能利用乳酸 丙酸杆菌通过丙酸-琥珀酸途径形成丙酸 丙酸梭菌通过丙烯酸途径形成丙酸 二、厌氧发酵罐酵母将糖转化为酒精，欲获得较高的转化率，除满足酵母生长和代谢的必要工艺条件，如pH、温度等外，还应考虑有利于发酵液的排出，设备清洗、维修以及设备制造安装方便等问题。发酵过程不需要供氧，因此厌氧发酵罐与通风发酵罐相比结构简单。下面介绍几种常见的厌氧发酵罐。酒精发酵罐 1、结构罐体：筒体为圆柱形，高径比较小，约1.5~2.0灌顶和罐底：碟形或圆锥内部：冷却蛇管。对小罐：罐外喷淋冷却；大罐：喷淋与蛇管相结合。灌顶：装有人孔、视镜、CO2回收管、进料管、接种管、压力表和测量仪表接口。灌身：取样口和温度计接口。灌底：排污和排料口，常合并。图6-10酒精发酵罐1冷却水入口；2取样口；3压力表；4CO2出口；5喷淋水入口；6料液及酒母入口；7人孔；8冷却水出口；9温度计；10喷淋水收集槽；11喷淋水出口；12发酵液及污水排出口 为了减轻劳动强度，现代酒精发酵罐常在罐内安装水力洗涤装置。水力洗涤器水力喷射洗涤装置图6-11酒精发酵罐水力冲洗装置 水力洗涤器水力喷射洗涤装置是两头弯成一定弧度的洒水管。洒水管上均匀地分布有一定数量的小孔，两头的开口方向相反，借两头相反的喷水作用力使管自动旋转。洒水管为36×3mm，开有4×30个小孔，两头喷嘴口径为9mm。除有水平洒水管外，还有中央垂直喷水管(4~6mm的小孔，孔与水平呈20度角)缺点：水压不大，洗涤不彻底，尤其大罐，适用于小罐。 6.3固体发酵所谓固体发酵是指在湿含量低于90%或不含或很少自由水的固体或含固体颗粒培养基中的发酵。传统的发酵食品、酿酒、制酱、高粱酒、腐乳等都采用固体发酵。但是近十来年，固体发酵又成为了许多产品的一种发酵形式，取得了空前的成果，已广泛应用于生物修复、有毒化合物的降解、农副产品残渣的脱毒、农作物的生物转化、生物制浆及许多生物活性产物的生产，如酶、生物碱、有机酸、生物杀虫剂、表面活性剂、生物燃料、香料等，目前已有300多种化合物已成功应用固体发酵来生产。BiochemicalEngineeringJournal,2003,vol.13,No.2-3 一、固体发酵的特点1、优点对许多生物活性产物而言，固体发酵的产率比液体深层发酵高；固体发酵抗细菌污染能力强：一般细菌在这样低的湿度下难于生长；发酵罐的装料系数比深层液体发酵大；许多微生物在固体培养基中生长得更加良好，而且将分泌更多胞外酶和产物；固体发酵可利用许多农副产品加工业的残渣为原料，从而降低生产成本；从发酵培养基中提取产物所要的溶剂更加少；发酵废物的处理更加简单，由于其湿含量低，可直接干燥作为动物饲料用。 2、缺点物料搅拌困难，因此混合不均匀，导致过程控制困难；因固体物料的传热性质差，导致热传递慢，导致温度难于控制；微生物生长及其它发酵参数难于检测和控制；因湿度低，霉菌及其他丝状真菌较易生长，而不太适合细菌生长，但Xerophiles例外；影响发酵产率的因子目前不像液体发酵一样研究得比较透彻，发酵过程的控制往往依赖于经验和实验结果。 二、固体发酵的基本知识由于固体发酵湿含量比较低，一般细菌难于生长，因此，一般选用丝状真菌、酵母。但目前已有少量细菌的固体发酵培养的报道，如枯草芽孢杆菌固体发酵生产枯草菌溶血素。