地塞米松的结构改造及对k562细胞增殖抑制的初步研究

'　　地塞米松的结构改造及对K562细胞增殖抑制的初步研究【】目的：通过对地塞米松进行结构改造，探寻具有更高生物活性的新化合物.方法：以地塞米松为原料，通过氧化反应对其侧链进行结构改造，并采用1HNMR，13CNMR及ESIMS对其进行结构表征.通过MTT比色法检测新化合物对K562细胞增殖的影响.结果：地塞米松经氧化反应后，改构为预期的新化合物.新化合物具有抑制K562细胞增殖的生物活性.在5及10mg/L时，抑制率分别为9.64%±0.27%和22.75%±0.35%，高于地塞米松（P<0.01）.结论：地塞米松经结构改造为新化合物.新化合物在低浓度时对K562细胞具有较好的抑制活性.【关键词】地塞米松结构改造细胞增殖　　0引言　　地塞米松为肾上腺皮质激素类药物，具有抗炎、抑制免疫及增强应激反应等药理作用.在肿瘤治疗方面，地塞米松可抑制白血病细胞的增殖［1］，增强化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡［2］或促进细胞分化［3］.同时地塞米松已广泛应用于急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病的诱导缓解和诱导缓解后的治疗［4］.但在临床上大剂量应用地塞米松时的副作用较明显，并有耐药现象的发生.因此，寻找该药物的先导化合物、对药物进行结构改造，是开发毒副作用小、具有更好疗效药物的有效途径之一.为了进一步拓展甾体激素类药物的研究领域，本实验拟通过对地塞米松的氧化，合成并纯化出新的化合物，通过1HNMR，13CNMR及ESI MS对其进行结构表征，并采用MTT比色法对新化合物的生物活性进行初步评价.　　1材料和方法　　1.1材料天津大学精密仪器厂YRT3熔点仪，日本岛津LCMS2010液相色谱－质谱仪，VarianMercuryPlus400MHz超导核磁共振仪（溶剂CD3OD,内标TMS），瑞典Sunrise酶标定量测定仪.地塞米松（纯度98%）、高碘酸（纯度98%）、MTT（四甲基偶氮唑蓝）、DMSO（二甲基亚砜）购于美国Sigma公司，无水乙醇、乙酸乙酯等均为国产分析纯试剂.K562细胞由本实验室保存.RPMI1640培养液，小牛血清购于美国Gibco公司.　　1.2方法　　1.2.1新化合物的合成路线如图1所示.　　图1合成路线（略）　　1.2.2新化合物9氟16α甲基11β,17二羟基3氧1,4雄二烯17β羧酸的合成0.500g地塞米松置于250mL锥形瓶中，用100mL无水乙醇溶解.将60mL0.025mol/L高碘酸溶液，1.9mL2.5mol/LH2SO4溶液、37.5mL双蒸水混合后，加入地塞米松溶液中.室温搅拌24h，减压除去溶剂，得白色固体初产物，置于干燥器中用P2O5干燥.将初产品溶于500mL乙酸乙酯中，用0.01mol/LNaOH萃取有机相（150mL×4），合并水相，用1mol/LHCl调节pH至2.0.室温放置2h后，4℃过夜.减压抽滤，甲醇重结晶，得白色针状晶体0.463g.产率92.6%，MP>260℃.　　1.2.3MTT比色法测定新化合物对K562细胞的增殖抑制率采用人类髓系白血病K562细胞株，在RPMI1640培养液中，50mL/L CO2,饱和湿度、37℃条件下常规传代培养.取对数生长期的K562细胞1×105/mL，100μL加入96孔细胞培养板中.实验分为只加RPMI1640细胞液的阴性对照组，5,10,20,40mg/L地塞米松溶液与5,10,20,40mg/L新化合物溶液的试验组，每个浓度设3个平行孔.常规培养44h后，离心弃上清，各孔均加入5g/L的MTT溶液10μL，继续培养4h，离心弃上清，加入DMSO100μL，振荡器上振荡5min溶解蓝色结晶，混匀后以酶标仪于570nm处读取各孔吸光度值(A570nm)，计算肿瘤细胞的生长抑制率.