多发性骨髓瘤相关抗原的免疫学筛选及生物信息学分析论文

　　多发性骨髓瘤相关抗原的免疫学筛选及生物信息学分析论文.freelmunologicalScreeningforMultipleMyeloma-AssociatedAntigensandTheirBioinformaticsAnalysisAbstractThisstudyedtoscreenthecellcDNAexpressionlibraryofmultiplemyelomaHMy2(MMHMy2)byusing“serologicalanalysisofcDNAexpressionlibrary(SEREX)”technique.Theobtained30positiveclonesentsearchtool).Theresultsindicatedthat6knoethyltrasferaseetc.havebeendemonstratedacertainrelationshipor’sformation，progressandprognosis.Thestructuresandfunctionsoftheneinarilyanalyzedandpredictedbymeansofbioinformaticsshoinoacidresiduesrespectivelyhadthefullopenreadingframes(ORF).AlltheneightbelocatedateuchromosomesbutMMSA-1atsexchromosome.MMSA-4ilartotheproteincontrollingthetranscriptionoftumorantigen，MMSA-5mighttakepartincellphagocytosis，MMSA-7mightinactivatedNF-κB，andMMSA-12mightbealymphocyticcytoplasmicprotein.ThespecificityofneinaryanalysisusingCrELISA.Itisconcludedthattumorantigensscreenedbythisstudycanbeusedforearlyimmunologicaldiagnosis，surveillanceofminorresidualfoci，assessmentofprognosis，andpreparationoftumorvaccineandsoon.Keyultiplemyeloma;tumorantigen;SEREX;bioinformatics多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是一种克隆增殖型浆细胞疾病。由于瘤细胞增殖的比例低及多药耐药，虽然高剂量化疗后给予自体移植有效提高了缓解率，但MM的平均生存期仍仅有3-4年［1-3］。因此，新的治疗手段的研究和开发就显得极为重要。随着肿瘤生物治疗的发展，肿瘤疫苗近年来颇受重视［4，5］。建立MM免疫治疗及制备MM疫苗的一个重要前提是要有可作为靶向的肿瘤抗原。筛选鉴定肿瘤抗原的方法主要有两大类：一类是Ｔ细胞克隆技术，一类是“重组表达型cDNA文库的血清学分析法（SEREX）”技术［6］。在过去的几年中，SEREX已被应用于多种肿瘤包括黑色素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌等的抗原研究中，并发现了超过2000余种新抗原，且用SEREX法筛选出的很多肿瘤抗原已被证实与“CTL筛选法”所得的抗原是同一种抗原，能够激发机体产生出肿瘤特异性CTL反应。因此，我们采用SEREX技术筛选了骨髓瘤HMy2细胞cDNA表达文库，并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析，现报道如下。材料和方法材料 骨髓瘤HMy2细胞cDNA表达文库为陈刚博士构建，参见文献7］；生物素化绵羊抗人IgG（H+L）和碱性磷酸酶标记链亲和素（avindin-AP）均购自S-ABC公司；DMF、显色剂NBT／BCIP购自Amersco公司；NC膜购自Osmonics公司；质粒提取试剂盒购自华舜公司；XholⅠ/EcoRⅠ内切酶购自LifeScience公司；蛋白水解酶抑制剂（AEBSF）购自Roche公司，HEPES购自S-ABC公司，OPD购自Amersco公司。