草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法

'草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法ThePreparationofMeatFavoringbyMaillardReactionofGrassCarpMuscleEnzymaticHydrolysateanditsSemoryEvaluationMethodofElectronicTongue2014年6月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：郭晶晶枷1牛年‘月I旧 学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密团学位论文作者签名：噶P禺日昌日枷l牛年6月11日⋯师当书孚指导教师签色夕’17习。汐岬年6月ff日。： 江苏大学硕士学位论文摘要目前我国草鱼主要是以鲜活形式销售，其加工和开发的利用程度相对比较低。最近几年来，国内外己经陆陆续续报道了一些草鱼蛋白再次加工问题，主要是选用酶解的方式进行二次加工。但以往研究的注意力大多集中在通过酶法改性显著提高草鱼蛋白的功能特性，为功能性产品的制备提供基础，而对于草鱼蛋白的风味特性研究较少。基于上述分析，本文采用风味蛋白酶水解草鱼肉，将酶解液添加其他辅料进行美拉德反应，制备鱼味香精，再将电子舌技术与感官评定方法相结合，建立美拉德反应产物滋味评价模型，为高附加值草鱼蛋白的工业化生产提供一条可行之路。主要研究工作及结论如下：(1)首先选用风味蛋白酶对草鱼肉蛋白进行酶解试验研究。以水解度为指标，研究了液料比、初始pH、反应温度、酶与底物浓度比(E／S)和反应时间这5个单因素对水解度的影响；进一步通过响应面试验，建立了水解度回归拟合数学模型。研究表明，草鱼肉蛋白的风味蛋白酶水解工艺的最佳条件为：液料比4rnL／g、初始pH6．75、温度50。C、E／S18．5LAPU／g、水解时间7．8h，最佳条件下水解度为49．76％，与模型预测值49．94％无显著差异，说明模型可以用于预测计算。研究还表明，对水解度影响最显著的因素为E／S和酶解时间。通过氨基酸分析得到酶解液的氨基酸组成，酶解液中游离氨基酸占氨基酸总量的比例为50．77％，而肽类氨基酸占氨基酸总量的比例为49．23％，在总氨基酸中，游离类鲜甜味氨基酸(主要是指Glu、Asp、Ser、Thr、Cly和Ala)占13．44％，以肽类形式存在的鲜甜味氨基酸则为23．38％。酶解液经过GC．MS分析，检测其挥发性的风味成分，结果共检测出51种物质，其中醛17种、醇9种、烃6种、酮3种、其他杂环性物质则有16种。(2)以草鱼肉水解液为基料，再结合少量还原糖、氨基酸等配料开始MaiUard反应，制备鱼味香精。以感官评价综合值为指标，使用单因素试验研究原辅料添加量、反应条件等因素对美拉德反应液的影响；然后通过响应面优化试验，确定美拉德热反应的最佳条件。结果表明：在水解度为49．76％的水解液中添加3％葡萄糖、1％木糖、2．25％甘氨酸、O．75％精氨酸、0．25％VC、0．1％VBl、初始pH7、温度123。C及反应时间38min的条件下可产生理想的鱼味香精；通过人工感官评价T 草鱼肉酶解液美拉德反应制各鱼味香精及其电子舌感官评定方法可知，该鱼味香精咸味和甜度适中、略有酸味、有明显的鱼肉香味和令人愉悦的香气。通过氨基酸分析得到该鱼味香精的氨基酸组成，结果表明：鱼味香精中总氨基酸含量、鲜甜味氨基酸和肽类氨基酸的含量较酶解液都有显著提高。用GC．MS仪对鱼昧香精中的挥发性物质进行检测，得到产物中挥发性组分主要是醇、酮、醛、烃和杂环类等化合物，其中杂环类化合物的种类较酶解液显著增多，且以呋喃、嘧啶、吡嗪和噻唑类为主。(3)运用电子舌技术对美拉德反应产物的感官滋味进行快速品评。样品选自美拉德工艺响应面优化条件组，除去中心试验重复组，共有13类不同的反应条件，以这13类条件下生产的鱼味香精进行感官评定和电子舌分析，将感官评定得到的品评值作为建立电子舌评价模型时的校对衡量值。在处理数据时，首先用单因素方差分析法，对不同反应条件下的美拉德反应产物感官评分值和电子舌信号值进行显著性差异分析；然后采用偏最小二乘法和人工神经网络法在二者之间建立相应的模型。结果表明不同反应条件对美拉德反应产物的感官评分及各传感器的响应信号都具有极显著影响；建立人工神经网络模型时，采用4个主成分建立的模型最优。研究结果可为不同工艺下美拉德反应产物滋味的客观化评价作参考。关键词：草鱼肉，酶解，美拉德反应，电子舌，感官评价模型Ⅱ 江苏大学硕士学位论文ABSTRACTAtpresent,rmstlythegrasscarpinChinamarketarenon-processedproducts．Theprocessingandforthputtingdegreeisrelativelylow．Inrecentyears，therehasbeensomeenzyrmticmethodsreportforfurtherprocessingandusingofgrasscarpproteinindomesticandoverseas．However,thepreviousresearcheswereaimedathowtopromotefunctiomlcharacteristicsofgrasscarpproteinthroughthehydrolysismodificationmethod，whichprovidedabasisforthemakingoffunctiomlproducts．Therewerefewresearchesontheflavorcharacteristicsofgrasscarpprotein．Hence，theenzymo蜘isofgrasscarpfleshthroughflavourzymeandmaillardreactionwerestudiedinthepaper．Electronictonguetechniqueandsensoryevaluationwereusedtoestablishingthetastemodel．Itprovidedapracticalwaytoproduceinduslrialproductionofb蜘value-addedproteinofgrasscarp．硼蛤rmincontentsandtheresultsareasfollows：(1)StudyonenzyrmlysisofGrasscarpmusclebyflavourzyme．Enzymolysisconditions(namely，liquid-solidratio，initialpH，temperature，ratioofenzymetosubslrateconcentration(ws)，hydro蜘istime)werestudiedtodeckletheoptimalvalueofthesinglefactortest．Onthebaseofthelaboratorialresult,therespomesurfacemethod(RSM)wasimplemented，andthelmthematicalmodelofthehydrolysisdegreewasestablished．Asaresult,theoptimalparametersweredeterminedtoberatioofsolventtosolid4mL／g,initialpH6．75，temperature500C，E／S18．5LAPU／g,hydrolysistime7．8kOnthiscondition,thehydrolysisdegree(D均ofgrasscarpmusclewas49．76％andalmostreachedthermdelcalculationvalue49．94％，whichshowedthatthisrmdelwasavailableforpredictingcalculation．ThesignificantfactorsontheDHwereE／Sandhydrolysistime．Aminoacidcompositionwasanalyzedbyaminoacidanalyzer．Theresultshowedthat毹eaminoacidsandpeptideaminoacidsrespectivelyaccountedfor50．77％and49．23％oftotalaminoacids．Thefreshandsweetaminoacidsinfleeform(viz．，gh，asp，ser,thr,glyandala)occpuied13．44％，inpeptideformoccupied23．38％．FiIlaⅡy，theflavorcomponentsofthermalreactionftsh-likeflavorsweredetected．AtierextractedbyHS．SPMEandanalyzedbyGC-MC，51vohtflecomponentswerefoundintotal，including17aldehydes，9alcohols，6alkanes，3ketonesand16heterocycles．ⅡI 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法(2)Maillardreactionwasconductedbyenzymatichydrolysateandotherauxiliaryrmterials．Thevalueofsensorywasthereactionindex．Thermalreactionconditionswerestudiedtodecidetheoptimalvalueofthesinglefactortest．Basedontheaboveresults，RSMwasimplemented，andthemathematicalmodelofthecomprehensivescorewasestablished．Theidealconditionsweretoadd3％glucose．1％xylose，2．25％glycine，O．75％arginine，0．25％Vcand0．1％VBlintheenzyrmtichydrolysate；thereactionconditionswereinitialpH7，temperature1230Candtime38min．Sensoryevaluationoftheflavorshowedthattheproducthadmoderatesalinityandsweettaste，microacid，significantfishflavorandpleasantaroma．Thetotalaminoacids，fleshsweetnessoftheaminoacids，peptideaminoacidshadsignificantlyincreasedfromthemaillardreaction．Themajorityofvolatilecomponentsinmaillardreactionproductswerealcohols，ketones，aldehydes，hydrocarbonsandheterocycliccomponents；瑚ostoftheheterocycliccomponentswerefurans，miazines，pyrazinesandthiazoles．(3)Electronictongueasafastanalysistoolwasappliedtoevaluatethequalityofmaillardreactionproductsinthepaper．Samplesselectedfromtheresponsesurfaceoptimizationgroupofmaillardreaction．Excludingthecenterrepeatedgroup，atotalof13differenttypesofresponsesurfaceconditionsandthecorrespondingmaillardproductswerefound．Theseproductsweretastedbythevaluatorsandanalyzedbytheelectronictongue．Thetotaltastescorevaluewastakenforthereferencemeasurement．Firstly，theeffectsofreactionconditionsonhumantastequalityofmaillardreactionproductsandsensorsignalswereanalyzedusingone—wayANOVA．Subsequently,PLSandBP．ANNmethodswerecontradistinctiveusedtoestablishtherelatiomhipbetweensensorsignalsandthetotaltastescorevalueoflmillardreactionproducts．Resultsshowedthatreactionconditionshadsignificanteffectsonmaillardreactionproductstastequalityandsensorsignals．