添加水铁矿对水稻土n2o释放及反硝化微生物的影响

添加水铁矿对水稻土N2O释放及反硝化微生物的影响*国家自然科学基金项目（41501277，41330856）和中国科学院战略性先导科技专项（XDB15020200）资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（41501277，41330856）andSpecialFundsforStrategicPilotSci-techProjectsoftheChineseAcademyofSciences（XDB15020200）王庆1,2杨会翠1,2王玲1,2秦红灵1张文钊1盛荣1魏文学1†通讯作者，E-mail:wenxuewei@isa.ac.cn作者简介：王庆，硕士研究生，主要从事土壤微生物分子生态方向研究，E-mail:wangqing187@sina.cn收稿日期：；收到修改稿日期：（1中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙410125）(2中国科学院大学，北京100049)摘要水稻土氧化还原状态的变化与N2O的释放有密切关系。为揭示水稻土中Fe对N2O释放及反硝化功能微生物的影响，本研究选取第四纪红壤发育的水稻土，设置3个水铁矿添加水平（Fe0,10,40μmolg-1土）和两个土壤质量含水量（50%,80%）进行土壤培养试验，利用实时荧光定量PCR(RealTimeFlourescentQuantificationPolymeraseChainReaction,qPCR)和末端限制性片段长度多态性(Terminal-RestrictedFragmentLengthPolymorphism,T-RFLP）分析技术开展研究。结果表明，N2O排放速率升至高峰期的过程中，外源铁处理尤其是添加高量铁(40μmolg-1)处理导致硝态氮含量显著高于对照，而N2O排放速率却明显低于对照；然而，高峰期后添加高量铁处理却维持了比对照显著高的N2O排放速率；与此同时，添加水铁矿对硝酸还原酶基因（narG）和氧化亚氮还原酶基因（nosZ）丰度的影响表现出与N2O排放相同的趋势，即N2O排放速率升至高峰期的过程中，外源铁处理明显抑制了反硝化微生物的生长与繁殖，而高峰期后外源铁对反硝化微生物的抑制作用不明显。因此，水稻土中添加Fe（Ⅲ）对N2O释放影响的主要原因可能是前期抑制了反硝化功能微生物的种群数量，从而减少了硝酸根的还原和N2O的产生，而后期由于反硝化微生物数量的恢复和NO3-等含氮化合物的残留，使得外源铁处理的N2O释放量明显高于对照。关键词水稻土；铁；N2O；narG基因；nosZ基因中图分类号S154.36文献标识码A氧化亚氮（N2O）是《京都议定书》规定的三种主要温室气体之一，它能吸收中心波长为7.78、8.56和16.98μm的长波红外辐射，导致全球气候变暖。同时，N2O在平流层中经太阳紫外光照射分解成NO后与臭氧分子反应，导致臭氧含量降低，从而破坏平流层中的臭氧层[1]。近年来，由于人类活动频繁，导致大气中N2O浓度正以每年0.2%~0.3%的速度不断增加[2-3]，其所带来的环境问题也日益凸显，逐渐受到人们的广泛关注。农业土壤是N2O排放的重要源头之一，每年因施用化学氮肥产生约1.5×107tN2O-N,占人类活动向大气输入N2O-N量的44%[4]。中国是水稻生产大国，截止2007年，我国稻田面积约2892万公顷，占全国作物种植面积的18.84%[5]。而水稻生产过程中干湿交替可显著促进土壤N2O的排放[6-8]。有研究表明，当土壤水分含量在60%~90%孔隙充水度（WaterFilledPoreSpace，WFPS）时，N2O释放量明显增加，当含水量达到80~90%WFPS时，N2O的排放达到高峰[9-11]。然而，目前对水稻土干湿交替过程中影响N2O产生的生物和非生物学机制的认识十分有限。 水稻土中N2O主要来自反硝化过程[12]，而该过程是由多种微生物驱动，且受不同环境因素的影响，如温度、Eh、水分、O2等[13]。研究发现，在水稻土淹水落干过程中，N2O的排放与土壤Eh呈极显著正相关[6-8]。但Eh改变与土壤中的氧化还原物质（O2、Fe、Mn等）的含量和形态变化可能存在密切关系。作为地壳中含量第四的铁元素，也是红壤中重要的氧化还原物质之一[14]，其地球化学丰度为5.1%[15]，铁因在土壤中能形成各种形态的矿物相而具有氧化/还原，吸附/解吸、催化等各种功能[16]。由于铁具有较高的地球化学活性，Fe（Ⅱ）和Fe（Ⅲ）组成的铁循环与反硝化、厌氧氨氧化等多种氮素转化过程密切相关[17-19]。2009年，Huang等[20]通过向泥浆中添加水铁矿的试验发现，铁可刺激N2O的产生。2011年，Zhu等[21]的研究结果表明，铁与土壤的其他特性相比，在调控N2O排放中占有重要的地位。然而，水稻土水分含量变化条件下铁影响N2O产生的微生物过程机理的研究较少。本研究旨在通过添加水铁矿探究外源Fe（Ⅲ）对水稻土N2O的释放以及反硝化微生物丰度和群落结构的影响，为我国农田温室气体减排和提高氮肥利用效率提供重要的理论依据。1材料与方法1.1供试土壤土壤样品采集于长沙市黄花镇（28°14′08″N，113°13′05″E），为第四纪红壤发育形成的水稻土。采样时间为2013年11月。采用随机多点采样法，取0~20cm的耕作土壤，样品自然风干后，去除石块和植物残渣，磨碎过1mm筛，保存备用。土壤基本理化性质见表1。