所有的血清均从常规医疗诊断过程中得到，贮存于-80℃冰箱中备用，其中正常人30例，急性白血病M2型6例，M4型4例，M5型18例，骨髓瘤8例，非霍奇金淋巴瘤13例，霍奇金淋巴瘤3例。方法将感染有重组λZAP噬菌体的大肠杆菌XL1-BlueMRF’铺于90mmNZY平板，37℃倒置培养6小时至噬斑刚刚可见，将10mmol/LIPTG预先处理的硝酸纤维素膜覆盖于平板上，37℃继续培养10小时。印度墨水标记，取下硝酸纤维素膜，用1%明胶封闭液室温封闭1小时后，置于1∶100稀释的白血病患者血清（预先用大肠杆菌裂解物吸收）中孵育15小时；转移至1∶1000的含10%小牛血清的PBS稀释的生物素化山羊抗人IgG中，脱色摇床上室温慢摇1小时；再转移至1∶400的含10%小牛血清的0.01mol/LTBS稀释的avidin-AP中，脱色摇床上室温慢摇1小时；NC膜浸入显色底物NBT／BCIP溶液，避光反应25分钟观察显色结果。挑取阳性噬菌斑，经过4轮复筛。获得的阳性噬菌体克隆，在ExAssist的作用下，转染宿主XL1-BlueMRF’菌，37℃震荡孵育3小时。65-70℃加热20分钟，1000×g离心10分钟，收集上清，转染大肠杆菌XLOLR；铺于卡那霉素抗性的LB平板；挑取含有噬菌粒pBK-CMV的菌落，37℃震摇过夜；抽提质粒pBK-CMVDNA，然后用EcoRI和XhoI双酶切，加样于1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射读胶仪上观察DNA电泳条带并照相。将阳性克隆的甘油菌菌种送上海基康公司采用ABI3700DNA自动化测序仪进行反应和测序，引物为T3或T7。利用网络的生物信息学资源，在美国国立卫生研究院提供的核苷酸数据库中使用Blastx、Blastxn和Blastp进行同源序列分析；采用Grail和ORFFinder对编码区和读框进行分析；应用BLASTgenome进行染色体定位预测。CrELISA方法参见文献［8］。挑取含噬菌粒MMSAs/pBK-CMV的单菌落，接种于5ml卡那霉素抗性（50μg/ml）LB培养液，37℃振摇培养8小时；2mmol/LIPTG处理，37℃振摇培养4小时；离心样本后重悬于含0.1mmol/LAEBSF的PBS（pH7.2），冰上用超声裂解。离心后取上清溶于0.1mmoo/LHEPES（pH7.2），每孔50μ l包被96孔板后置于37℃2小时；漂洗后每孔加50μl大肠杆菌裂解液吸附后抗血清(空白对照则用PBS)，室温振摇2小时；漂洗后转移至1∶5000稀释羊抗人Ig-AP中，放置1小时；37℃加入OPD底物显色液显色10分钟，在波长490nm的酶标仪读取OD值。结果骨髓瘤cDNA文库本实验初始文库大小为1.5×106个重组子，其中非重组子约占3.6%，重组率为96.4%。cDNA插入片段为0.5-2.5kb，平均大小1.4kb左右。文库扩增后滴度达到3.0×109pfu/ml。免疫筛选骨髓瘤HMy2细胞cDNA表达文库本实验对大约1.0×106个克隆进行筛选，进行4轮血清学筛选得到30个阳性克隆(图1)。30个阳性克隆全部剪切成功，获得含有噬菌粒pBK-CMV的单一细菌克隆。提取噬菌粒pBK-CMVDNA，用XholⅠ／EcoRⅠ双酶切后电泳分析cDNA插入片段的大小为0.5-2.5kb之间(图2)。核苷酸序列测定及生物信息学分析将得到的30个阳性克隆全部进行测序，经BLAST同源序列比对分析，共获得已知基因6条，骨髓瘤相关肿瘤抗原新基因12条，并对部分序列进行EST拼接。所获得的新基因全部登陆GenBank。生物信息学分析结果见表1，2和3。初步分析提示：其中MMSA-3、MMSA-8和MMSA-11有完整的编码区，编码的蛋白长度分别为215、160和122个氨基酸；除MMSA-1可能定位于性染色体，其余均可能定位于常染色体；MMSA-4与AK130847同源性高，和控制转录的肿瘤蛋白高度相似；MMSA-5与NM-015033同源性高，可能参与细胞的吞噬作用；MMSA-7与AF080157同源性高，可能使NF-κB失活；MMSA-12与BC007673同源性高，可能为淋巴细胞的胞质蛋白。