TheestablishedBP—ANNmodelgotbetterpredictiveeffectwhen4principalcomponentswereincluded．Thismethodcanofferabasicfortheintelligentevaluationofrmillardreactionproducts．Keywords：Grasscarp丑e啦Enzymatichydrolysis，Mail】ardreaction,ElectronicIVtongue，Sensoryevaluationmodel 江苏大学硕士学位论文目录第一章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1草鱼的开发利用及研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1草鱼资源及开发利用价值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．1．2草鱼加工利用现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．2肉味香精的发展及生产技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2．1肉味香精的发展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．2．2肉味香精的生产技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．3蛋白酶解液美拉德反应制备肉味香精⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．3．1蛋白酶解技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一31．3．2Maillard反应机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3．3酶解液Maillard反应制备肉味香精⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．4基于电子舌技术的滋味品质评价方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．4．1电子舌技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．4．2电子舌技术在食品领域的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．4．3美拉德反应产物鱼味香精的滋味评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一51．5本研究的立题依据、意义及主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．5．1立题依据和研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一61．5．2主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一6第二章风味蛋白酶水解草鱼肉的试验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．2试验材料和仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．2．1试验材料及试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82．2．2试验仪器及设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一82．3试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．3．1草鱼肉理化指标测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．3．2氨基酸组分测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一92．3．3草鱼肉水解的单因素试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一92．3．4响应面优化试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10V 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法2．3．5水解度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．3．6酶解液风味物质成分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．3．7数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．4结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l2．4．1草鱼肉的主要组成成分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．4．2草鱼蛋白中氨基酸含量分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．4．3单因素试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．4．3．1液料比对酶解效果的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．4．3．2初始pH值对酶解效果的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．4．3．3温度对酶解效果的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．4．3．4酶与底物浓度L匕(E／S)对酶解效果的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．4．3．5水解时间对酶解效果的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．4．4响应面设计最佳条件分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．4．4．1响应面优化试验因素选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．4．4．2回归模型的建立及其显著性检验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．4．4．3响应面因素交互作用分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．4．4．4验证性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202．4．5酶解液中氨基酸的组成分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．4．6酶解液产物挥发性风味成分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．5本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24第三章草鱼酶解液Maillard反应制备鱼味香精的试验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．2试验材料及仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．2．1试验材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．2．2试验仪器及设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．3实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．3．1酶解液的制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．3．2美拉德反应条件的单因素试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．3．3美拉德反应条件的响应面优化试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．3．4感官评价分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28VI 江苏大学硕士学位论文3．3．5美拉德产物氨基酸组分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．3．6美拉德产物风味成分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．3．7数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．4结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一303．4．1单因素试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．4．1．1葡萄糖和木糖组成比例对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．4．1．2葡萄糖和木糖总添加量对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．4．1．3甘氨酸和精氨酸组成比例对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．313．4．1．4甘氨酸和精氨酸总添加量对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．4．1．5初始pH对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一323．4．1．6反应温度对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．4．1．7反应时间对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．4．1．8VC添加量对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．343．4．1．9VBl添加量对产物感官指标的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．4．2响应面设计最佳条件分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．4．2．1响应面优化试验因素选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．4．2．2回归模型的建立及其显著性检验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．4．2．3响应面因素交互作用分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．4．2．4验证性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．4．3美拉德反应产物氨基酸组分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．4．4美拉德反应产物挥发性风味成分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．5本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44第四章基于电子舌技术的鱼味香精滋味品质评价方法建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．464．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．464．2试验材料及仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯464．3试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．3．1美拉德反应产物鱼味香精样品的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．3．