表1供试土壤基本理化性质Table1Basicphysicalandchemicalpropertiesofthesoiltested土壤类型Soiltype（国际制）有机质Organicmatter（gkg-1）总氮TotalN（gkg-1）有效铁AvailableFe（mgkg-1）pHNH4+-N（mgkg-1）NO3--N（mgkg-1）DOC（mgkg-1）黏土27.01.743.24.5111.55.216.01.2水铁矿的制备水铁矿的制备方法主要参照Schwertman等[22]，并做适当修改，其具体制作方法如下：配置0.4molL-1的FeCl3溶液，用1molL-1的NaOH调至pH为7，然后用10倍体积的蒸馏水洗涤、离心（10000g，10min）5次，目的是去除盐离子，洗涤结束后，冷冻干燥并以固体形式保存在不透明的玻璃瓶中。用原子吸收分光光度法测定出水铁矿中有效铁的含量为49%。1.3培养试验和样品采集测定培养试验采用的培养装置为具有密封性好的圆柱形塑料盒（体积1L），部分塑料盒的盒盖安装三通阀后作为采气装置。土壤含水量设置为50%、80%质量含水量，在此基础上设3个外源水铁矿添加量处理，分别添加Fe0μmolg-1（对照/CK），10μmolg-1（低铁/Fe1），40μmolg-1（高铁/Fe2）。水铁矿的添加方法为：按Fe0μmolg-1，10μmolg-1，40μmolg-1分别添加到风干土中并充分混匀后分装到塑料盒中，每盒装土200g，共装102盒。将各铁处理均分成2组，分别添加0.1molL-1的KNO3水溶液，使质量含水量达到50%和80%的同时保证加N量为1.6μmolg-1土。每个处理5盒用于气体采集，12盒用于土壤样品采集。土壤置于28℃下培养，采用称重法定时补充水分。 培养试验从加入KNO3溶液后开始计时，分别于培养的第6h、12h、18h和24h采集气体，每个处理采5盒作为重复，每次采气前通风30min使盒内气体浓度与空气中一致，密封培养1h后，用注射器将盒内气体充分混匀并采集30ml气体用于N2O浓度的测定。采集气体的同时采集土壤样品，每个处理采3盒作为重复，土样采集方式为破坏性采样，具体方法为用直径为1.5cm的圆孔采样器采集0~2cm土壤样品。采集的土壤样品充分混匀，一部分用锡箔纸包好后立即用液氮速冻，存放于-80℃冰箱用于分子生物学实验；另一部分样品存于4℃冰箱，进行NH4+-N和NO3--N含量的测定。N2O浓度采用气相色谱仪（Agilent7890A，USA）检测；NH4+-N和NO3--N含量采用连续流动分析仪（Flastar5000Analyze，国家）测定。1.4反硝化微生物功能基因丰度测定与群落结构分析土壤DNA提取参照SDS-GITC-PEG法[23]。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA片段大小，用NanodropND-1000核酸分析仪测定DNA的浓度及质量。实时定量PCR：实时定量PCR所用仪器为ABI7900(AppliedBiosystem)，narG和nosZ的反应体系为：5ngDNA模板，0.3μl上游引物（narG-571F[24]，nosZ-1126F[25]），0.3μl下游引物（narG-773R，nosZ-1381R），5μlSYBR-GreenⅡ（Takara），0.2μlRox参比染料（Takara），补充ddH2O至10μl。narG和nosZ的扩增片段长度分别为256bp[24]、203bp[25]，扩增程序相同：95℃预变性30s，95℃5s，60℃30s，72℃10s，40个循环；95℃15s，60℃15s，90℃15s。T-RFLP：narG基因反应体系为50μl：上下游引物各2μl（145F，773R）[24]，25μlPCRmix，DNA模板80ng，补充ddH2O至50μl。反应程序为：95℃预变性5min；95℃30s，60℃45s，72℃45s，2个循环；95℃30s，55℃45s，72℃45s，5个循环；95℃30s，52℃45s，72℃45s，5个循环；95℃30s，52℃45s，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。nosZ基因反应体系为50μl：上下游引物各2μl（2002F，2002R）[25]，25μlPCRmix，DNA模板80ng，补充ddH2O至50μl。反应程序为：94℃2min；94℃30s，65℃45s，72℃45s，10个循环；94℃30s，55℃45s，72℃45s，30个循环；72℃延伸10min。narG和nosZ的扩增片段长度分别为629bp[24]、707bp[25]。其中narG和nosZ上游引物的5’端均被羧基荧光素FAM标记。所使用的PCR仪器为Eppendorf-6321。PCR产物先经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，然后通过DNA凝胶纯化试剂盒(天根)回收纯化目的片段，回收的目的片段进行酶切，其中narG基因使用HhaI酶，nosZ基因使用CfoI酶，酶切产物送往上海桑尼生物科技有限公司进行T-RFLP分析，分析仪器为ABIPrism3100GeneticAnalyzer。1.5数据处理采用SPSS20.0统计软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，差异显著性水平通过新复极差法(Duncan法)和最小显著差数法(LSD)进行检验，偏相关法分析相关关系。2结果2.1两个水分条件下外源铁处理对硝态氮和铵态氮含量的影响硝态氮含量变化显示（图1A），随培养时间的延长，两个水分含量土壤中NO3--N含量均迅速降低，含水量为50%和80%的土壤NO3--N含量分别在培养至18h和12h时低于检测线，表明高含水量土壤NO3--N转化速率更快。