丝状真菌中主要以藻状菌纲的毛霉Mucor和根霉Rhizopus、子囊菌Aspergillus和Penicillium、担子菌白腐真菌为主。1、合适菌株的筛选影响固体发酵的因素主要有合适菌株的筛选、最适基质的确定和控制参数的优化。 2、合适基质的筛选固体发酵中，基质不仅提供微生物生长的营养，而且还作为微生物细胞生长的载体。固体基质的颗粒大小和湿含量是影响微生物生长和代谢的最主要的2个参数。通常颗粒越小，微生物生长的比表面积就越大，越有利于细胞的生长；但是颗粒太小，导致基质粘结，从而影响微生物的呼吸，最终抑制细胞的生长。随着菌体的生长，颗粒间的空隙将会越来越小。固体发酵的基质主要是农作物及其加工残渣，农作物包括木薯、大豆、甜菜、土豆、高粱等；作物残渣有小麦、谷物的糠及杆，豆类、玉米和谷物的壳或皮，蔗渣，咖啡加工业的残渣(咖啡肉、皮等)，水果加工业残渣，油脂工业的残渣(椰子饼、豆饼)等。 3、发酵参数的优化与控制影响固体发酵的因素：接种量、种龄、接种时培养基的pH、培养温度、除培养基基质外的营养物质(碳源、氮源及无机盐)的补充、湿度和通气量等，其最优化条件需通过实验来确定。细胞生长和代谢过程将会产生大量的热量，导致固体培养基的温度升高，如堆肥中温度高达700C，而且在培养基中还存在一定的温度梯度，如中心温度比表面高30C，同时温度的升高又将蒸发部分湿含量，因此固体发酵过程中温度是非常重的的一个参数。A.温度高温影响菌体生长、孢子形成和萌发、产物的形成；低温同样对微生物的生长和某些生化反应不利。 温度的控制：固体发酵中常通过调节通气速率来控制温度。当温度太低时，减小通气速率促使温度因菌体的呼吸作用而升高；当温度太高时，则相反，增大通气速率。 微生物在潮湿环境下才能生长良好(一般丝状真菌湿度为40~80%，细菌的湿度高达90%)，而且发酵过程中随温度的升高将导致部分湿气蒸发，因此，固体发酵过程中需要不断补充水分。可通过引入湿含量大的空气来达到。B.湿含量过高的湿度将降低基质的多孔性，使氧传递困难；过低湿度，又将影响基质内营养物质的溶解和降低基质的膨胀。 C.氧的传递固体发酵利用的微生物几乎都是好氧性的，因此，氧的传递就特别重要。在实验室和工业化生产中常利用强制通无菌空气和搅拌来达到目的。氧的传递是一个颗粒内的传质过程。它与基质特性(如颗粒的空隙率)和湿含量有关。因此，影响氧的传递速率的因素：空气压力、通气速率、基质的空隙率、料层厚度、基质湿度、反应器的几何尺寸和搅拌转速等。 一般可采用下列措施改善传质状况：采用多孔或纤维状物质作为基质；减小基质厚度；使用多孔浅盘；搅拌物料，或采用转鼓反应器。因此，目前利用较多的是强制通风与搅拌相耦联。 三、固体发酵的发酵罐从上面分析可知，影响固体发酵的关键控制参数是氧的传递、温度和基质的湿含量。它们又相互影响。因此，良好的固体发酵罐必须充分保证这3个参数的控制需求。浅床发酵罐填充床发酵罐转鼓发酵罐气固流化床发酵罐搅拌通气床发酵罐固体发酵罐 浅床发酵罐 填充床发酵罐 自动填充床发酵罐 转筒发酵罐 流化床发酵罐 思考题何谓生物反应器？一个良好的生物反应器应具备什么条件？常见的通风发酵罐有哪些？分别描述它们各自的结构特征及优缺点。通用式发酵罐与气升式发酵罐有何区别？厌氧菌培养的特点是什么？酒精发酵罐为什么没有机械搅拌装置？什么是固体发酵？其有何优缺点？请简述影响固体发酵的因素。几种固体发酵罐有何共同特点？