2感官评价分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．3．3电子舌传感器数据采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．3．4分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48ⅥT 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法4．4结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯484．4．1单因素方差分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯484．4．1．1不同反应条件的美拉德反应产物感官评分值的差异性分析⋯⋯⋯⋯．484．4．1．2不同反应条件的美拉德反应产物传感器响应信号差异性分析⋯⋯⋯．494．4．2偏最小二乘回归(PLS)模型建立及预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一494．4．3人工神经网络(BP．ANN)模型建立及预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．504．4．4PLS模型与BP．ANN模型的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯514．5本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52第五章工作总结及展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．535．1主要研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯535．2工作展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55蜀C谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60攻读硕士期间发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61ⅦI 江苏大学硕士学位论文第一章绪论1．1草鱼的开发利用及研究现状1．1．1草鱼资源及开发利用价值2012年，我国水产养殖中，淡水养殖比例较高，占61．67％，而淡水养殖中，主要以鱼类养殖为主，被称作“四大家鱼’’之一的草鱼在鱼类养殖中产量最高，为444．22万吨[1]。因此，我国拥有丰富的草鱼资源。草鱼是我国特有的淡水鱼类，一般位于黑龙江到珠江的水系沿线上【21。如今，草鱼的分布较广，已经被国外许多国家移植。不同个体大小、采样季节、养殖区域等条件下的草鱼，其组分含量略有差异，其中蛋白质含量最高可达到26．6％，脂肪含量约为5％，水分含量约为75％。草鱼的高蛋白特性，使得其具有很高的加工利用价值。1．1．2草鱼加工利用现状目前我国草鱼主要是以鲜活形式销售，其加工和开发的利用程度相对比较低，加工品也是以初级加工为主，主要包括草鱼卤制品和烟熏制品[3】。和国外一些高速发达的国家相比，我国的水产品加工率还不到8％，有很多不足之处。主要体现在加工产品质量低、产品种类单一、基础设施比较薄弱等方面[4】。因此，为了提高水产品的附加值，需要对其进行精深加工。最近几年来，国内外关于草鱼蛋白再次加工问题，已经有所报道，主要是选用酶解的方式进行二次加工【5-7]。例如，徐锦等[81在2012年，研究了草鱼酶解产物的风味及滋味特性，为了使酶解液中不含有肉的腥味和苦味，对酶解液进行了处理，主要是采用物理方式(如活性炭吸附法)来优化酶解液的风味；李雪等[9]在2011年，通过使用不同的蛋白酶，得到水解程度不一样的酶解液，研究了水解物的抗氧化特性和功能特性；任娇艳等【10]在2009年，研究了草鱼的抗氧化活性，首先用不同种类的蛋白酶水解草鱼肉，对酶解液进行羟自由基清除力的测定及动物试验，反应过程中用响应面设计进行优化，最终获得抗氧化活性高的酶解产物；XueLi等[11】在2012年，将草鱼蛋白酶解，研究其产物的抗氧化活性。综 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法上，以往研究的重点都是通过酶法显著提高草鱼蛋白的功能特性，为功能性产品的制备提供基础[12，131，对于草鱼蛋白的风味性产品研究较少。因此，利用现代生物技术，研究草鱼的风味特性，生产调味类香精，己成为一种发展趋势。1．2肉昧香精的发展及生产技术1．2．1肉味香精的发展肉味香精的发展过程可分为三个部分[14]：第一部分是发现和寻找原料肉中的生香物质；第二部分是对挥发性香气及香味成分进行仪器鉴定【15]，运用GC．MS技术，对肉香的挥发成分进行分析与确认，通过HPLC对香味物质进行检测；第三部分是深入研究Maillard热反应，包括其原辅料的添加及反应条件的研究，以获得肉香味更浓郁且仿真性更高的肉味香精[16】。1．2．2肉昧香精的生产技术当前肉味香精的主要生产技术可分为以下三种：(1)传统的调配型香精，一般采用各种化学单体为原料，凭借调香师的经验进行调配而成[17】，香气往往带有非常明显的化学气息，天然逼真感较差，且热稳定性不佳，味感不够理想[18】。(2)脂肪氧化型香精[19】，一般是以脂类物质为原料，然后加热，使得脂质氧化分解，此过程会生成一些挥发性香味化合物。得到的鱼味香精香气明显、仿真性高，但在氧化机理、工艺技术的研究方面，我国起步较晚，研究较少。(3)热反应型香精，一般选取各种动物或者植物做反应原材料，先进行酶解，然后以水解液为基料进行美拉德热反应[201。获得的肉味香精肉香浓郁、香气逼真，并且具有较好的热稳定性。酶解结合美拉德反应技术制备香精，因其反应条件温和，操作简便，产物香味纯正，符合现代天然绿色食品的理念，成为当前研究的热点。2 江苏大学硕士学位论文1．3蛋白酶解液美拉德反应制备肉味香精1．3．1蛋白酶解技术目前一般选用酸、碱、酶三种水解方式对蛋白质进行降解研究[2¨。但酸法和碱法在降解过程中会对氨基酸造成一定的破坏，而酶水解法，蛋白质不会出现消旋作用，营养损失较少，酶解产物的理化性质也比较稳定[221。所以蛋白质的酶生物水解技术受到越来越多的重视。酶法水解鱼蛋白，关键在于选择合适的酣231。蛋白质水解酶主要来源于三类物质：植物、动物和微生物。不同来源的酶有不同的特性，对于酶解过程中产品的得率、产物的风味等有重要影响[241。此外，体系温度、初始pH值、酶与底物浓度比及反应时间等[25]都对该工艺有重要影响。1．3．2Maillard反应机理Maillard反应主要是羰基和氨基之间发生的一系列反应【凋。美拉德反应是由许多个反应组成，因反应的复杂性，对于其机理及反应过程的认识仍未透彻。美拉德反应的机理可简单概括为：加热还原糖和氨基酸或蛋白质时，还原糖与胺进行缩合生成了葡基胺，此时反应液是无色的，然后将葡基胺进行Armdori重排，生成了1．氨基．1．脱氧．D．果糖的衍生物阳。如果在强酸性环境下继续进行反应，产物为5．羟甲基．2-呋喃甲醛(HMF)[281。如果在接近中性或者碱性环境下反应，HMF可以和其他一些物质进行聚合，最终获得了一种不溶性的产物，此物质含有氮元素，且颜色为褐色。在这一系列反应中，大量的能够体现食品香气的挥发性物质被生成，大部分为内酯、吡嗪、呋喃等化合物[291。1．3．3酶解液Maillard反应制备肉昧香精现阶段，越来越多的科研人员开始研究Maillard反应型调味类香精的生产。例如，鲁珍等[301在2013年，利用蚕蛹为原料，采用风味蛋白酶水解，8h后制得蚕蛹酶解液，以其为美拉德反应的前体物质制备肉味香精；张玲等[31】在2012年，利用海蜇皮酶解液为原料，添加葡萄糖等辅料制备肉昧香料基液，并对该基液进行人工感官评定、滋味成分分析和挥发性风味成分分析；詹萍等[32]在2012年， 草鱼肉酶解液美拉德反应制各鱼味香精及其电子舌感官评定方法采用羊肉加工的副产物(羊骨)为原料，生产不同水解程度的羊骨酶解液，然后Maillard反应，研究其产物的风味特性与水解程度之间的关系，并研究最佳水解程度下的羊肉香精Maillard反应条件；王凤祥等[22】在2011年，利用罗非鱼酶解液通过美拉德反应制备理想的鱼味香精；李莹掣33]在2011年，研究了贝类水产品中蛏子的酶解，以人工感官评定为评价指标，优化了酶解液Maillard反应的工艺条件，得到的调味品具有仿真性极高的海鲜风味；谢颖等畔】在2010年，研究了鸭肉香精的制备工艺，利用复配酶水解鸭肉，将其酶解液、葡萄糖、及提香类等物质一起加热反应，制得的香料基液具有浓郁的鸭肉香味。以上研究报道均是针对于动物蛋白及其副产物的酶解液，而针对于植物蛋白的酶解液也有相关研究报道。钟泓波等[35]在2012年，将谷朊粉的酶解液用超滤的方法进行分子量分段，不同分子量段的酶解液其美拉德反应程度不同，产物的风味特征及滋味特性就不同；邹凤等[36】在2010年，利用花生粕蛋白酶解液，对浓香花生味物质的产生进行了研究。综上所述，目前生产肉味香精最常用的技术是动植物蛋白酶解技术结合Maillard反应技术。1．4基于电子舌技术的滋昧品质评价方法1．4．1电子舌技术科学发展至今，越来越多的客观、快速的检测手段被运用于食品研究领域中，包括对食品各个品质的评价和生产过程的监控。食品的品质一般包括表观、质构、风味、滋味等方面[371。如今表观可以用机器视觉、质构用物性仪、气味用电子鼻、营养成分用化学方法来检测【38】，但是对食品滋味的检测，经常依赖于感官品评师的感官评定，这种评定方法有较强的人为因素，较差的评定再现性[391，不能适应扩大化生产的步伐，因此机器化电子舌的感官评价研究应运而生。电子舌是一组传感器阵列，此阵列和人体的“味觉器官”类似，可以对样品溶液作出响应，并输出其信号，运用一定的算法和分析方法，主要是模式识别和多变量分析，对信号进行数据处理，从而得到溶液样本的定性定量信息[加】。此外，用电子舌技术分析得到的是样品溶液的整体味觉特征，并非某个单一组分的独立信息[411。4 江苏大学硕士学位论文1．4．2电子舌技术在食品领域的应用目前，电子舌技术在食品领域有广泛的应用，主要运用于茶叶品质的评价、饮料的辨别、酒类的辨别、乳品的检测、植物油的辨别、发酵过程的监控以及重金属和农残的检测等方面m】。吴瑞梅掣42]在2011年，运用不同批次来源的“碧螺春”绿茶为考察目标，用各种化学鉴定方法得到绿茶的特征滋味值，再结合机器化电子舌方法对绿茶样本溶液进行分析建模，研究其最优模型；滕炯华等[43】在2004年，研究了电子舌技术对饮料的辨别功能，发现对于不用浓度和味道的饮料(苹果汁、紫葡萄汁、橙汁和菠萝汁)，电子舌可以准确的监测识别；牛云蔚等m】在2012年，研究了樱桃酒各种不同的味感和电子舌各个传感器响应信号值之间的关系；FWmquist等【45】在2005年，利用伏安分析的电子舌对运送进工厂的各种原料乳实施在线检测，因为非正常原料乳会有特殊气味存在，比如发酸、有腥臭味、咸味过浓等，运用机器化电子舌技术能够快速检测出全部产地各异且品质低下的原料乳，这是一种具有重要意义的安全检测手段；CSoders缸om等【46]研究的Lmkop．mg电子舌技术能够应用在不同属性微生物的辨别，还能预测其培养繁殖时的各个生产阶段，判断两种菌的混合阶段及检测生长过程中的污染物等。但是，用电子舌来评价不同工艺条件下的美拉德反应产物的滋味品质鲜有报道。1．4．3美拉德反应产物鱼昧香精的滋味评价美拉德反应产物鱼味香精是一种滋味物质，不同反应条件下的鱼味香精都有其不同的滋味，现在一般是通过人的味觉器官来识别，拥有一定的主观性。而电子舌传感器阵列和人体的味觉器官类似，当它与被测液体接触时，会对鱼味香精内各种滋味成分进行选择性作用，使得各传感器上的响应信号发生不同程度的变化，从而得到产物的综合评价。为了得到鱼味香精的定量信息，需要对信号进行数据处理，一般选用偏最小二乘法(PLS)，或者是人工神经网络法(BP．ANN)等。前者是线性分析法，需要各变量之间有较高的线性关系；后者是非线性分析法，通过模拟大脑对信息的处理、记忆方式，对所得信号进行分析。对于美拉德反应产物滋味品质的量化分析，可以运用多种定量分析法，对所得结果进行比较，从而建立一个严格、一致、 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法重复性好的美拉德反应产物滋味品质评价模型。1．5本研究的立题依据、意义及主要研究内容1．5．1立题依据和研究意义我国拥有丰富的草鱼蛋白质资源，但由于加工技术落后，利用程度不高，主要用作初级加工品中。这不仅导致草鱼加工产品附加值低，而且造成严重的环境污染。现代社会人类生活节奏变快，生活品质也迅速提高，对于食品的方便快捷及口感有了更高的要求，因此各种方便式食品、休闲式食品等相关工业在我国迅猛扩大，并由此带动了食用香料行业的高速发展。采用动植物蛋白的酶解液，添加氨基酸和还原糖等物质一起加热，进行美拉德反应制备天然香精，已是现在食品调味业发展的一种大趋势【471。此方法制得的产品，有浓郁的香气、逼真的风味和醇厚的口感，还含有氨基酸和肽类等多种营养物质，可以满足消费者对食品天然、口感及功效的追求，成为近年来发展速度最快的一类食品配料。目前，对于生产过程中香精香料的滋味评价，基本以人工感官品评为主，此方法有不稳定性，容易随着评价者的身体状况、情绪变化等因素而产生不同的结果，品评时所耗费的时间较长，效率较低。