含水量为50%的土壤培养至6h，添加铁处理的硝态氮含量均明显高于对照，低铁和高铁处理分别较对照高3.5%（p﹤0.05）和24.6%（p﹤0.01）。到培养12h时，低铁和高铁处理的硝态氮含量分别比对照高35.5%和185.5%（p﹤0.01）。含水量为80%的土壤在培养6h时低水平和高水平加铁处理的NO3--N含量分别比 对照高6.8%和30.84%（p﹤0.01），结果表明，同样培养6h，加铁处理对80%含水量土壤NO3--N含量的影响大于50%含水量土壤。然而，在土壤培养过程中铵态氮含量呈逐渐增加趋势，但不同处理间没有明显差异（图1B）。在培养6h至24h间，含水量50%的土壤平均NH4+-N含量由17.8mgkg-1干土增加至34.6mgkg-1干土左右，增加幅度为94.6%；在80%含水量条件下，则由15.7mgkg-1干土增加到30.2mgkg-1干土，增加幅度为92.3%。铵态氮的增加可能与有机氮的矿化有关，而添加铁处理对铵态氮含量没有明显的影响。图1两个水分条件下外源铁处理中土壤硝态氮（A）和铵态氮（B）含量变化Fig.1ChangesinsoilNO3--N（A）andNH4+-N（B）contentsintreatmentsspikedwithextraneousironrelativetosoilwatercontent.注：不同小写字母表示各时间点三个处理间差异显著性(p<0.05)。下同Note：Differentlowercaselettersmeansignificantdifferencebetweentreatmentsateachtimepoint(p<0.05).Thesamebelow2.2两个水分条件下外源铁处理对N2O释放速率的影响培养试验中N2O释放速率明显受外源铁的影响，且两个不同水分含量的土壤表现出相同趋势（图2）。其主要特点是，经前6h培养，50%和80%含水量土壤的N2O释放速率均很低，尽管如此，外源铁仍然改变了N2O的释放，其中低铁处理（10μmolg-1）的影响相对较小，在土壤水分含量为50%和80%的条件下分别比对照减少5.2%和3.2%，没有显著差异；而添加高铁处理（40μmolg-1）比对照则分别降低36.8%（p﹤0.01）和10.3%（p﹤0.01），达到极显著水平。当培养至12h时，两个水分含量土壤N2O释放速率均达到高峰，其中含水量为50%土壤的释放速率显著高于含水量为80%的土壤，平均约1.8倍，而添加铁处理均降低了N2O释放速率，与对照相比，添加低铁处理在土壤含水量为50%和80%条件下分别降低1.4%和7.4%（p﹤0.01），添加高铁处理则导致N2O释放速率分别下降20.7%（p﹤ 0.01）和24.3%（p﹤0.01），降幅显著大于低铁处理。随培养过程的继续进行，对照和添加低铁处理的土壤N2O释放速率迅速下降，而添加高铁处理的土壤的下降幅度相对较小，且不同水分条件差异较大。含水量为50%的土壤培养到18h时对照和低铁处理的N2O释放速率急剧下降，由12h的265μgg-1h-1左右下降到了4μgg-1h-1左右，与之不同的是高铁处理的降幅明显较小，由12h的215μgg-1h-1下降到了133μgg-1h-1。到培养24h时，高铁处理的N2O释放速率降到了与其它处理相似的水平。相比之下，含水量80%土壤N2O释放速率随培养时间的延长下降明显缓慢，到24h时仍保持较高的N2O释放速率（平均24.0μgg-1h-1），而三个处理的N2O释放速率减少动态表现不尽相同，在12h到24h间，对照匀速下降，平均每小时减少11.3μgg-1h-1；低铁处理在培养到18h时较对照的降幅小，平均每小时减少9.7μgg-1h-1，维持了比对照高的N2O释放速率，但差异不显著。到24h时其N2O释放速率与对照相似。高铁处理表现出明显不同的趋势，从12h到18h，该处理的N2O释放速率不但没有下降，反而有所增加，且显著高于对照和低铁处理。从18h到24h，虽然N2O释放速率快速降低，但到24h时仍然维持28.6μgg-1h-1的释放速率，显著高于对照和低铁处理。图2两个水分条件下外源铁处理中N2O释放速率Fig.2N2Oemissionratesintreatmentsspikedwithextraneousironrelativetosoilwatercontent2.3反硝化基因narG和nosZ丰度变化外源铁对硝酸还原酶基因narG和氧化亚氮还原酶基因nosZ丰度的影响有着比较相似的规律，且两个含水量土壤间也存在一定差异。在土壤含水量为50%的条件下，对照处理的narG的丰度在整个培养过程中基本稳定，约1.6×109~2.0×109之间。而添加铁处理改变了这一状态，尤其是在培养的前12h，加铁处理明显导致narG丰度减少，低铁处理在培养6h和12h分别比对照减少1.0%和18.9%（p﹤0.05），而高铁处理则比对照减少18.8%（p﹤0.05）和65.5%（p﹤0.05）。这种外源铁对含narG微生物数量的抑制作用到培养18h时消除，此时两个加铁处理的narG丰度恢复到对照处理水平，到24h时甚至超过了对照处理。另一反硝化基因nosZ的丰度变化与narG有同样的趋势，在12h时添加低铁和高铁处理的nosZ丰度分别比对照低11.7%（p﹤0.05）和35.6%（p﹤0.05），到培养18h时迅速恢复到与对照相似的水平并保持稳定。当土壤含水量为80%时，对照处理的narG和nosZ的丰度均表现为在整个培养过程中均呈下降趋势，这一现象与反硝化微生物对淹水后的土壤环境适应过程有关。添加铁处理在前12h中显著抑制了含narG和nosZ的反硝化微生物繁殖，其中，在12h时添加低铁和高铁处理分别导致narG丰度比对照处理减少24.0%（p﹤0.05）和50.8%（p﹤0.05），nosZ丰度比对照减少31.9%（p﹤0.05）和34.0%（p﹤0.05）。