抑制率=［(阴性A570nm－给药A570nm)／阴性A570nm］×100%.　　统计学处理：抑制率数据以x±s表示，统计学处理用SPSS11.0统计软件进行两组间比较的t检验.　　2结果　　2.1新化合物的结构表征新化合物经过1HNMR，13CNMR及ESIMS对其进行了结构表征，具体数据如下：2.2目标化合物对K562细胞增殖抑制的影响目标化合物具有抑制K562细胞增殖的作用，且随着化合物浓度的增加其抑制活性增强（图2）.在5，10mg/L时对K562细胞抑制率分别为9.64%±0.27%和22.75%±0.35%，抑制活性分别高于地塞米松在5，10mg/L时的抑制率［（5.91%±0.30%），（18.62%±0.35%），P<0.01］，差异具有显著性.在20，40mg/L时，目标化合物的抑制率分别为30.75%±0.37%和39.32%±0.41%，与地塞米松的抑制率［（29.59%±0.45%），（40.06%±0.44%）］大致相当（P>0.05）.　　bP&【】目的：通过对地塞米松进行结构改造，探寻具有更高生物活性的新化合物.方法：以地塞米松为原料，通过氧化反应对其侧链进行结构改造，并采用1HNMR，13CNMR及ESI MS对其进行结构表征.通过MTT比色法检测新化合物对K562细胞增殖的影响.结果：地塞米松经氧化反应后，改构为预期的新化合物.新化合物具有抑制K562细胞增殖的生物活性.在5及10mg/L时，抑制率分别为9.64%±0.27%和22.75%±0.35%，高于地塞米松（P<0.01）.结论：地塞米松经结构改造为新化合物.新化合物在低浓度时对K562细胞具有较好的抑制活性.【关键词】地塞米松结构改造细胞增殖　　0引言　　地塞米松为肾上腺皮质激素类药物，具有抗炎、抑制免疫及增强应激反应等药理作用.在肿瘤治疗方面，地塞米松可抑制白血病细胞的增殖［1］，增强化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡［2］或促进细胞分化［3］.同时地塞米松已广泛应用于急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病的诱导缓解和诱导缓解后的治疗［4］.但在临床上大剂量应用地塞米松时的副作用较明显，并有耐药现象的发生.因此，寻找该药物的先导化合物、对药物进行结构改造，是开发毒副作用小、具有更好疗效药物的有效途径之一.为了进一步拓展甾体激素类药物的研究领域，本实验拟通过对地塞米松的氧化，合成并纯化出新的化合物，通过1HNMR，13CNMR及ESIMS对其进行结构表征，并采用MTT比色法对新化合物的生物活性进行初步评价.　　1材料和方法　　1.1材料天津大学精密仪器厂YRT3熔点仪，日本岛津LCMS2010液相色谱－质谱仪，VarianMercuryPlus400MHz超导核磁共振仪（溶剂CD3OD,内标TMS），瑞典Sunrise酶标定量测定仪. 地塞米松（纯度98%）、高碘酸（纯度98%）、MTT（四甲基偶氮唑蓝）、DMSO（二甲基亚砜）购于美国Sigma公司，无水乙醇、乙酸乙酯等均为国产分析纯试剂.K562细胞由本实验室保存.RPMI1640培养液，小牛血清购于美国Gibco公司.　　1.2方法　　1.2.1新化合物的合成路线如图1所示.　　图1合成路线（略）　　1.2.2新化合物9氟16α甲基11β,17二羟基3氧1,4雄二烯17β羧酸的合成0.500g地塞米松置于250mL锥形瓶中，用100mL无水乙醇溶解.将60mL0.025mol/L高碘酸溶液，1.9mL2.5mol/LH2SO4溶液、37.5mL双蒸水混合后，加入地塞米松溶液中.室温搅拌24h，减压除去溶剂，得白色固体初产物，置于干燥器中用P2O5干燥.