微生物菌剂对玉米秸杆堆肥效果影响的研究

摘摘要要我国秸秆产量约在7亿吨左右，但秸秆利用效率极低，相当大一部分秸秆被肆意焚烧、废置，造成严重的环境污染与资源浪费。目前秸秆在农业上的利用方式多为直接还田，但由于寒地土壤秸秆还田分解速度慢和导致土壤温度降低，影响作物生长，所以导致秸秆还田的比例一直比较低。秸秆堆肥作为一种固体废物减量化、资源化的有效途径，其腐熟过程是在微生物群落结构演替的动态过程中进行的。本试验以玉米秸秆为堆肥原料，施加有利于纤维素降解的真菌与生物表面活性剂制成的混合菌剂，研究其对堆肥的改良效果，以期为复合菌剂直接施入农田，加速秸秆分解和秸杆还田改良土壤提供依据。本实验以玉米秸杆为堆肥原料，分5组施入不同生物菌剂堆肥：不施加任何菌剂（CK），施入生物表面活性剂（BS），施入生物表面活性剂与纤维素分解菌A（BN），施入生物表面活性剂与纤维素分解菌B（BG）和施入生物表面活性剂与纤维素分解菌A+B（THREE）。堆肥时间27天，定期取样测试微生物数量与酶活性等指标变化。所有堆体温度最高为BN处理，在第10天达到55℃，其次为THREE处理在第10天达到54.3℃，CK的最高温度在第4天达到52.8℃。添加菌剂有助于堆肥温度的提高，而堆体温度的升高有利于加速秸杆的腐熟。添加菌剂的处理，细菌数量明显高于不填加菌剂的处理；堆肥过程中真菌数量呈现先升高再降低的趋势，于3-5天达到最大，然后随着堆体营养物质消耗，真菌数量随之减少，堆体内真菌数量在一定时期内可以稳定在107CFU·g-1；THREE处理的真菌数量在第三天达到108CFU·g-1，为所有处理中最高；生物表面活性剂处理的真菌数量并未明显低于其他处理，与施入的生物表面活性剂量有关。添加微生物菌剂对堆肥的微生物数量、纤维素酶活性、半纤维素酶活性、漆酶活性、纤维素、半纤维素、木质素的降解率均有显著的促进作用；纤维素分解菌对纤维素、半纤维素和木质素的降解起主要作用，添加一定量的生物表面活性剂对纤维素分解菌不会起到抑制作用，还能在一定程度上激发纤维素分解菌的活性；添加微生物菌剂在一定程度上降低了堆肥过程中的TOC值和碳氮比，秸杆腐熟后碳氮比在20左右，可以直接用于田间；生物表面活性剂初期对酶活性产生了抑制作用，但随后转为激发作用，总体来说表面活性剂的加入对促进堆肥中酶的活性有益。关键词堆肥；秸杆；纤维素分解；生物表面活性剂；腐熟I AbstractEffectsofMicrobialAgentsonMaizeStrawDecompositionAbstractThestrawyieldofChinaisabout7millionton/year,butthestrawutilizationefficiencyisverylow,alargepartofthestrawhavebeenfreereinburnedthatresultinginseriousenvironmentalpollutionandwasteofresources.Atpresenttheuseofstrawinagriculturemoredirectcompostmadeofstalksappliedtofarmland,butcompostrateofcoldsoiltoolowleadtotherateofstalksappliedtofarmlandStrawcompostisaefficientwayofsolidwastereduction,resource.Theessenceofcompostisasuccessionofmicrobialcommunitystructureofdynamicprocess.Woodcellulosethatinthestrawisthemainmaterialforcomposting,thecompostingprocessofcelluloseistheroleofmicrobesandtheirenzymessecretedcarriedout.Inthisstudy,maizestrawiscompostmaterials,cellulosedecompositionbacteriaandbiosurfactantproducedmixedmicrobialagenttostudyeffectofmicrobialagentontheimprovementofcomposting,withaviewtospeeduptherateofstrawcompostingandimprovedtechnologiesofcompostmadeofstalksappliedtofarmland.Thecornstrawcompostingprocess,towhichdifferentbio-microbialagentwasintroduced:blank(CK),biosurfactant(BS),bio-surfactantandcellulose-decomposingbacteriaA(BN),bio-surfactantandcellulose-decomposingbacteriaB(BG),biosurfactantandcellulose-decomposingbacteriaA+B.atregularintervalstakesamplesfortestthechangeofmicrobialbiomassandenzymaticactivity.BNwasthehighesttemperatureofcompost,onthe10dreached55℃。