然而，有趣的是在后续培养中上述反硝化基因丰度得到恢复并保持相对稳定，到培养18h和24h时添加低铁和高铁处理的narG和nosZ丰度都维持在相似水平，并且均显著高于同一时期的对照处理。 图3两个水分条件下外源铁处理中narG（A）和nosZ（B）基因丰度Fig.3AbundancesofnarG（A）andnosZ（B）genesintreatmentsspikedwithextraneousironrelativetosoilwatercontent2.4反硝化基因群落结构变化反硝化基因narG和nosZ的T-RFs（Terminal-RestrictedFragments）相对丰度变化显示（图4），在整个培养试验过程中，含narG和nosZ基因的微生物群落结构基本保持稳定，仅在一些低丰度T-RFs中有小幅度变化，如narG基因中T-RFs相对丰度变化主要体现在223bp和101bp片段上，而nosZ基因中变化主要体现在379bp、321bp及84bp片段上。但各处理中反硝化基因narG和nosZ的优势种群并没有出现显著差异，说明添加外源铁对含narG和nosZ基因的微生物群落结构影响较小。其中12h和18h微生物群落结构与6h相比无明显差异已省略。 图4narG和nosZ基因T-RFs相对丰度Fig.4T-RFsrelativeabundanceofnarGandnosZgenes3讨论本项研究设置了两个水分条件，其中50%质量含水量为适合N2O排放的土壤水分条件，而80%质量含水量为淹水状态。在自然条件下N2O排放很少[26]，其原因主要是受到反硝化底物含量的限制，由于硝化作用弱，NO3--N含量一般处于极低水平，因而少有N2O释放。而当土壤含水量降低至约50%质量含水量时，土壤硝化作用加强，为反硝化作用提供底物，促进了N2O的排放。本研究分别在两个水分条件的土壤中添加同样量的硝酸盐，而在培养第6h和12h，含水量为50%土壤的NO3--N含量显著高于含水量为80%的土壤，与此同时，培养12h时含水量50%的土壤N2O释放速率显著高于80%含水量土壤。上述现象可能表明，在培养开始后的12h内，含水量50%比80%的土壤维持了更高的NO3--N含量，一方面可能土壤有机氮的矿化和硝化作用增强补充部分NO3-有关[27-28]；另一方面，可能因为硝酸还原相对较弱而延缓NO3-的消耗。而在80%（淹水）条件下，由于土壤还原性更强，具备更强的反硝化能力，所以NO3-消耗更快[29]。然而，在淹水土壤中产生的N2O难以释放到大气中，而易被进一步还原成N2[30]，因此其N2O释放速率虽然相对较低但延续的时间长。相比之下，在含水量50%的土壤中氧化亚氮还原酶受到抑制且土壤条件有利于N2O扩散，导致N2O在短时间内高强度排放[31-32]。我们的试验结果还表明，添加不同浓度的水铁矿在两个土壤水分状态下对NO3--N含量和N2O释放速率的影响趋势完全相同，即添加Fe（Ⅲ）明显延缓硝酸根的转化和N2O的释 放，而且添加高量铁比低量铁的效果更为明显。这种现象可能与下列因素有关：首先是添加到土壤中的Fe（Ⅲ）会快速还原成Fe（Ⅱ），在这一还原过程中会与NO3-还原过程竞争电子[33]，所以，添加外源水铁矿会导致硝酸盐还原过程减缓，而且添加的Fe（Ⅲ）越多则效果越明显。另外，水铁矿的加入会导致土壤中氧化还原电位(Eh)值升高，Eh值升高后可能会降低硝酸还原酶的活性，从而减弱反硝化作用，何起利等人在人工湿地中已证明了此发现[34]。除此之外，外源铁对反硝化微生物的影响可能也是重要的原因之一。尽管到目前为止有关外源铁与土壤微生物关系的研究较少。陈娜等人发现外源Fe（Ⅱ）会抑制微生物的活性[35]，Li等人发现水铁矿对地杆菌属和梭菌属的群落结构有强烈的影响[36]。我们的研究发现，在培养12h内，添加水铁矿使反硝化基因narG和nosZ的丰度明显减少，并随培养时间的延长而加重，而且添加高铁处理的影响更显著。然而到16h后这种抑制效果消失，两个反硝化基因的拷贝数迅速恢复或反弹，而且两个添加铁处理间没有显著差异。但不论是添加高铁还是低铁处理对narG和nosZ的组成结构都没有产生明显影响。显然，外源Fe（Ⅲ）的添加抑制了反硝化微生物的生长，可能是减少N2O释放的重要原因，但对其机理的认识并不十分清楚。当Fe（Ⅲ）被添加到高含水量土壤中后，由于微生物代谢过程的电子传递链受到严重干扰，可能对微生物的生长产生抑制作用，添加高水平铁的抑制作用更为明显，而且在淹水条件下这种抑制效果更清楚，可能原因是淹水条件下的电子传递对铁的依赖性更强，在50%含水量的土壤中可能有部分电子通过微量O2的调控。在含水量高的土壤中Fe（Ⅲ）可以快速转化为Fe（Ⅱ），虽然并不清楚Fe（Ⅲ）抑制反硝化微生物的临界浓度，但到培养16h是narG和nosZ基因数量迅速回复或增加说明可能与Fe（Ⅲ）的减少和Fe（Ⅱ）的增加有一定的关系，还需要深入研究。4结论添加外源Fe（Ⅲ）对水稻土N2O的产生与释放过程产生了明显影响。在N2O排放升至高峰期过程中，添加高铁处理显著降低了N2O释放速率，其重要原因可能是外源铁抑制了反硝化微生物的生长与繁殖，从而减少了硝酸根的还原，进而减少N2O的产生；而在N2O排放的高峰期后，由于反硝化功能微生物的数量逐渐恢复和残留的NO3-等含氮化合物相对较多，导致N2O释放量明显高于对照。而外源铁对反硝化微生物群落结构的影响与N2O释放的关系还需进一步研究。参考文献[1]王少彬.大气中氧化亚氮的源、汇和环境效应.