Table1.KnomunoscreeningofmyelomacDNAexpressionlibrarymunoscreeningofmyelomacDNAexpressionlibraryatics（略）多种抗原的特异性CrELISA法检测多种抗原与各种血清的反应表明，所测OD值中MMSA-3和MMSA-7等新基因较高（表4）。Table4.MMSAsreactingnormaldonorsandpatientsatologicalmalignancies（略）讨论 应用SEREX技术筛选肿瘤抗原，目的在于发现新的肿瘤标志物并以之作为肿瘤早期免疫学诊断及肿瘤疫苗研制的候选靶位。与经典的SEREX法不同，我们采用了细胞株而不是新鲜肿瘤标本构建cDNA文库。由于细胞株有着相对单一的转录本，因此更具有代表性。我们构建的骨髓瘤HMy2细胞cDNA表达文库，原始库容量为1.58×106，其重组率为96.4%，文库扩增之后的滴度达到3.0×109pfu/ml，完全满足对cDNA文库库容的基本要求［7］。免疫筛选cDNA文库产生假阳性的一个通常原因是抗血清含有能与E.coli细菌蛋白结合的IgG组分［6，9］，筛选文库时会出现高背景而无法辨认的假阳性信号，为此我们对抗血清进行了吸收纯化。应用SEREX技术筛选肿瘤抗原，选用何种来源的抗血清进行筛选是非常重要的。多种文献报道［10-12］选用患者的混合血清，这样虽然增加了筛选到阳性克隆的可能，但同时也使假阳性率升高了。在此，我们选用多个骨髓瘤患者血清筛选所构建的HMy2细胞cDNA表达文库，这样既避免同种异体间的交叉反应，也在一定程度上提高抗体识别的特异性。SEREX技术是对E.coli中的构建肿瘤细胞的cDNA表达文库进行筛选的，通常能筛选到较多的阳性克隆。其筛选出的抗原分子编码序列很多是全长cDNA，而且能诱导更全面的包括细胞免疫和体液免疫的免疫应答，且不容易导致肿瘤抗原变异丢失［13，14］。在本研究中，对所构建的文库经过4轮筛选，共得到30个阳性克隆，经测序分析并在GenBank中进行同源性比较，这30个阳性克隆分别代表了18个独立的cDNA插入片段(抗原基因)。其中有6个基因与GenBank中已知基因有高同源性，如环指蛋白167、KLF10因子、TPT1蛋白、p02蛋白、cDNAFLJ46859fis、DNMT1甲基转移酶等。这些基因与肿瘤的形成、发展与预后有一定的关系，已有的研究报道表明，KLF10调节细胞生长、分化与凋亡，可能作为一个候选抑癌基因起作用［15，16］；TPT1为肿瘤翻译控制蛋白［17］；p02最先发现于肝癌，为肿瘤相关抗原；DNMT1甲基转移酶影响细胞的形态和黏附，与多种肿瘤的生长调节机制有关［18-21］，这些基因在骨髓瘤中还是首次分离出，可能在骨髓瘤细胞增殖与成瘤中起一定的作用。此外，根据现有的资料推测，还有12个基因是新基因。它们与骨髓瘤有何相关性，在骨髓瘤或其它肿瘤的发生、发展中起着什么样的作用，都有待于进一步的研究揭示。利用生物信息学对新基因结构和功能进行了初步分析和预测，其中MMSA-3、MMSA-8和MMSA-11有完整的编码区，编码的蛋白长度分别为215、160和122个氨基酸；除MMSA-1可能定位于性染色体，其余均可能定位于常染色体。MMSA-4和控制转录的肿瘤蛋白高度相似；MMSA-5可能参与细胞的吞噬作用；NF-κB是促进MM细胞生长、存活和耐药的重要因子［22］，而MMSA-7可能使NF-κ B失活；MMSA-12可能为淋巴细胞的胞质蛋白。CrELISA法是德国zlemTreci等人发明的一种快速简便的酶联免疫方法，大规模样本分析中无需对每个抗原进行克隆、表达和纯化［7］。CrELISA提供了一种快速评价多种抗原的高通量程序，适用于对SEREX法筛选得到抗原的特异性作进一步分析。依据所测OD值初步判断，MMSA-3和MMSA-7等新基因有可能作为检测肿瘤恶性程度的指标，并可能成为骨髓瘤疫苗的候选靶分子。综上所述，本研究中利用SEREX法筛选出骨髓瘤肿瘤新抗原12条，有望用于肿瘤临床诊断、大范围人群血清学调查、残留病灶监测、判断预后及临床疗效监测等。此外，通过生物信息学分析，对新抗原基本结构功能作了初步预测，这有助于研究骨髓瘤生物学特征、发病机制及免疫逃逸机理。随着对骨髓瘤相关抗原研究的不断深入，我们将继续对候选的肿瘤抗原的表达、分布及染色体定位等进行研究，进一步开发新的高效价骨髓瘤疫苗，为骨髓瘤的治疗寻求有效途径。【