The2ndtemperaturewasTHREE,onthe10dreached54.3℃.ThehighestofCKis52.8℃onthe4d.Thisshows:Addagentscontributetotheimprovementofcompostingtemperature,Highercomposttemperaturewillhelpspeedupthecompostingstrawandkillharmfulbacteriaandparasitesincomposting.Thenumberofbacteriainthetreatmentthataddedmicrobialagentsishigherthanthenumberofnobiologicalagents;Thenumberoffungifirstincreasedandthendecreased,fungirapidpropagation,in3to5daysmaximum,andthenwiththepilebodynutrientconsumption,thenumberoffungidecreased,thenumberoffungiinsidethereactorbodycanbestabilizedincertainperiodoftimeinthe107CFU·g-1;thenumberoffungiinTHREEtreatmentinthethirddaytoreach108CFU·g-1isthehighestforalltreatment.ThenumberoffungiinBSwasnotsignificantlylowerthanothertreatments,thatwasappliedtothebiologicalsurfaceactivedose.Microbialagentssignificantlypromotedmicrobialbiomass,cellulaseactivity,hemicellulaseIII 东北农业大学理学硕士学位论文activity,laccaseactivity,cellulose,hemicellulose,lignindegradationratesofcomposting;Cellulosedecomposingbacteriaplayamajorroleoncellulose,hemicelluloseandlignindegradation;Biosurfactantsdidnotinhibitioncellulosedecompositionbacteria,butsomeextentstimulateactivityofcellulosedecompositionbacteria;MicrobialagentstosomeextentreduceTOCandC/Ninthecompostingprocess,C/Nisabout20afterstrawdecomposition,canbedirectlyusedforthefield;Biosurfactantsinhibittheenzymeactivityatfirst,butthentostimulatetheenzymeactivity.Overallsurfactantitwillbeausefulactivityforcomposting.Keywordscompost;straw;cellulosedecomposition;bio-surfactant;maturityCandidate:MengJieSpeciality:EcologySupervisor:Prof.WanghongyanIV 研究生学位论文独创声明和使用授权书独　创　声　明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。　　学位论文作者签名：　日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导　师　　签　名：日期：日期：年年月月日日 前言1前言1.1菌种概述1.1.1生物表面活性剂概述一类新型表面活性剂近年来引起了大家广泛的关注，它是微生物在特定条件下培养时，其代谢过程中分泌产生的某些具有一定表面活性、集亲水基和疏水基结构于一分子内的两亲化合物，被称为生物表面活性剂（Biosurfactants）（左晶等，2005；KosariCN，1993）。生物表面活性剂是一种由细菌、酵母和真菌等微生物在某一特定环境培养条件下通过发酵，分泌出的具有表面活性的一种代谢产物。用于发酵而产生的生物表面活性剂的菌种大致有3类：第一类是严格以烷烃作为碳源的微生物，如棒状杆菌(Corynebacteriumsp)；第二类是以水溶性底物为碳源的微生物，如杆菌(Bacillussp)；第三类既可以用烷烃又可以用水溶性底物作为碳源的微生物，如假单胞菌(Pseudomonassp)。生物表面活性剂的分子结构是由两部分构成，一部分是由疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、氨基酸、肽和磷酸基等构成；另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等构成。生物表面活性剂的这种两亲性分子结构使其具有分散、加溶、润湿及渗透等功能。根据生物表面活性剂结构的特点，可将其分为糖脂、多糖脂、脂肽、脂蛋白以及中性类脂衍生物共五大类型（Ron等,2001）。同化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂具有更多明显的优势(Clifford等，2007)：（1）生物表面活性剂的化学结构更加复杂、庞大，单个分子占据的空间更大，因而表面活性及乳化能力更强。（2）生物表面活性剂的分子结构类型的多样性，具有许多特殊官能团，专一性较强，可用于一些特殊的领域。