环境科学,1994(4):23-27WangSB.TheSource、sinkandenvironmentaleffectsofnitrousoxideintheatmosphere(InChinese).EnvironmentalScience,1994(4):23-27[2]LeuenbergerM,SiegenthalerU.Ice-ageatmosphericconcentrationofnitrousoxidefromanantarcticicecore.Nature,1992,360(6403):449-451[3]PrinnR,CunnoldD,RasmussenR,etal.Atmosphericemissionsandtrendsofnitrousoxidededucedfrom10yearsofale-gaugedata.JournalofGeophysicalResearch-Atmospheres,1990,95(D11):18369-18385[4]张玉铭,胡春胜,张佳宝,等.农田土壤主要温室气体(CO2、CH4、N2O)的源/汇强度及其温室效应研究进展.中国生态农业学报,2011(4):966-975.ZhangYM,HuCS,ZhangJB,etal.Researchadvancesonsource/sinkintensitiesandgreenhouseeffectsofCO2,CH4andN2Oinagriculturalsoils(InChinese).ChineseJournalofEco-Agriculture,2011(4):966-975[5]中国农业年鉴编辑委员会.中国农业年鉴.北京：中国农业出版社,2008ChinaAgricultureYearbookEditorialBoard.CHINAAGRICULTUREYEARBOOK(InChinese).Beijing: ChinaAgriculturePress,2008[6]LiuJ,HouH,ShengR,etal.Denitrifyingcommunitiesdifferentiallyrespondtofloodingdryingcyclesinpaddysoils.AppliedSoilEcology,2012,62:155-162[7]ZouJ,HuangY,QinY,etal.Changesinfertilizer-induceddirectN2Oemissionsfrompaddyfieldsduringrice-growingseasoninchinabetween1950sand1990s.GlobalChangeBiology,2009,15(1):229-242[8]卢静,刘金波,盛荣,等.短期落干对水稻土反硝化微生物丰度和N2O释放的影响.应用生态学报,2014(10):2879-2884.LuJ,LiuJB,ShengR,etal.Effectofshort-timedroughtprocessondenitrifyingbacteriaabundanceandN2Oemissioninpaddysoil(InChinese).ChineseJournalofAppliedEcology2014(10):2879-2884[9]BatemanEJ,BaggsEM.ContributionsofnitrificationanddenitrificationtoN2Oemissionsfromsoilsatdifferentwater-filledporespace.BiologyandFertilityofSoils,2005,41(6):379-388[10]MathieuO,HenaultC,LevequeJ,etal.Quantifyingthecontributionofnitrificationanddenitrificationtothenitrousoxidefluxusingn-15tracers.EnvironPollut,2006,144(3):933-940[11]SkibaU,FowlerD,SmithKA.Nitricoxideemissionsfromagriculturalsoilsintemperateandtropicalclimates:Sources,controlsandmitigationoptions.NutrientCyclinginAgroecosystems,1997,48(1):139-153[12]WrageN,LaufJ,DelPA,etal.DistinguishingsourcesofN2Oineuropeangrasslandsbystableisotopeanalysis.RapidCommunicationsinMassSpectrometry,2004,18(11):1201-1207[13]FreneyJR.Emissionofnitrousoxidefromsoilsusedforagriculture.NutrientCyclinginAgroecosystems,1997,49(1/3):1-6[14]HauckS,BenzM,BruneA,etal.Ferrousironoxidationbydenitrifyingbacteriainprofundalsedimentsofadeeplake(lakeconstance).FEMSMicrobiolEcol,2001,37(2):127-134[15]赵其国.红壤物质循环及其调控.