因此，需要建立一种客观、快速、重复性好的滋味评价模型，可以对食品生产过程中的滋味进行有效评价。综上，本文首先研究草鱼鱼味香精的生产工艺。选用酶解结合美拉德反应技术，制备鱼味香精。其次，运用机器化电子舌技术，采用多种定量分析方法，建立鱼味香精的滋味评价模型。1．5．2主要研究内容(1)草鱼肉的风味蛋白酶水解技术研究。以水解度为指标，采用响应面优化试验，对酶解过程中的反应条件进行优化，建立水解度回归拟合数学模型。用氨基酸分析仪和GC．MS仪分析酶解液中的香味物质及挥发性成分。(2)草鱼酶解液的MaiUard反应制备鱼味香精技术研究。酶解液在高温条件下进行热反应，添加适量的还原糖和氨基酸等，以感官评价综合值为指标，确6 江苏大学硕士学位论文定Maillard反应条件。采用响应面优化设计，得到反应的最优工艺。对最优工艺下生产的鱼味香精进行香味物质及挥发性成分的鉴定。(3)基于电子舌技术的鱼味香精感官评价模型的建立。先采用单因素方差分析法(one．wayANOVA)对所得数据进行显著性分析，然后选用PLS和BP．ANN方法建模，比较两种模型，获得精确度高的鱼味香精滋味品质评价模型。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法第二章风味蛋白酶水解草鱼肉的试验研究2．1前言草鱼，是我国“四大家鱼’之一，产量丰富，口感鲜美，是一种优质蛋白资源。我国草鱼主要以鲜活形式销售，开发利用度较低。近年来，已有利用酶解的方法，对草鱼酶解液进行研究。但以往研究的注意力大多集中在通过酶法改性显著提高草鱼蛋白的功能特性，为功能性产品的制备提供基础[12，13】，而本试验主要通过深度酶解技术，将草鱼肉蛋白酶解为富含呈味游离氨基酸和小分子肽的调味基料。运用现代深度酶解技术生产鱼水解蛋白，该技术酶解条件温和、效率高郴】。蛋白水解液是以游离氨基酸和低分子肽类为主，它既可以拥有鱼肉原始的风味特征，又易溶于水，利于人体消化吸收[491。能够运用在食品调味类物质或者食品营养增强类物质q][50,51】，也可以用于制备香精香料[52】。风味蛋白酶是真菌蛋白酶和肽酶的结合复配，它可以在pH_<7的环境下对蛋白进行水解，一般可用作脱除蛋白水解液的不良滋味，同时亦能够对蛋白质进行完全水解，提升和优化水解液的风味。本章采用风味蛋白酶水解草鱼肉蛋白，通过单因素试验，确定较佳水解条件，然后利用响应面设计法，优化水解条件。拟期获得品质较高的水解液，作为下一章研究美拉德反应生产鱼味香精的反应底物。2．2试验材料和仪器设备2．2．1试验材料及试剂草鱼：江苏省镇江市学府路欧尚超市，冷冻鱼；风味蛋白酶(Fhvourzyme500MG)．无锡市联合恒洲化工有限公司；甲醛、浓硫酸、盐酸、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。2．2．2试验仪器及设备见表2．1。 江苏大学硕士学位论文表2．1仪器与设备Table2．1InstrumentandequipmentTl8uLTRA—TI]RRA。jf⑩分散仪电子天平IS．RDD3恒温振荡器PHS．2C型数显pH计SHB-III循环水式多用真空泵自动定氮仪KDN一102F氨基酸自动分析仪HP6890／5973型气相色谱一质谱联用仪德国IKA公司北京赛多利期有限公司上海珂淮仪器有限公司上海理达仪器有限公司郑州长城科工贸有限公司上海纤检仪器有限公司美国Waters公司Agilent公司2．3试验方法2．3．1草鱼肉理化指标测定方法灰分测定：GB5009．4．2010；水分测定lGB5009．3．2010；粗蛋白测定：GB5009．5．2010；脂肪测定：GB／T5009．6．2003。2．3．2氨基酸组分测定总氨基酸组成分析：酸水解法，GB／T5009．124．2003；色氨酸测定：碱水解法，GB／T18246．2000；游离氨基酸测定：取lmL酶解液，加入3mL质量浓度为69／100mL的5．磺基水杨酸，反应30min后，离心，上清液直接上机测定。氨基酸分析仪的检测条件：PICO．TAG氨基酸分析柱，柱温是38℃，流速是1mL／min，检测波长是254nm[531。2．3．3草鱼肉水解的单因素试验以液料比、初始pH、酶解温度、酶与底物浓度}=L(E／S)、水解时间为单因素，进行草鱼肉水解条件对水解度影响的试验研究。5个单因素的取值范围分别为液料比1-5mL／g，初始pH6．25-7．25，温度45-55。C，酶与底物浓度比(E／s)3～21LAPU／g原料，水解时间3-9h。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法称取一定质量鱼糜，按比例加入蒸馏水，经分散仪高速分散后，调节初始pH，加酶，在恒温振荡器中水解一定时间，之后测定水解度。第一个因素液料比是按照以下条件研究：未调节初始pH值(自然初始pH为6．75)、温度50。C、E／S为3LAPU／g原料、水解4h，其他因素均在上一个因素得出的最佳试验水平下进行。2．3．4响应面优化试验在单因素试验的基础上，通过单因素方差分析，选取对水解度影响较大的三因素(液料比X1、E／S噩、水解时间局)进行响应面试验设计，优化草鱼肉蛋白水解工艺，其他因素均取单因素试验中的最佳水平。选取Box-Behnken中心组合试验进行参数优化[541，用DesignExpert8．05b统计软件对试验因子进行编码组合(表2．2)。表2．2响应面的因素和水平袁Table，2FactorsandlevetsofRAStest2．3．5水解度的测定水解度c％，=糯糕枷。其中氨基氮总量采用中性甲醛滴定法测赳551。2．3．6酶解液风昧物质成分分析风味物质的提取：选取顶空固相微萃取(HS．SPME)的方法。固相微萃取的操作步骤：分别量取7．0mL样品于15mL的顶空萃取瓶中，并添加适量的NaCl，再将磁力搅拌子置于萃取瓶中，然后将萃取瓶盖旋紧，并固定在60。C的水浴玻璃杯中，将50}tm(Carboxen／PDMS)固相微萃取头插入萃取瓶中，再开动磁力搅拌器控温档和转速档，使萃取温度始终保持在60。C，转速维持在600r／min，10 江苏大学硕士学位论文萃取40min富集挥发性化合物。萃取结束后，将萃取头插入GC仪中，在250℃下解吸5min。色谱条件(GC)：DBWAX弹性毛细管柱60m×0．25mm×0．25I-tm；以He作载气；流动速度为O．8mL／min；程序升温：首先是40。C，固定4rnin，然后以5。C／min升至900C，再以10。C／min到210。C，固定10min；进样口和接口温度均为250。C[铜。质谱条件(MS)：用EI的方法电离，所需能量为70eV，离子源温度200。C，扫描质量范围为33-～450u[561。2．3．7数据分析每个试验点平行三次，并用Excel数据处理软件求出平均值和误差限。用SPSS分析软件进行单因素方差分析和显著性检验，优化工艺设计利用DesignExpert8．05b统计软件。2．4结果与讨论2．4．1草鱼肉的主要组成成分草鱼肉的主要组成成分见表2．3。从表2．3能够得出，草鱼肉中(除水分外)粗蛋白含量最高，达到18．62％。因此，研究开发草鱼肉时，主要是研究草鱼蛋白质的应用。鱼肉蛋白水解液经过浓缩、喷雾干燥后，即可得到高蛋白含量的草鱼酶解蛋白粉。袁2．3草鱼肉的主要组成成分Table2．3ProXLrnateanaly’sesoftheGrasscarpmuscle2．4．2草鱼蛋白中氨基酸含量分析草鱼肉(纯鱼肉，不含鱼皮和鱼骨)中氨基酸组成分析见表2．4。氨基酸组成中呈鲜甜味的氨基酸(Glu、Asp、Ala、Gly等)比例较高，其中呈鲜味的氨基酸，如Glu占12．00％，Asp占7．50％；呈甜味的氨基酸，如A】a占4．60％，Gly占3．40％，T11r占3．20％，Ser占3．70％，共计34．40％。氨基酸中，呈味氨11 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法基酸占总氨基酸含量的将近一半，会使草鱼肉水解液产生一股浓郁的鲜味，是生产肉味调味品的优质原料。蛋白质组成中必需氨基酸含量较高，达35．70％，可见草鱼是一类优质蛋白质。且甲硫氨酸和半胱氨酸等对热反应肉味风味有贡献的含硫氨基酸含量较多，占9．90％。表2．4草鱼肉中氨基酸组成成分Table2．4AnimoacidsanalysisinGrasscarpmuscle注：必需氨基酸这里指Leu、lie、Phe、Met、Thr、Val、Lys这7种氨基酸(Trp未测)。2．4．3单因素试验结果2．4．3．1液料比对酶解效果的影响液料比对酶解效果的影响如图2．1。从图2．1可以看出，随着液料比的增加水解度DH上升，其原因是溶质的流动性和溶解度得到改善，酶与蛋白接触机会增多，有利于水解反应；4mL／g时达到最大，之后DH开始下降，下降的原因是液 江苏大学硕士学位论文料比过高时，溶液过稀，减少了酶与蛋白的接触机会[571。综上，液料比选择4ml_／g。l2345液料比(mL／g)图2．I液料比对酶解的影响F远．2．ITheeffectofUSonthehydrolysisbyFlavourzyme2．4．3．2初始pFI值对酶解效果的影响初始pH值和水解度的变化关系如图2．2所示。6．256．506．’，，，．UU7．25初始pH图2．2初始pH对酶解的影响Fig．2．2TheeffectofinitialpHontheenzymatichydrolysis从图2．2能够得知，酶解液的水解度随着初始pH值的升高而呈现先增加后降低的趋势。一般的酶解反应的速度与pH值的关系曲线呈钟形[581。pH值影响酶解反应的原因较为复杂，例如氢离子浓度对不同基团的解离作用、氢离子和氢氧根离子对活性中心和酶构象中有关区域的控制作用、使底物与酶发生综合变化以及影响酶分子结构的稳定性[591。就本试验而言，DH的变化幅度比较小，而且13加他MH他加86一邑越琏*9876●l●●■●●■1l^岂越琏* 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法草鱼鱼糜水溶液具有一定的缓冲能力，可以维持反应过程中溶液pH值基本稳定，所以后续试验不调节初始pH值。2．4．3．3温度对酶解效果的影响温度和水解度的变化关系见图2．3。从图2．3可以看出，在试验设定温度下，采用风味蛋白酶水解草鱼肉时，其水解度均随温度的升高而呈现先增加后降低的趋势。在50。C时达到最大值。升温有利于分子的热运动，对水解有利；但温度影响酶的稳定性、酶蛋白的热变性、最大反应速度以及酶与底物的结合等，温度过高会使酶变性而失活，而温度过低则酶的活性不足，两者都会导致水解度的降低【60】。所以选取酶解的最适宜温度为50℃。2019装谴18堪长17164547．55052．5温度(℃)55图2．3温度对酶解的影响Fig．2．3Theeffectoftemperatureontheenzymatichydrolysis2．4．3．4酶与底物浓度比(FJS)对酶解效果的影响E／S和水解度的变化关系见图2．4。从图2．4能够看出，水解液的DH随着E／S的增加而呈现先增加后降低的趋势，在18LAPU／g时达到最大值33．11％。这可能是因为当酶浓度达到一定值时，所有酶分子己被底物所饱和，即酶分子与底物结合部位已被占据，速度增加趋缓，甚至下降[611。因此，酶与底物浓度比(E／S)选择18ua,V／g，酶用量比文献报道[57】f氐，节省原料成本。14 江苏大学硕士学位论文3530装越25堪苌201536912151821酶与底物浓度Lg(LAPU／g)图2．4酶与底物浓度比对酶解的影响F远．2．4TheeffectofE／SonthehydrolysisbyFlavourzyme2．4．3．5水解时间对酶解效果的影响水解时间和水解度的变化关系见图2．5。3．004．005．006．00’7．OO8．009．00水解时间m)图2．5水解时间对酶解的影响F远．2．5TheeffectoftimeOiltheenzymatichydrolysis从图2．5能够看出，水解度随时间的延长而增加，水解7～9h后，增加趋势趋于平缓，这可能是因为酶的催化速度会受到产物的影响。反应初期，产物的抑制作用小，随着时间的延长，酶活力逐渐下降，游离的小肽和氨基酸增多，产物的抑制作用增加，因此，水解时间控制在7～9h为宜。7h后，水解度随时间变化不明显。因此，水解时间选择7h，与文献[10，62]相比，水解时间较短，节约反应成本。1S如钙∞”如筋^装-越踺长 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法综上，通过单因素逐级优化得到的风味蛋白酶水解最佳条件是：液料比为4mL／g、初始pH值为6．75、温度为50。C、酶与底物浓度比(副S)为18LAPU／g、水解时间为7h，最佳水解度为46．93％。2．4．4响应面设计最佳条件分析2．4．4．1响应面优化试验因素选择用SPSS对各个单因素进行显著性方差分析，选择对草鱼肉水解度影响较大的几个因素进行响应面优化试验。通过比较可以得出液料比、酶与底物浓度比、水解时间对草鱼肉的水解度影响较大，选择这三个因素进行响应面优化试验，其他因素均取单因素试验中的最佳水平。2．4．4．2回归模型的建立及其显著性检验采用风味蛋白酶水解草鱼肉的方法，以液料比蜀、酶与底物浓度比恐、水解时间墨为自变量，水解度】，作应变量，试验设计及所得结果见表2．5。利用DesignExpert8．05b程序，分析表2．5中15组试验点响应值，获DH对编码自变量液料比五、酶与底物浓度比馒、水解时间咒的二次多项回归方程：Y=47．80-0．71X1+1．74尥+5．02X3+0．19X1X2-0．12X1X3-0．