将初产品溶于500mL乙酸乙酯中，用0.01mol/LNaOH萃取有机相（150mL×4），合并水相，用1mol/LHCl调节pH至2.0.室温放置2h后，4℃过夜.减压抽滤，甲醇重结晶，得白色针状晶体0.463g.产率92.6%，MP>260℃.　　1.2.3MTT比色法测定新化合物对K562细胞的增殖抑制率采用人类髓系白血病K562细胞株，在RPMI1640培养液中，50mL/LCO2,饱和湿度、37℃条件下常规传代培养.取对数生长期的K562细胞1×105/mL，100μL加入96孔细胞培养板中.实验分为只加RPMI1640细胞液的阴性对照组，5,10,20,40mg/L地塞米松溶液与5,10,20,40mg/L新化合物溶液的试验组，每个浓度设3个平行孔.常规培养44h后，离心弃上清，各孔均加入5g/L的MTT溶液10μL，继续培养4h，离心弃上清，加入DMSO100μL，振荡器上振荡5min溶解蓝色结晶，混匀后以酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值(A570nm)，计算肿瘤细胞的生长抑制率.抑制率=［(阴性A570nm－给药A570nm)／阴性A570nm］×100%.　　统计学处理：抑制率数据以x±s表示，统计学处理用SPSS11.0统计软件进行两组间比较的t检验.　　2结果　　2.1新化合物的结构表征新化合物经过1HNMR，13CNMR及ESIMS对其进行了结构表征，具体数据如下：2.2目标化合物对K562细胞增殖抑制的影响目标化合物具有抑制K562细胞增殖的作用，且随着化合物浓度的增加其抑制活性增强（图2）.在5，10mg/L时对K562细胞抑制率分别为9.64%±0.27%和22.75%±0.35%，抑制活性分别高于地塞米松在5，10mg/L时的抑制率［（5.91%±0.30%），（18.62%±0.35%），P<0.01］，差异具有显著性.在20，40mg/L时，目标化合物的抑制率分别为30.75%±0.37%和39.32%±0.41%，与地塞米松的抑制率［（29.59%±0.45%），（40.06%±0.44%）］大致相当（P>0.05）.　　bP<0.01，dP<0.01vs地塞米松.　　图2不同药物及药物浓度对细胞增殖抑制率的影响（略）　　3讨论　　白血病是严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤，其发病机制尚未完全明了.目前化疗仍是临床治疗白血病最常用的方法，但疗效并不令人满意.因此，探索治疗白血病的更为有效的新型药物显得十分重要.地塞米松在血液系统肿瘤特别是急性淋巴细胞白血病的治疗方面，具有重要作用，能抑制急性白血病细胞等的生长，成为其化疗的核心药物［5］.但临床上长期、大剂量的使用地塞米松，副作用明显. 因此，在药物甾体母环的结构基础上进行基团改造，是开发新药物的策略之一.　　本实验通过地塞米松的氧化反应合成了目标产物9氟16α甲基11β,17二羟基3氧1,4雄二烯17β羧酸，其结构经1HNMR,13CNMR及ESIMS得到确证.该化合物合成路线简单易行，产率高.新化合物的合成为寻找良好的先导化合物提供了线索，在甾体激素类药物的研究领域具有潜在的应用前景.　　同时，MTT结果表明新化合物保持了有效的K562细胞增殖抑制作用，尤其在较低浓度时具有优于地塞米松的生物活性，这可能与地塞米松改构后的空间位阻发生改变有关.但高浓度时的地塞米松与新化合物的细胞增殖抑制活性并无显著差异，提示地塞米松抑制细胞增殖的活性可能涉及较为复杂的机制，尚需深入探讨.地塞米松新化合物的合成，对避免因大量用药所带来的不良反应，改善用药剂量方面打下了基础.进一步的生物学活性及其作用机制研究必将有助于该化合物在肿瘤治疗方面的开发与应用.【'