北京：科学出版社,2002ZhaoQG.Redsoilmaterialcycleanditsregulation(InChinese).Beijing:SciencePress,2002[16]BorchT,KretzschmarR,KapplerA,etal.Biogeochemicalredoxprocessesandtheirimpactoncontaminantdynamics.EnvironmentalScience&Technology,2010,44(1):15-23[17]ClementJC,ShresthaJ,EhrenfeldJG,etal.Ammoniumoxidationcoupledtodissimilatoryreductionofironunderanaerobicconditionsinwetlandsoils.SoilBiology&Biochemistry,2005,37(12):2323-2328[18]DavidsonEA,ChoroverJ,DailDB.Amechanismofabioticimmobilizationofnitrateinforestecosystems:Theferrouswheelhypothesis.GlobalChangeBiology,2003,9(2):228-236[19]胡敏,李芳柏.土壤微生物铁循环及其环境意义.土壤学报,2014,51(4):683-698HuM,LiFB.Soilmicrobemediatedironcyclinganditsenvironmentalimplication(InChinese).ActaPedologicaSinica,2014,51(4):683-698[20]HuangB,YuK,GambrellRP.Effectsofferricironreductionandregenerationonnitrousoxideandmethaneemissionsinaricesoil.Chemosphere,2009,74(4):481-486[21]ZhuX,SilvaLC,DoaneTA,etal.Iron:Theforgottendriverofnitrousoxideproductioninagriculturalsoil.PloSOne,2013,8(3):e60146[22]SchwertmannU,CornellRM.IronOxidesintheLaboratoryPrepartionandCharcterization.Weinheim:VCH,1991:69-144.[23]ChenZ,LuoX,HuR,etal.Impactoflong-termfertilizationonthecompositionofdenitrifiercommunitiesbasedonnitritereductaseanalysesinapaddysoil.MicrobEcol,2010,60(4):850-861[24]陈哲.长期施肥对水稻土反硝化作用和反硝化功能微生物的影响机理.长沙:中国科学院亚热带农业 生态研究所,2010ChenZ.Effectoflong-termfertilizationondenitrificationanddenitrifyingmicrobialcommunity(InChinese).Changsha:InstitutionofSubtropicalAgriculture,ChineseAcademyofSciences,2010[25]RöschC,MergelA,BotheH.Biodiversityofdenitrifyinganddinitrogen-fixingbacteriainanacidforestsoil.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2002,68(8):3818-3829[26]YanX,DuL,ShiS,etal.Nitrousoxideemissionfromwetlandricesoilasaffectedbytheapplicationofcontrolled-availabilityfertilizersandmid-seasonaeration.BiologyandFertilityofSoils,2000,32(1):60-66[27]BreuerL,KieseR,Butterbach-BahlK.Temperatureandmoistureeffectsonnitrificationratesintropicalrain-forestsoils.SoilScienceSocietyofAmericaJournal,2002,66(3):834-844[28]GuntinasME,LeirosMC,Trasar-CepedaC,etal.Effectsofmoistureandtemperatureonnetsoilnitrogenmineralization:Alaboratorystudy.EuropeanJournalofSoilBiology,2012,48:73-80[29]江德爱,唐懿达,马益辉,等.不同条件对土壤反硝化作用的影响.环境科学,1989(3):13-19.JiangDA,TangYD,MaYH,etal.Theinfluenceofdifferentconditionsofsoildenitrification.Environme-ntalscience(InChinese),1989(3):13-19.