46X2)6-5．04X1X1-3．06XEX2．3．15恐恐(∥=0．9984)回归模型的方差分析结果见表2．6。从表2．6可以看出，模型的F值是339．57，而失拟误差项的F值是14．60，前者小于0．05，后者大于0．05，说明此条件下建立的模型有极显著效应，且对试验结果的拟合情况良好，因此该模型可以很好地水解草鱼肉过程进行分析和预测。因素局、墨、蜀蜀、X2X2、x3)6的P值均小于0．0001，说明这些因素对DH影响极显著；X1、X2X3的P值小于0．05，说明这两个因素的影响效应显著；而噩恐和蜀咒的P值超过了0．05，可以得出其影响作用不显著。剔除P值大于0．05的不显著因素得到的最终编码回归方程为：Y=47．80-0．71蜀+1．74X2+5．02X3-0．46XEX3—5．04XIXl-3．06XzX2-3．15X3墨(萨：0．9978) 江苏大学硕士学位论文表2．5响应面试验设计及结果Table2．5DesignandresultsofRSAtest表2．6回归方程的方差分析结果Table2．6ANOVAofregressionequation17 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法2．4．4．3响应面因素交互作用分析响应面图形是一个三维空间图，两个横坐标是所筛选出来的自变量，而纵坐标是所对应的应变量，它可以非常明显的反映出它们之间的变化趋势。三维空间图中还包含各变量间的等高线变化图，它可以体现出因素间交互作用的显著性，如果等高线呈现圆状，则两因素之间的交互作用不显著，如果是椭圆状，则说明量因素之间的交互作用显著[631。液料比和酶与底物浓度比对DH的影响见图2．6，液料比与时间对DH的影响见图2．7，酶与底物浓度比与时间对DH的影响见图2．8。如图所示，图2．6和图2．7中其等高线均成圆形，故液料比及酶与底物浓度比与时间之间的交互作用不明显，图2．8中等高线成椭圆形，故酶与底物浓度比与时间之间的交互作用显著。图2．6液料比和酶与底物浓度比交互作用图Figure2．6InteractionsplotofL／SandE／S 江苏大学硕士学位论文图2．7液料比和时间交互作用图Figure2．7InteractionsplotofL／Sandtime图2．8酶与底物浓度比和时间交互作用图Figure2．8InteractionsplotofE／Sandtime在图2．6中，随着液料比和酶与底物浓度比的增加，DH也随之升高，升到最高值后，又开始减小，说明液料比和酶与底物浓度比过高或过低都不能使DH达到最大。从图2．7与图2．8中可以看到，液料比和酶与底物浓度比与之前的趋势相同，DH随水解时间的变化趋势是先急剧升高而后缓慢增加，因此试验包含了所需三因素的最适反应条件。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法2．4．4．4验证性试验根据所建立的数学响应面设计法优化出草鱼肉最佳水解工艺条件，液料比3．93mL／g、E／S为18．50LAPU／g、水解时间7．77h，在此条件下水解度为49．94％。结合实际将优化后的水解条件修正为液料比4mL／g、E／S为18．50LAPU／g、酶解时间7．8h，并在此条件下进行三次重复验证试验，水解度为49．76+0．25％，与理论值相差不大。因此采用响应面分析法优化草鱼肉的水解工艺条件参数可靠，具有实用价值。2．4．5酶解液中氨基酸的组成分析用氨基酸分析仪对最佳酶解条件下制备得到的酶解液进行氨基酸分析，结果如表2．7所示。表2．7草鱼酶解液氨基酸组成成分Table2．7Animoacidsanalysisinthegrasscarpenzymatichydrolysate 江苏大学硕士学位论文注：肽类氨基酸含量2总氨基酸含量一游离氨基酸含量；鲜甜味氨基酸是指Asp、Thr、Ser、Glu、G矽和Ala。由表2．6可见，总量中，游离氨基酸含量稍微高一些，占50．77％，而肽类氨基酸则占49．23％，其中游离类鲜甜味氨基酸占总量的13．44％，其含量小于其呈味阈值噼]，无法被感知，肽类鲜甜味氨基酸则占总量的23．38％。经研究发现，小分子肽的味感来源于组成肽的氨基酸的原有味感[651，感官特性与肽的氨基酸组成息息相关，因此肽类鲜甜味氨基酸的比例对鱼肉酶解液的滋味有很大的影响【661。研究可将该酶解液作为基料添加于美拉德反应体系中，增强调味品的风味，满足市场的需求。2．4．6酶解液产物挥发性风味成分分析最佳酶解条件下制备的酶解液的总离子流色谱图如图2．9，对化合物种类归类分析见表2．8。草鱼酶解液中挥发性物质经顶空固相微萃取，气相色谱分离，共鉴定出51种物质。从表2．8可以看出，酶解液中挥发性成分大多是醛、醇、烃类物质，其中醛17种、醇9种、烃6种、酮3种、其他化合物16种。醇类、醛类和其他化合物的相对含量较高，分别为14．49％、17．76％和29．88％。醇类挥发性物质有(反)．2．戊烯醇、1．戊烯．3．醇、1．戊醇、1．己醇、1．辛烯．3．醇、庚醇、2．乙基．1．己醇、顺．2-辛烯．1．醇等。其中1．辛烯．3．醇的相对含量最高，达到了6．4％。它属于脂肪族不饱和醇，是一种天然香料，可以散发出蘑菇香和青草香。检测到的醛类物质可分为：饱和醛、2．烯醛、2,4．二烯醛。其中以正己醛相 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法对含量最高，为6．9％，其次是顺．2．庚烯醛和(反，反)．2，4．庚二烯醛，分别为2．25％和1．84％。经研究发现，本试验中检测到的正己醛可呈现出类似青草清香的气味，在多种鱼体内均有发现【6。71。其他化合物中主要以呋喃类和酯类为主，相对含量分别为7．36％和2．88％。本试验中含有的2．戊基呋喃可产生豆香和泥土清香；酯类中的甲酸辛酯是一种无色液体，具有恰人的水果香气。综上所述，草鱼酶解液中的挥发性化合物主要是醇类、醛类和呋喃类物质，所有风味性物质的共同作用组成了草鱼酶解液独有的风味。240000022000002∞00001∞0∞016000008写1400000口§1200000D《1000000800000600000400000200∞0图2．9酶解液挥发性物质的总离子流色谱图F远．2．9Thetotalionchromatogramofvolatilesubstancesinenzymatichydrolysate表2．7酶解液挥发性物质鉴定Table2．7Analysisofvolatilecomponentsinenzymatichydrolysate 江苏大学硕士学位论文翳保留(m时间in)化合物相瑟量。类别九J口例(％)烃类10．0715．09Cyclotetrasiloxane，octamethyl-八甲基环四硅氧烷3．45土0．12D—Limonene柠檬烯0．21士0．02 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法2．5本章小结(1)单因素试验结论：液料比4rnlYg、初始pH值6．75、温度50。C、E／S18LAPU／g、水解时间7h，最佳DH为46．93％。(2)响应面试验结论：利用RsM优化设计，建立了DH回归拟合数学模型。 江苏大学硕士学位论文在初始pH6．75、温度50。C的条件下，得到DH(11)对液料比(噩)、E／S(X2)及反应时间(局)的编码模型方程：Y=47．80-0．71X1+1．74弼+5．02X3+0．19xix2-0．12XIX3-0．46X2咒-5．04XlXi一3．06XzX2-3．15X3X3优化结果结合实际条件修正后，得到最佳酶解条件是：液料比4mL／g、初始pH6．75、温度50。C、E／S18．5t．mu／g、水解时间7．8h，DH为49．76+0．25％。(3)酶解液氨基酸分析结果表明：酶解液中总氨基酸含量为519．8923mg／mL，游离氨基酸含量为263．9724mg／mL，肽类氨基酸含量为255．9199mg／mL。(4)GC．MS分析结果为：挥发性风味物质共有51种，其中醛17种、醇9种、烃6种、酮3种、其他化合物16种，其他化合物主要是指呋喃和酯类。醇类、醛类和其他化合物的相对含量较高，分别为14．49％、17．76％和29．88％。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法第三章草鱼酶解液Maillard反应制备鱼味香精的试验研究3．1前言运用生物酶解法，将各种资源的蛋白质水解成游离氨基酸或者小分子肽，是蛋白质资源综合利用的一种有效方式[68‘70】。但是此种方法得到的产物，虽然增加了滋味物质的浓度、提高了产品的鲜度，却缺乏对香味的强化。以草鱼水解液为底物，和还原糖等辅料进行Maillard反应生产鱼类风味营养调味品，是草鱼加工增值利用的一条重要途径。Maillard反应也可称做非酶褐变反应、羰氨反应，常见于食品加热和储藏过程中[711。Maillard反应产物包括许多香气化合物和呈色物质[721，能够提高食品的色香味等感官性能，对食品品质有着重要的影响[73]。美拉德反应的影响因素众多，如反应时间、温度、pH值等，也与参与反应的糖(主要是单糖和寡糖)、氨基酸、蛋白质等的种类和多少有很大关系[741。目前，国内外对美拉德反应的研究多侧重于不同氨基酸或不同种类糖对风味物质形成的影响等方面[75,76]，研究方法多采用单因素试验或正交试验设计[771。本章以草鱼肉水解液为基料，再添加一些还原糖、氨基酸等辅料进行Maillard反应，生产鱼味香精。以感官评价综合值(ValueofSensory，VSE)为指标，通过单因素试验研究还原糖组成比例的确定、还原糖添加量、氨基酸组成比例的确定、氨基酸添加量、初始pH、反应温度、反应时间、VC添加量、VBl添加量这9个因素对美拉德反应液的影响；然后通过响应面优化试验，确定美拉德热反应的最佳条件。用氨基酸分析仪和GC．MS仪对Maillard反应产物中的氨基酸组分和挥发性成分进行分析，为利用草鱼加工生产鱼类风味调味品提供科学依据。3．2试验材料及仪器设备3．2．1试验材料和试剂草鱼：江苏省镇江市学府路欧尚超市，冷冻鱼；风味蛋白酶(Flavourzyme500MG)：无锡市联合恒洲化工有限公司；葡萄糖、D．(+)一木糖、蔗糖、L半胱氨酸、L精氨酸、甘氨酸、VC、VBI等： 江苏大学硕士学位论文国药集团化学试剂有限公司。3．2．2试验仪器及设备见表3．1。袁3．1仪器与设备Table3．1Instrumentandequipment仪器公司DF一101S型集热式恒温加热磁力搅拌器电子天平PHS．2C型数显pH计自动定氮仪KDN一102F氨基酸自动分析仪HP6890／5973型气相色谱一质谱联用仪南京旭析仪器有限公司北京赛多利期仪器系统有限公司上海理达仪器有限公司上海纤检仪器有限公司美国Waters公司Agilent公司3．3实验方法3．3．1酶解液的制备按照上一章节2．4．4中的条件制备酶解液。3．3．2美拉德反应条件的单因素试验Maillard反应体系中，还原糖一般选取单糖和寡糖，研究表明葡萄糖和木糖反应活性高且成本低，常被用作Maillard反应的原料，但是这两种还原糖的Maillard反应程度和速度有很大差别，对反应产物的风味和滋味等特征也会有不同的影响【78】。为了得到风味和滋味均佳的鱼味香精，分别选取不同比例下的葡萄糖和木糖进行反应。魏欣等[79】研究表明，甘氨酸和其他种类的氨基酸共同使用时可以生成很强的肉香味，甘氨酸和精氨酸是海鲜贝类主要的鲜味物质，甘氨酸可以促使体系产生强烈的肉香滋味，而精氨酸则可以产生怡人的风味。因此，本试验选择不同比例的甘氨酸和精氨酸进行反应。称量509草鱼肉酶解液，放于100mL的锥形瓶中，再称取还原糖、氨基酸、抗坏血酸、VBl等原料置于其中，搅拌溶解，调节至设定的pH值，密封锥形瓶，放入恒温加热油浴锅中在设定温度下反应一段时间后，取出锥形瓶，反应结束后27 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法迅速采用冰水冷却，反应液于4。C下存放用于分析测定，通过感官评分综合分值确定各个原料的最佳添加量和反应所需的最适条件。本试验研究还原糖组成比例(葡萄糖：木糖=1：5、1：3、1：1、3：1、5：1)、还原糖添加量(2％、3％、4％、5％、6％)、氨基酸组成比例(甘氨酸：精氨酸=15、1．3、1：1、3：1、5：1)、氨基酸添加量(2％、3％、4％、5％、6％)、初始pH(5、6、7、8、9)、反应温度(100℃、110℃、120℃、130℃、140℃)、反应时间(20min、30min、40min、50min、60rain)、VC添加量(0．15％、O．20％、O．25％、O．30％、0．35％)、VBl添加量(0．05％、0．10％、0．15％、0．20％)等9个因素对美拉德反应液的影响。第一个因素还原糖组成比例的确定是在酶解液509、还原糖总添加量4％、甘氨酸精氨酸1：1、氨基酸总添加量3％、初始pH7、反应温度120。C、反应40min、VC添加量O．15％、VBl添加量0．05％的条件下进行，其他因素均在上一个因素得出的最佳试验水平下进行。3．3．3美拉德反应条件的响应面优化试验在单因素试验的基础上，通过单因素方差分析，选取对感官评定得分值影响较大的三因素(初始pH蜀、反应温度尥、反应时间托)进行响应面试验设计，优化酶解液美拉德反应工艺，其他因素均取单因素试验中的最佳水平。选取BoX-Behnken中心组合试验进行参数优化[541，用DesignExpert8．05b统计软件对试验因子进行编码组合(见表3．2)。袁3．2响应面的因素和水平表Table32FactorsandlevelsofRAStest3．3．4感官评价分析邀请十名熟悉草鱼风味的专业人员，首先对感官品评方法进行解释和培训， 江苏大学硕士学位论文取经过沸水灼煮的鱼肉，捣碎后置于广口容器中，让感官品评员充分熟悉煮熟鱼肉的香气，做为纯正鱼肉风味的参比，并对美拉德反应产品进行感官品评和评分。感官评定时，将制备的溶液用蒸馏水按照1：10(VⅣ)的比例稀释，然后进行编号。分别用鱼香味、鲜味、焦香味、咸味、甜味、酸味这6个指标进行品评，用等距标度计分法来计量评价的强度，以十分制转化为数值。将所得数值标记为编码样品的感官指标，以各项指标的的平均分乘以其权重，然后加和，从而获得最终得分【80】。品评设置标准及权重比例见表3．3。袁3．3美拉德产物的感官评分权重设计袁Table3．3Thedes远nofsensoryscoresandheavyweights(HW)inmaillardreactionproducts注：咸味(HWlO％)、甜味(HW10％)、酸味(HW10％)分别设定0--一10分的评分标准，以个人接受程度为评分依据。3．3．5美拉德产物氨基酸组分分析方法见2．3．2。3．3．6美拉德产物风味成分分析方法见2．3．6。3．3．7数据分析方法见2．3．7。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法3．4结果与讨论3．4．1单因素试验结果3．4．1．1葡萄糖和木糖组成比例对产物感官指标的影响葡萄糖和木糖组成比例对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．1所示。感官评分结果显示，葡萄糖的比例增加时感官评分值增加。这是由于木糖反应活性很高，随着木糖添加量的增加，体系中的褐变程度急剧增加，反应程度难以控制，与文献报道的结果一致[811，因此，木糖含量应控制在一定范围内。而葡萄糖反应程度较慢，适当的增加葡萄糖的比例可以有效控制反应程度。实验结果表明葡萄糖：木糖=3：1时感官评分最高，反应液呈棕褐色，有怡人的焦糖甜香味。1：31：l3：l葡萄糖与木糖的比例图3．1葡萄糖与木糖的比例对感官评分综合值的影响Fig．3．1Effectofdifferentglucose—XyloseratioontheVSE3．4．1．2葡萄糖和木糖总添加量对产物感官指标的影响葡萄糖和木糖总添加量对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．2所示。在美拉德反应体系中，随着还原糖添加量的增加，体系中的游离氨基酸含量显著降低，当还原糖的添加量过多时，体系会发生程度较高的焦糖褐变，使得产品中的焦糖味过重，从而掩盖了肉香味；而还原糖的添加量过少时，体系反应程度大大降低，反应液有淡淡的肉腥味，色泽浅且香气弱。当还原糖添加量为4％时，反应液感官评分最高，色泽为棕褐色，有明显的鱼肉香味和焦糖的甜香味。因此，876543衄∽> 江苏大学硕士学位论文本实验选择还原糖的添加量为4％。23456还原糖添加量(％)图3．2还原糖添加量对感官评分综合值的影响Fig．3．2EffectoftheamountofreducingsugarontheVSE3．4．1．3甘氨酸和精氨酸组成比例对产物感官指标的影响甘氨酸和精氨酸组成比例对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．3所示。当甘氨酸的添加比例小于等于精氨酸时，即甘：精为15，1：3和1：1，反应程度较大，溶液颜色较深；当甘：精=3：1时，反应液色泽为棕褐色，鱼肉香味浓郁且有宜人的焦糖甜香；当甘氨酸的含量进一步增加时，即甘：精为5：1，溶液的颜色很浅且鱼肉香味较弱。因此本实验选择甘氨酸和精氨酸的组成比例为甘氨酸：精氨酸=3：1。1：31：l3：1甘氨酸与精氨酸的比例图3．3甘氨酸与精氨酸的比例对感官评分综合值的影响Fig．3．3Effectofdifferentglycine—arginineratioOIltheVSE876543固∞>876543衄∞> 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法3．4．1．4甘氨酸和精氨酸总添加量对产物感官指标的影响甘氨酸和精氨酸总添加量对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．4所示。随着氨基酸总加入量的增大，体系中的氨基酸与还原糖发生了美拉德反应，使得体系中的还原糖浓度下降。当氨基酸总添加量过低时，体系中还原糖的相对含量较高，焦糖化反应程度大，产品色泽深、焦糊味重且香味不纯正；当氨基酸总添加量过高时，体系中氨基酸含量相对较高，反应液颜色几乎没有变化，鱼香味也很弱。当添加量为3％时，反应液鱼香味浓郁，色泽为理想的棕色。因此，本实验选择氨基酸的总添加量为3％。23456氨基酸添加量(％)图3．4氨基酸添加量对感官评分综合值的影响Fig．3．4EffectoftheamountofaminoacidsontheVSE3．4．1．5初始pH对产物感官指标的影响反应液初始pH值对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．5所示。pH较低时，体系处于较强酸性的环境下，氨基酸中的氨基获得氢离子而带正电，使得它和羰基之间的亲核反应难以发生，Maillard反应受到阻碍；而当pH较高时，体系处于碱性环境中，氨基酸的氨基为阴离子态，与还原糖的羰基之间的作用加剧，使得美拉德反应和焦糖化反应进程均加快，反应液有焦味等不好的风味存在，且颜色较深[711。所以本实验初始pH值选择7。32876543固∽> 江苏大学硕士学位论文56789初始pH图3．5初始pH对感官评分综合值的影响Fig．3．5EffectoftheinitialpHOIltheVSE3．4．1．6反应温度对产物感官指标的影响反应温度对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．6所示。反应温度是Maillard热反应的一个重要影响因素，对热处理过程中反应的剧烈程度和深度有较大影响。通常情况下，随着反应温度的增加，热反应速率随之加快，但温度过高，反应过于剧烈，容易产生焦味和异味【821。由图3．6能够看出，反应温度为120。C时的VSE最高，130。C和140。C时的次之，110℃和100℃时的VSE均较低。所以本试验的最适温度为120℃。100110120130温度(℃)图3．6反应温度对感官评分综合值的影响Fig．3．6EffectofthetemperatureOIltheVSE876543岫∽>876543∞∽> 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法3．4．1．7反应时间对产物感官指标的影响反应时间对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．7所示。反应时间过短，反应不充分，香味较弱；而反应时间过长，热反应程度太深，反应液易产生焦味等呛人的昧道。本实验中，当反应时间低于40min时，反应液色泽较浅且香味不足，高于40min时，色泽呈深褐色且有浓烈的焦糊味产生。所以反应时间以40min为宜。2030405060时间fmin)图3．7反应时间对感官评分综合值的影响Fig．3．7EffectofthetimeOntheVSE3．4．1．8VC添加量对产物感官指标的影响VC添加量对感官评分综合值(VSE)的影响如图3．8所示。9．08．58．0∞∽>7．57．06．50．150．200．250．300．35VC添加量(％)图3．8VC添加量对感官评分综合值的影响Fig．3．8EffectoftheamountofVCOIltheVSE876543∞∽> 江苏大学硕士学位论文添加少量的VC可以使产物的焦甜香味得到提升，酸味也有所提升，对美拉德反应产物的整体风味轮廓产生了较大的影响，有研究表明，添加VC有利于体系中吡嗪类物质的生成[83】；随着VC添加量的增加，使焦甜烤香显著变化，香气之间的协调性下降，整体愉悦感下降。从图3．8中可以看到，VC的最佳添加量是0．25％。3．4．1．9VBl添加量对产物感官指标的影响VBl添加量对感官评分综合值(VSD的影响如图3．9所示。盐酸硫胺为美拉德反应提供硫元素，是一种能提供硫源的重要风味前体。像呋喃、噻唑、噻吩等挥发性风味物质，都可以通过硫胺素的热降解而生成，硫胺素的热降解还会产生H2S、NH3等美拉德反应的中间物质删。添加少量的VBl可以明显的增加肉味特征香气，随着VBl添加量的增加，H2S、NH3味增强，香气之间的协调性下降，整体愉悦感下降。由图3．9可知，VBl的最适添加量为0．10％。0．050．100．150．20VBl添加量(％)图3．9VBl添加量对感官评分综合值的影响Fig．3．9EffectoftheamountofVBlOiltheVSE经上述单因素水平试验结果，初步确定美拉德反应体系的基本条件为：葡萄糖木糖=3：1、葡萄糖和木糖总添加量4％、甘氨酸：精氨酸=3：l、甘氨酸和精氨酸总添加量3％、初始pH7、反应温度120。C、反应时间40min、VC添加量0．25％、VBl添加量0．10％。505O5059876闯∽> 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法3．4．2响应面设计最佳条件分析3．4．2．1响应面优化试验因素选择用SPSS对各个单因素进行显著性方差分析，选择对感官评定影响较大的几个因素进行响应面优化试验。通过比较可以得出初始pH、温度、时间三个因素对感官评分综合值影响较大，选择这三个因素进行响应面优化试验，其他因素均取单因素试验中的最佳水平。3．4．2．2回归模型的建立及其显著性检验采用美拉德反应制备鱼味香精，以初始pH∞、温度魁、时间弼为自变量，感官评分综合值(VSE)】，为响应值，试验设计及数据处理见表3．4。利用DesignExpert8．05b软件，通过对表3．4中VSE试验数据进行二次多元回归拟合，获VSE对初始pH蜀、温度施、时间局的二次多项回归方程：Y=8．77+0．20Xl+0．62X2—0．50X3-0．03xlx2-0．13X]X3+0．33尥X3—2．17XIXl-1．07X2X2-1．12X3X3(R2=0．9984)回归模型方差分析结果见表3．5。从表3．5可以看出，回归模型的F值是290．41，小于0．0001，因此所建模型是极显著的，而失拟误差项的F值是0．11，大于O．05，且相关系数为序=O．9984，表明此模型对试验结果的拟合情况良好，因此该模型可以很好地对不同反应条件下美拉德反应产物的感官评分值进行分析和预测。由表3．4可见，因素恐、咒、蜀蜀、恐恐、墨码的P值均小于0．0001，说明这些因素对VSE影响极显著；蜀、X2X3的P值小于O．05，说明这两个因素的影响效应显著；蜀墨和蜀玛的P值都超过了0．05，能够得知其影响作用不显著。表3．4响应面试验设计及结果Table3．4DesignandresultsofRSAtest36 江苏大学硕士学位论文表3．5回归方程的方差分析结果Table3．5ANOVAofregressionequation3．4．2．3响应面因素交互作用分析响应面图形是一个三维空间图，两个横坐标是所筛选出来的自变量，而纵坐标是所对应的应变量，它可以非常明显的反映出它们之间的变化趋势。而三维空 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法间图中还包含各变量间的等高线变化图，它可以体现出因素间交互作用的显著性，如果等高线呈现圆状，则两因素之间的交互作用不显著，如果是椭圆状，则说明两因素之间的交互作用显著[851。初始pH和温度对VSE的影响见图3．10，初始pH与时间对VSE的影响见图3．11，温度与时间对VSE的影响见图3．12。图3．10pH和温度交互作用图Fig．3．10InteractionsplotofpHandtemperature图3．1lpH和时间交互作用图Fig．3．11InteractionsplotofpHandtime 江苏大学硕士学位论文图3．12温度和时间交互作用图Fig．3。12Interactionsplotoftemperatureandtime如图所示，图3．10和图3．11中其等高线均成圆形，故初始pH与温度和时间之间的交互作用不明显，图3．12中等高线成椭圆形，故温度与时间之间的交互作用显著。在图3．10中，随着初始pH和温度的增加，VSE也随之升高，升到最高值时，又开始减小，说明初始pH和温度过高或过低都不能使VSE达到最大。从图3．11与图3．12中可以看到，初始pH和温度与之前的趋势相同，随着反应时间的增加，VSE先增加然后迅速降低，因此试验包含了所需三因素的最适反应条件。3．4．2．4验证性试验根据所建立的数学响应面设计法优化出美拉德反应最佳条件，初始pH7．1、温度122．6"C、时间38．1min，在此条件下感官评分综合值为8．9。结合实际将优化后的反应条件修正为初始pH7、温度123。C、时间38min，并在此条件下进行三次重复验证试验，感官评分综合值为8．8+0．5，与理论值相差不大。可见该模型能较好地预测实际美拉德反应情况。3．4．3美拉德反应产物氨基酸组分分析用氨基酸分析仪对最佳美拉德反应条件下制备得到的鱼味香精进行氨基酸分析，结果如表3．6所示。39 表3．6美拉德反应产物氨基酸组成成分Table3．