[30]HutschBW,WangXZ,FengK,etal.Nitrousoxideemissionasaffectedbychangesinsoilwatercontentandnitrogenfertilization.JournalofPlantNutritionandSoilScience-ZeitschriftFurPflanzenernahrungUndBodenkunde,1999,162(6):607-613[31]WeierKL,DoranJW,PowerJF,etal.Denitrificationandthedinitrogennitrous-oxideratioasaffectedbysoil-water,availablecarbon,andnitrate.SoilScienceSocietyofAmericaJournal,1993,57(1):66-72[32]石生伟,李玉娥,刘运通,等.中国稻田CH4和N2O排放及减排整合分析.中国农业科学,2010(14):2923-2936ShiSW,LiYE,LiuYT,etal.CH4andN2OEmissionfromRiceFieldandMitigationOptionsBasedonFieldMeasurementsinChina：AnIntegrationAnalysis(InChinese).ScientiaAgriculturaSinica,2010(14):2923-2936[33]ZhangW,LiX,LiuT,etal.Competitivereductionofnitrateandironoxidesbyshewanellaputrefaciens200underanoxicconditions.ColloidsandSurfacesa-PhysicochemicalandEngineeringAspects,2014,445:97-104[34]何起利,梁威,贺锋,等.人工湿地氧化还原特征及其与微生物活性相关性.华中农业大学学报,2007(6):844-849HeQL,LiangW,HeF,etal.CorrelationsbetweentheRedoxPotentialCharacteristicsandMicroorganismsActivitiesintheIntegratedVerticalFlowConstructedWetland(InChinese).JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,2007(6):844-849.[35]陈娜,廖敏,张楠,等.Fe2+对水稻生长及土壤微生物活性的影响.植物营养与肥料学报,2014（3）:651-660ChenN,LiaoM,ZhangN,etal.Effectsofexogenousferrousonricegrowthandsoilmicrobialactivities(inChinese).JournalofPlantNutritionandFertilizer,2014(3):651-660[36]LiHJ,PengJJ,LiHB.DiversityandcharacterizationofpotentialH2-dependentFe（Ⅲ）-reducingbacteriainpaddysoils.Pedosphere,2012,22(5):673-680 EffectofamendingferrihydriteonN2OemissionanddenitrifyingmicroorganismsinpaddysoilWANGQing1,2YANGHuicui1,2WANGLing1,2QINHongling1ZHANGWenzhao1SHENGRong1WEIWenxue1(1InstitutionofSubtropicalAgriculture，ChineseAcademyofSciences，Changsha410125，China)(2UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China)AbstractNitrousoxide(N2O)isanimportantgreenhousegas,whichis298timeshigherthancarbondioxideinGlobalWarmingPotential(GWP)overatimescaleofonehundredyears.Withthewidespreadapplicationofchemicalfertilizersandthepracticeofwatermanagementofalternationofdryingandwetting,paddysoilhasbecomeanimportantsourceofnitrousoxideemissions.Researchesshowthattheprocessofflooding-drainingpaddyfieldscancauseemissionsoflargeamountsofnitrousoxide,andvariationoftheredoxpotentialduringtheprocessiscloselyrelatedtoN2Oemission.Ironisacrucialredoxelementinpaddysoil,butitsinfluenceonN2Oemissionisnotclear.ThestudyisorientedtoexposeimpactsofFeonN2Oemissionanddenitrifyingmicroorganisms.Anin-labsoilincubationexperimentwascarriedoutusingsamplesofthepaddysoilderivedfromthequaternaryredclay.Theexperimentwasdesignedtohavethreelevelsofferrihydriteamendment(Fe0,10and40μmolg-1soil)andtwolevelsofsoilwatercontent(50%and80%).Thesoilsampleswereair-driedandsiftedthrougha1mmsieve.Accordingtothedesigningoftheexperiment,thepretreatedsoilsampleswerefullyblendedwithferrihydrite,separately,putinto1-Lplasticboxes,200gsoilonadryweightbasisineachbox,andthenspikedwithKNO3solutiontoensurethesamples1.6μmolg-1soilinNcontentand50%or80%insoilwatercontent,separately.Theboxesofsoilsampleswereplacedintoanincubator,28℃intemperatureandkepttherefor24h.Airandthesoilsintheboxesweresampledonceevery6hduringtheincubationforanalysisN2OconcentrationintheairsamplewasdeterminedwithaGas-chromatograph.Soilsamplesforphysicalandchemicalanalysiswerestoredat4℃andanalyzedforNH4+-NandNO3--Ncontentswithacontinuousflowanalyzer,whilesoilsamplesformicroorganismanalysiswerequick-frozeninliquidnitrogen,andstoredat-80℃,andthenanalyzedforvariationsofthecommunitiesandpopulationsofsoildenitrifyingmicroorganismswitharealtimeflourescentquantificationpolymerasechainreaction(qPCR)andaterminal-restrictedfragmentlengthpolymorphism(T-RFLP).ResultsshowthatduringtheprocessofN2Oemissionraterisingtoapeak,denitrificationwasobviouslydisturbed.Inthetreatmentsspikedwithextraneousiron,especiallyathighrates(40μmolg-1),nitrateconcentrationsweremuchhigherthaninCK,whileN2Oemissionratesweresignificantlylowerthanincontrol.However,afterthepeak,N2Oemissionratedecreasedmarkedlyinallthetreatments,butitdidmuchmoreslowlyinthetreatmentsspikedwithhighratesofironthaninCKandconsequentlyremainedhigherthanthatinCK.Meanwhile,duringthefirst12hoursofincubation,theabundanceofnitratereductasegene(narG)andnitrousoxidereductasegene(nosZ)variedsignificantly,demonstratingthattheferrihydritespikedapparentlyinhibitedthegrowthofnarG-andnosZ-containingcommunitiesinpopulationsize,andthemoreferrihydritewasaddedandthemoreobviouswastheeffect.However,after12hours,theinhibitioneffectwasnolongersoobvious.Theadditionofextraneousirondidnothavemuchinfluenceonstructureof thedenitrifyingmicroorganismcommunity.SoitisconcludedthattheeffectofFe(Ⅲ)affectingpopulationofthedenitrifyingmicroorganismcommunityisthemaincauseofextraneousFe(Ⅲ)inhibitingN2Oemissionduringtheearlyperiodoftheincubation,andhencenitratereductionandN2Oproduction.Butinthelateperiodoftheincubation,therecoveryofdenitrifyingmicroorganismsinabundanceandtheexistenceofnitrate-containingresidues,likeNO3-,pushestheN2OemissionratehigherinthetreatmentsspikedwithextraneousironthaninCK.KeywordsPaddysoil;Iron;N2O;narG;nosZ