6Animoacidsanalysisinthemaillardreactionproducts一种类器总篙瑟一器量肽管量天冬氨酸(Asp)3．0024．18+0．476．37+0．2617．81苏氨酸(Thr)260．0010．03+0．164．85+0．085．17丝氨酸(Set)150．0011．41+0．235．76a：0．115．65谷氨酸(Glu)5．0040．31+1．027．57士0．1332．74甘氨酸(Gly)110．00358．05士3．93155．17士2．92202．88丙氨酸(Ala)60．0015．74t1．066．24土0．099．50半胱氨酸(Cys)一6．86土0．58-6．86缬氨酸(Val)150．0015．07土0．336．47土0．148．60蛋氨酸(Met)30．0016．43土0．665．80t0．1110．63异亮氨酸(Ile)380．0012．89-土0．425．87士0．057．02亮氨酸(ku)90．0020．65+0．6114．13+0．156．52酪氨酸(Tyr)一8．88士0．157．53士0．091．35苯丙氨酸(Phe)150．009．45+0．116．88士0．082．57组氨酸(Hjs)20．006．95+0．083．34+0．063．61赖氨酸(Lys)50．0023．63+0．3310．77土0．3312．86精氨酸(Arg)10．0092．70土1．8479．25士1．0813-45脯氨酸(Pro)300．00105．94il．983．64土0．07102．29色氨酸(Trp)一81．86士1．978．27土0．1873．5982总量861．02i5．88337．91士3．49523．1124游离／肽类氨基酸占总量的比例肠鲜甜味氨基酸游离／肽类鲜甜味氨基酸占总量的比例／％39．2560．75459．71土3．11185．96士1．5221．60273．7531．80注：肽类氨基酸含量=总氨基酸含量一游离氨基酸含量：鲜甜味氨基酸是指Asp、Thr、Ser、Glu、Gly和Ala。由表3．6可知，美拉德反应产物中游离氨基酸占总量的比例为39．25％，而肽类氨基酸占总量的比例为60．75％，肽类氨基酸含量较高，其中以游离形似存在的鲜甜味氨基酸占总氨基酸含量的21．60％，而以肽类存在的则占31．80％；与表2．7中酶解液氨基酸组分相比而言，美拉德反应产物中总氨基酸、鲜甜味氨基酸、 江苏大学硕士学位论文肽类氨基酸的含量都有明显增高，从而促使美拉德反应产物口感更佳。3．4．4美拉德反应产物挥发性风味成分分析最佳热反应工艺下生产的鱼味香精的总离子流色谱图如图3．13，对化合物种类归类分析见表3．7。130∞0C120∞0(110∞0(100∞0C90∞00∞芒800000∞鼍700000暑600000S0∞0040000030000020∞0010∞008．0010．0C12．0014．0016．0C18．0020．0022．0C24．0026．0C28．0c30．00Yrre／rrin图3．13Maillard反应香精挥发性物质的总离子流色谱图Fig．3．13Thetotalionchromatogramofvolatilesubstancesinmaillardreactionflavors表3．7Maillard反应香精挥发性物质分析Table3．7Analysisofvolatilecomponentsinmaillardreactionflavors41 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法42 江苏大学硕士学位论文14．0515．6515．7215．8816．5616．83p-xylene对二甲苯Phenol,2一ethyl-2一乙基苯酚1,3．Diazine嘧啶Furan，2-pentyl-2一戊基呋喃2-Chloro一4一(4-methoxyphenyl)-6一(4一nitrophenyI)pyrimidine2一氯代一4—4．甲氧苯基．6一(4一硝基苯基)嘧啶Pyrazine，methyl-甲基吡嗪17．12Furan，2一(1-pentenyl)-，(E)-(反)一2一(1-戊烯基)一呋喃17．1817．860．09士0．001．94+0．190．40士0．010．54士0．012．22土O．032．31土0．070．79士0．02cis一2一(2-Pentenyl)furan顺一2-(2-戊烯基)．呋喃0．19士0．00Pyrazine，2,6一dimethyl-26．二甲基吡嗪0．49-士0．0319．75l"yrazine，3一ethyl-2，5一dimethyl-3-乙基一2，5一二甲基吡嗪1．77+0．0520．0020．16Propanoicacid，pentylester丙酸戊酯0．82士0．02Furan，2-methyl-2．甲基呋喃0．19-士0．0020．70Pyrazine，2，5一dimethyl-3一propyb2,5一二甲基一3．丙基吡嗪0．48+0．0222．2622．5322．6123．004-Methylthiazole甲基噻唑1．35士0．04Pyrazine，2-butyl-3，5-dimethyl-2一丁基一3，5．二甲基吡嗪2．76+0．19Hexanoicacid，anhydride己酸0．12士0．00Oxime一，methoxy—pheny1-甲氧基．苯基肟0．24士0．0125m2,26声-Bi二s(∽1,1。-d．二im粼：勰襞署1o．s呲。326．9227．2715一Crown一515．冠醚一5Hexanedioicacid，bis(2-ethylhexyl)esterz(2一乙基己基)己二酸酯5．57士0．130．38士O．0l29．28Phthalicacid，butylisohexylester丁基异己基邻苯二甲酸酯1．14士0．0232．37‰吐拦辨萎嬲蛐驴2．76±o．03其他厶；+35．48士0．88思计75．05士2．00从表3．7可以看出，美拉德反应产物中共鉴定出53种挥发性物质，其中有醇10种、醛11种、酮4种、烃3种、其他化合物25种。测定出的风味物质中含量最多的是醇类，共检测到10种醇类，占总量的13．79％，但比酶解液中醇类物43 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法质所占比例(14．49％)要小。检测到的醛类物质可分为：饱和醛、2．烯醛，其中，2一甲基丙醛、2．甲基丁醛是鱼露中的特征风味化合物[861。由表3．7和表2．8可知，与酶解液中挥发性成分相比，热反应产物中其他化合物的种类明显增加，由4种增加到8种，增加了酰胺类、吡嗪类、嘧啶类和噻唑类，比例占到总量的35．48％。其中含氮类物质比例占总量的14．11％，主要是吡嗪类、胺类、嘧啶类物质。热反应鱼味香精挥发性成分中吡嗪类相对含量为7．81％，其中2．丁基．3，5．二甲基吡嗪相对含量最高，为2．76％。吡嗪类由于其量大和呈味阈值较低的特点，一直被认为是很多热加工产品中的显要挥发性风味物质，可以使产品呈现出怡人的坚果味和烘焙味[871。含硫类化合物中4．甲基噻唑占总量的1．35％，它是一种香料中间体，是由氨基酸和糖或含羰基之类的化合物通过美拉德反应生成，不过噻唑也可能来自硫胺素的热降解[88】。3．5本章小结(1)草鱼肉水解液Maillard反应单因素结果为：在葡萄糖：木糖=3：1、葡萄糖和木糖总添加量4％、甘氨酸精氨酸=3：1、甘氨酸和精氨酸总添加量3％、初始pH7．0、反应温度120。C、反应时间40min、VC添加量0．25％、VBl添加量O．10％的条件下，鱼味香精的VSE最高，为8．9。(2)响应面优化试验结果：在其他条件均为单因素的最佳条件下，得到VSE(y)对初始pH(蜀)、反应温度(局)及反应时间(墨)的编码方程：Y=8．77+0．2呱+O．62X2-0．5瞒一0．03xi弼-0．1掘局+0．33X2尼-2．17Xvgl-1．07XzA己-1．12恐墨，优化结合实际情况修正后的反应条件是：初始pH7、温度123。C、时间38min，VSE为8．8+0．5。通过人工感官评价可知，该鱼味香精咸昧和甜度适中、略有酸味、有明显的鱼肉香味和令人愉悦的香气。(3)美拉德反应产物氨基酸分析结果为：总氨基酸、鲜甜味氨基酸和肽类氨基酸的含量较酶解液都有显著提高，分别为861．02mg／rnL、337．91mg／mL和523．11mg／mL，且肽类氨基酸占总量的比例升高，为60．75％，美拉德反应产物口感更佳。(4)GC．MS分析结果为：共鉴定出53种挥发性物质，其中有醇10种、醛11种、酮4种、烃3种、其他化合物25种。与酶解液相比，其他化合物的种类 江苏大学硕士学位论文明显增加，由4种增加到8种，增加了酰胺类、吡嗪类、嘧啶类和噻唑类，比例也提升，占到总量的35．48％，产品的风味更怡人。45 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法第四章基于电子舌技术的鱼昧香精滋味品质评价方法建立4．1前言美拉德反应产物鱼味香精是一种滋味物质，在制备生产过程中，条件不同则滋味各异。目前一般是通过人工感官评定对这些滋味进行评价，对品评人员的昧觉判断能力要求极高[891。评价过程中，拥有一定的主观性，会随着评价者的身体状况、情绪变化等因素而产生不同的结果，品评时所耗费的时间也较长，效率低下[90】l0电子舌(ElectronicTongue)是通过仿照人体的味觉原理而设计的一种新式分析仪器[91]，它是一组传感器阵列，此阵列可以对样品溶液作出响应，并输出其信号，运用一定的算法和分析方法，主要是模式识别和多变量分析，对信号进行数据处理，从而得到溶液样本的定性定量信息[921，目前己经广泛运用于酒类的鉴别【93】、乳品的检测[94】、果汁品质的检测【951和鱼肉品质的检测[96】等，而用来评价不同工艺条件下生产的鱼味香精的滋味品质几乎未见相关报道。因此，对于美拉德反应产物鱼味香精滋味品质的量化评价，可以运用机器化电子舌技术来分析，建立一个严格、一致、重复性好的鱼味香精滋味品质评价标准。本章的样品选自上一章节3．3．3中美拉德反应响应面优化条件组，除去中心试验重复组，共有13类不同的响应面条件，对这13类反应条件下的美拉德反应产物进行感官评定和电子舌特征分析。运用one．wayANOVA对其感官评分综合值和机器化电子舌传感器的响应信号值进行显著性分析，然后选用PLS和BP．ANN法进行建模，并对模型进行分析，最终获得美拉德反应产物感官评定的一种有效评价方法。4．2试验材料及仪器设备试剂是上一章节3．3．3中的美拉德反应产物；仪器是ASTREEII电子舌(法国Alpha．MOS公司)。 江苏大学硕士学位论文4．3试验方法4．3．1美拉德反应产物鱼昧香精样品的制备样品选自美拉德反应响应面优化条件组，见表4．1，除去中心试验重复组，共有13类不同的响应面条件，以这13类不同反应条件下的美拉德反应产物鱼味香精作为样品，每类制备10个样，共130个样品。从130个样品中选取87个作为校正集，用于建立校正模型，剩余43个作为预测集，用于验证模型准确度。表4．1响应面试验设计及结果Table4．1DesignandresultsofRSAtest4．3．2感官评价分析见表3．3。4．3．3电子舌传感器数据采集本试验共有13类130个样品，每个按感官评定时的浓度，以1：10(V／V)的 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法稀释度稀释，用滤纸过滤待测。测定时，取85mL，倒入专用电子舌量杯里，数据采集的顺序是蒸馏水和待测样品溶液交替进行。为减少测量误差，本试验每个样循环测6次，每次120s，取后3次传感器最后10s响应信号的平均值作为各样本的传感器响应值，模型建立前对所有数据进行标准化处理。4．3．4分析方法首先对试验因素和结果二者之间进行差异性分析，可以运用SPSS的one．wayANOVA法；然后通过PLS和BP．ANN法，分别建立电子舌评价美拉德反应产物滋味品质的定量模型，并进行比较。模型建立过程中，采用交互验证均方根误差值(麟Cy)确定建模要用的最佳主成分因子数。模型的优劣是用校正集的相关系数(Rc)、校正集均方根误差(RMSEC)和预测集的相关系数(砌)、预测集均方根误差(RA丛EP)来评价[421。建模时的数据用Matlab8．1．0．604分析。4．4结果与讨论4．4．1单因素方差分析4．4．1．1不同反应条件的美拉德反应产物感官评分值的差异性分析对不同反应条件下美拉德反应产物的130个样本溶液的感官评价值进行差异性分析，如表4．2所示。从表4．2可看出，组问均方根误差(为161．086)比组内均方根误差(为0．070)大得多，说明误差主要来源于不同的反应条件；F值为22417．729，显著性水平小于0．001，表明不同反应条件的美拉德反应产物滋味品质差异较大。表4．2美拉德反应产物滋味总得分值的单因素方差分析结果Table．4．2Resultsofone-wayANOVAfortotalscoresofmaillardreactionproductstaste注：0【等于0．01。48 江苏大学硕士学位论文4．4．1．2不同反应条件的美拉德反应产物传感器响应信号差异性分析对电子舌每根传感器的响应值作差异性分析，结果见表4．3。从表4．3可见，各传感器问的组间误差也比组内误差大得多，说明误差主要来源于各传感器。方差分析结果中，所有传感器的显著性水平均小于0．001，表明不同反应条件下的美拉德反应产物对各传感器响应信号值有极显著影响。袁4．3各传感器的单因素方差分析结果Table4．3Resultsofone—wayANOVAforsevensensors注：a等于0．01。4．4．2偏最小二乘回归(PLS)m型建立及预测由4．4．1的分析能够看出，不同反应条件的美拉德反应产物滋味品质和电子舌采集值之间有显著性差异，表明不同反应条下的美拉德反应产物，其滋味品质是各异的。本文拟创建美拉德反应产物的机器响应值和人工感官评分值之间的相关模型，以实现在美拉德热反应工艺研究中美拉德反应产物滋味品质的快速有效评价。首先选用线性PLS方法建立模型。电子舌的各个传感器之间有交互选择性，也有非特异性，而美拉德反应产物的非单一性，使得每根传感器的响应值之间有关联，响应信号信息会有部分重复；而这些重复信息如果参与建模，则会导致模型性能的下降。所以，模型输入前必须先对信号值进行主成分分析，标准化后再输入。在建立PLS模型过程中，模型的稳定性和主成分因子数的多少有密切关系，因此，需要对其进行分析，选择一个最优数。本文在校正集87个样本中选用RMSECV的大小来确定应该选用的49 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法主成分数，当RMsECV值最小时，此时模型所使用的主成分数就是最佳数。建立模型时的主成分数与其所对应的RMSECV值如图4．1所示。从图4．1可知，当参与模型建立的主成分因子数多于5时，建立的相应模型的RMSECV值基本不会有明显下降，所以，使用前5个主成分建立PLS模型，校正集中庇为0．7251，RI涩EC为0．7740；用预测集中43个独立样本预测模型性能时，砌为0．7429，Ril您EP为0．7343。剿账辎椒露茸翻旧钗1．110．90．80．71234567主成分数图4．1校正集中主成分数和模型的对应交互验证均方根误差变化关系图Fig．4．1ThecorrespondingchangesinprincipalcomponentsandRMSECVvaluesofPLSmodel4．4．3人工神经网络(BP-ANN)模型建立及预测从图4．1可知，由PLS建立的线性相关模型RJ涩EP值较低，模型不能准确预测美拉德反应产物感官品评值和传感器信号之间的关系，因此采用BP．ANN非线性方法再次建模分析。BP．ANN中主成分分析法提取的特征变量为输入，美拉德反应产物感官评分值为网络的输出，使用4层神经元个数。与PLS一样，模型的稳定性受主成分因子数多少的影响，同样也是采用校正集的RMSECV值选取最佳主成分数。BP．ANN模型参数设计是：各层之间由正切S形函数传递，重复训练次数为1000，学习速率为0．1，动量因子为0．3，初始权重设置为0．0405，目标误差为1e．8。图4．2即为BP—ANN模型中主成分因子数和RMSECV值的变化关系图。从图4．2可知，BP．ANN模型使用4个主成分因子时，所对应的RMSECV值最小，此时模型校正集中＆为0．9938，RI讼EC为0．1248，预测集中励为O．9713，Ri～fSEP为 江苏大学硕士学位论文0．2705。乳掣椒露0．目禽骚0．01234567主成分数图4．2校正集主成分数和模型的对应交互验证均方根误差变化关系图F远．4．2ThecorrespondingchangesinprincipalcomponentsandRMSECVvaluesofBP—ANNmodel4．4．4PLS模型与BP-ANN模型的比较图4．3是预测集中43个样本的实际感官品评值和所建模型的预测值之间的预测误差图，图中横坐标表示感官品评人员对美拉德反应产物感官品评的实际值，纵坐标表示模型预测值和感官品评师评分值之间的差值。图4．3(a)是PLS模型的预测误差图，图4．3m)是BP．ANN模型的预测误差图。预测误差差值以士0．5分为界限，用图中的虚线标记。对两图进行比较可知，PLS和BP．ANN中分别有23个和2个样本的预测误差的绝对值超过了0．5分，在0．0．5分内的比例分别为51．1％和95．35％。表4．4是建立的PLS和BP．ANN模型比较的结果，由表可看出，BP．ANN的模型性能明显好于PLS。从表4．4和图4．3可以得出BP．ANN的模型预测更客观、准确。其原因可能是因为美拉德反应产物滋味是鱼味香精内各种成分之间相互配合和彼此协调后的综合反映，它并不是某个单一成分的独立作用，产物也是由品评员通过复杂的味觉器官完成的，而电子舌传感器所反映的信号值也是多种组分的综合值[42】，这样使得美拉德反应产物的感官评分值与电子舌传感器获得的响应值间是非线性的关系。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法矿倍t川mI，．．‘”《4|1|II¨”●，l5，1‘rl5、76，0(a)一一PLS．IJI』IJ．，I|J．1，。”’1|I”‘‘1I‘．15，1S．‘5，7S0e．36．ee，97．27，57．88．’11,48．7蜜酥俯(b)一～BP—ANN图4．3预测集中PLS模型、BP—ANN模型的预测误差图Fig．4．3PredictionerrorvaluesofPLSandBP—ANNmodelsinthepredictionset袁4．4PLS与BP．ANN模型综合比较Table4．4ComparisonofresultsbetweenPLSmodelandBP—ANNmodel4．5本章小结(1)不同反应条件对美拉德反应产物鱼味香精的滋味品质以及电子舌各传感器响应值间具有极显著影响。(2)BP．ANN法建立的模型明显优于PLS法，说明电子舌传感器的响应值与美拉德反应产物感官评分值之间的关系是非线性的；校正集中Rc为0．9938，R3程EC为0．1248，用独立样本检验模型精度，预测集中却为0．9713，RMSEP为0．2705，表明BP．ANN是一种有效评价美拉德反应产物滋味品质的建模方法。O5O5O5O5O21O4—04＆墨纛瓤O5O$O5O5e¨“舳¨甜糍答嚣霹 江苏大学硕士学位论文5．1主要研究成果第五章工作总结及展望本文主要对草鱼鱼味香精的制备技术进行了研究，包括酶解和美拉德反应两步，并对产物的氨基酸和挥发性成分进行了分析，再用电子舌技术结合人工感官评定建立了评价美拉德反应产物滋味品质的BP．ANN模型，主要研究结果如下：(1)理化分析表明，新鲜草鱼肉蛋白含量高，富含必需氨基酸和鲜甜味氨基酸，是制备鱼味香精的优质原料。(2)用风味蛋白酶水解草鱼肉，以水解度为指标，通过单因素和响应面优化试验，确定了风味蛋白酶的最佳酶解条件为：液料比4．00mL／g、初始pH6．75、温度50．00。C、E／S18．50LAPU／g、水解时间7．80h，水解度为49．94％。在最优条件下进行验证试验，水解度为49．76+0．25％，实际试验值与模型预测值基本一致。说明建立的响应面模型对水解度拟合效果良好，能较准确的预测实际草鱼肉的水解情况。(3)在上述草鱼肉水解最佳工艺条件下，研究MaiUard反应的工艺条件，以感官评分综合值为指标，通过单因素和响应面优化试验，确定了酶解液Maillard反应的最佳条件为：在水解度为49．76％的水解液中添加3．00％葡萄糖、1．00％木糖、2．25％甘氨酸、0．75％精氨酸、0．25％VC及O．10％VBl，调节pH值到7、反应温度123℃、反应38min，还建立了感官评分综合值预测数学模型。最优条件下的感官评分模型预测值为8．9，试验验证值为8．8+0．5，与理论值相差不大，说明建立的数学模型拟合效果良好。(4)分析最佳工艺条件下制备的酶解液及鱼味香精中的呈味氨基酸。酶解液中总氨基酸含量为519．89mg／mL，游离氨基酸含量为263．97mg／mL，肽类氨基酸含量为255．92mg／mL；而鱼味香精中总氨基酸、鲜甜味氨基酸和肽类氨基酸的含量都有显著性提高，分别为861．02mg／mL、337．91mg／mL和523．11mg／mL，且肽类氨基酸占总量的比例为60．75％，肽类氨基酸含量较高，从而促使美拉德产物口感更佳。(5)分析最佳工艺条件下制备的酶解液及鱼味香精中的挥发性风味物质。 草鱼肉酶解液美拉德反应制备鱼味香精及其电子舌感官评定方法在酶解液中，共鉴定出51种成分，其中醛17种、醇9种、烃6种、酮3种、其他化合物16种。醇类、醛类和其他化合物的相对含量较高，分别为14．49％、17．76％和29．88％。但其他化合物的种类较少，以呋喃和酯类为主。Maillard反应制备的鱼味香精中，共鉴定出53种挥发性物质，其中有醇10种、醛11种、酮4种、烃3种、其他化合物25种。与酶解液中挥发性成分相比，Maillard反应产物中其他化合物的种类明显增加，由4种增加到8种，增加了酰胺类、吡嗪类、嘧啶类和噻唑类，比例也提升，占到总量的35．48％。与酶解液的风味相比，美拉德反应产物的风味更怡人。(6)利用电子舌技术快速评价美拉德反应产物鱼味香精的滋味品质。样品选自美拉德反应响应面优化条件组，除去中心试验重复组，共有13类不同的反应条件，以这13类条件下生产的鱼味香精作为样品，每类制备10个样，共130个样品。从130个样品中选取87个作为校正集，用于建立校正模型，剩余43个作为预测集，用于验证模型准确度。单因素方差分析结果表明：不同反应条件对美拉德反应产物的滋味品质以及电子舌各传感器响应值间具有极显著影响。采用PLS法和BP．ANN法建立相关模型，结果表明BP．ANN法建立的模型明显优于PLS法，说明电子舌传感器的响应值与美拉德反应产物感官评分值之间的关系是非线性的；校正集中皿为0．9938，RMSEC为O．1248，用独立样本检验模型精度，预测集中助为0．9713，RMSEP为0．2705，表明BP．ANN是一种有效评价鱼味香精滋味品质的建模方法。5．2工作展望(1)对Maillard反应机理做更深入的研究，从而能更好得控制Maillard反应过程，制备风味更佳的热反应产物；(2)在检测出呈味氨基酸及挥发性风味成分的基础上，深入探讨每种呈味及挥发性物质对产品的滋味及风味的贡献程度；(3)对制备的鱼味香精进行安全性评价以及毒理学试验的论证。 江苏大学硕士学位论文[1】[2】【3】[4】【5】[6】【7】参考文献董金和．{2013中国渔业统计年鉴》解读[J】．2013，(7)：19—20．李玺洋．草鱼形态性状对体质量影响效果分析及生长相关SNP位点筛选【D】．硕士论文．武汉：华中农业大学，2012．刘然．半干草鱼制品开发及其贮藏稳定性研究[D]．硕士论文．杭州：浙江工业大学，2012．．林江星．中国水产品加工业发展现状探讨分析[J】．2012，(8)：28．28．李雪，尤娟，罗永康．草鱼肉蛋白酶解物功能特性及质量控制的研究【J】．2011，(2)：81—84．RenJ，ZhaoM，ShiJ，et．atOptimizationofantioxidantpeptideproductionfromgrassc即sarcoplasmicproteinusingresponsesurfacemethodology[J]．2008，41(9)：1624-1632．WasswaJ，TangJ，GuX-h，etatInfluenceoftheextentofenzymatichydrolysisonthefunctionalpropertiesofproteinhydrolysatefromgrasscarp(Ctenopharyngodonidella)skin[J]．2007，104(4)：1698—1704．徐锦，李明元．草鱼蛋白酶解及脱腥脱苦工艺研究[J】．2012，(01)：45—47+50．李雪，罗永康，尤娟．草鱼鱼肉蛋白酶解物抗氧化性及功能特性研究【J]．2011，16(1)：94．99．任娇艳，赵谋明，崔春，等．草鱼源抗氧化肽的响应面法优化制备及活性评价[J]．2009，30(7)：69-73．LiX，LuoY，ShenHetatAntioxidantactivitiesandfunctionalpropertiesofgrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)proteinhydrolysates[J]．2012，92(2)"292—298．李雪，罗永康，尤娟．草鱼鱼肉蛋白酶解物抗氧化性及功能特性研究[J】．2011，16(1)：94．99．封梅，覃楠，兰岚，等．酶法水解鱼蛋白制备鱼降压肽的工艺研究【J】．2008，(3)：126．128．李露，王金水，韦志彦．鱼味香精的生产现状及发展研究【J】．2009，34(4)"22．24．陈坤，宋焕禄．鱼味香精的研究概况及其应用【J】．2004,22(2)：1．4．刘安军，魏灵娜，曹东旭，等．美拉德反应制备烧烤型虾味香精及气质联用分析【J】．2009，25(6)：674-680．刘玉平，孙宝国．我国食用香料香精的基本状况与发展趋势[J】．2004，2．5(10)"373—375．艾淑宏．调配型牛肉香精的配制【J】．2006，(8)122．23．肖作兵，杨斌，王婷婷．脂肪控制氧化制备鸡肉香精前体物的工艺研[J】．2008，(1)．41．43．廖劲松，齐军茹．Maillard反应与食品风味物质热反应肉类香精的研【J】．2005，(03)：51—54．汪海波，刘大川，李永明，等．酸水解法提取大豆异黄酮甙元工艺研究[J】．2003，24(4)：98．101．王凤祥．罗非鱼酶解热反应制备鱼味香精的研究[D】．硕士论文．浙江：华南理工大学，2011．刘军波，姜慧燕，邱静，等．酶在淡水鱼加工中的应用[J】．2011,17(23)：1．8．吴绍武，刘章武，唐婧苗．鱼蛋白酶水解多肽研究进展[J】．2009，28(2)：29—31．SS，，川U刁习伽习印刀踟明∞U刁习卅隋pn口阻nnn口眩口口p 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