（3）生物表面活性剂本身是无毒的，在环境中能被微生物快速的降解，是绿色产品。（4）生物表面活性剂是通过生物发酵工艺制得的，生产工艺简单，可在常温、常压下进行，对生产设备的要求并不高。（5）合成生物表面活性剂的原料大多数为天然农副产品，如油脂、磷脂、蔗糖、脂肪酸、氨基酸、葡萄糖等，这些物质在自然界广泛存在而且价格比较低廉。（6）某些生物表面活性剂还具有抗菌性、抗病毒性及抗肿瘤性等药理作用和免疫功能。如：Rhodococcuserythropolis在含甘油的培养基中所产生的单琥珀酰海藻糖脂对HerpressimplexⅠ型病毒有很好的抑制作用（Kuyukina等，2005）。1.1.1.1产生生物表面活性剂的微生物来源1 东北农业大学理学硕士学位论文生物表面活性剂大多数由细菌、酵母菌、真菌（霉菌）等产生。通过微生物发酵法生产的生物表面活性剂的生产菌种大致可分为三类：第一类是严格以烷烃作为碳源的微生物，如棒状杆菌Corynebacteriumsp；第二类是以水溶性底物为碳源的微生物，如杆菌Bacillussp；第三类可以烷烃和水溶性底物两者作为碳源，如假单孢菌Pseudomonassp。表1列出了生物表面活性剂的种类及其微生物来源。表1-1生物表面活性剂的种类及其微生物来源Tab.1-1Thetypesofbiosurfactantsandmicrobial生物表面活性剂鼠李糖脂海藻糖脂槐糖脂纤维二糖脂脂肽粘液菌素枯草菌素短杆菌肽多粘菌素脂肪酸、磷脂多糖-脂肪酸混合物微生物来源举例铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)灰暗诺卡氏菌(Nocardiaerythropolis)球拟酵母(Torulopsisbombicola)茂物假丝酵母(Candidabigoriensis)玉米黑粉菌(Ustilagozeae)地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)荧光假单胞菌(P.fluorescens)枯草芽孢杆菌(B.subtilis)短芽孢杆菌(B.brevis)多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)热带假丝酵母(Candidatropicalis)1.1.1.2生物表面活性剂的现状人们最初对脂肽类生物表面活性剂发生兴趣，主要是因为它具有高效、低毒、无污染等优点，可以替代化学表面活性剂。近年来研究发现，生物表面活性剂除了具有表面活性的功能之外，还具有潜在的抗菌活性，包括抗真菌、抗细菌、抗支原体和抗病毒等活性，除此之外还可以用在免疫调节分子、粘合剂、疫苗及基因治疗等方面。脂肽类生物表面活性剂在生物控制制剂、新药特药、化妆品和保健品生产方面的应用均具有很好前景。生物表面活性剂作为一种天然的表面活性剂（牛明芬等，2005），其特性主要有（KosariCN等，1993；李祖义等，2001；易绍金等，2002；方长云等，2005）：表面张力显著降低，具有润湿、渗透、增溶、乳化、消泡、发泡、洗涤、去污等一系列表面性能；良好的热与化学稳定性；结构类型多种多样；无毒或低毒；可生物降解，减少甚至杜绝对环境造成污染和破坏；可从工业废物中产生，利于环境治理和资源的再利用；有一些生物表面活性剂还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等的药理作用和免疫功能。目前，生物表面活性剂的研究发展极为迅速，已广泛应用于石油工业、食品工业、造纸工业、生物医疗、环境工程等方面（Banatim，1995；李敬龙等，2004；PoojaS等，2004；SwaranjitSC等，2004）。Chabrabarty曾报道由Pscndomonasacruginosa生成的一种生物表面活性剂可以有效地将石油分散成水液滴，可以用2 前言于促进石油污染海岸的生物修复（ChenJ，1996）；生物表面活性剂在食品工业中可以作为乳化剂用于食品原料的加工，使其形成一定的浓度、质地和分散相，也可以用于面包和肉类生（向智男等，2005）；Mulligan等（MulliganCN，2001）用鼠李糖脂、莎凡婷和槐糖脂去除油污染土壤中有机态的铜和锌，取得很好的效果，4%的槐糖脂甚至可以去除100%的Zn2+；生物表面活性剂还被证明能够增强土壤中烃类的去除效率，能有效地降低土壤中的难溶有机物与水的界面张力（王伟等，2005）。生物表面活性剂的分子结构中具有极性基团和非极性基团，是一种中性两极分子。亲水基团可以是离子或非离子形式的单糖、二糖、多糖、羧基、氨基或肽链；疏水基团则是由饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或带羟基的脂肪酸组成。对于像蛋白质-多糖复合物等一些分子量较大的生物表面活性剂分子，其疏水和亲水部分可由不同的分子组成。生物表面活性剂能够在两相界面定向排列形成分子层，能降低界面的能量，即表面张力。大多数生物表面活性剂能够将表面张力减小至30mN·m-1。在决定界面的流变学特性以及在两相间物质传递方面起着十分重要的作用。生物表面活性剂大多具有良好的热及化学稳定性，如由地衣芽孢杆菌产生的脂肽在75℃时至少可耐热140h。生物表面活性剂在pH5.5-12之间可保持稳定，当pH小于5.5时，会逐渐失活（范立梅，2000）。生物表面活性剂与化学合成的表面活性剂相比，更具有优越性，其表现在反应产物均一，可引进新类型的化学基团，其中有些基团用化学方法是难以合成的；生物表面活性剂安全、无毒、生产工艺简单，在常温常压下即可发生反应。脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域的应用有重要前景，已成为当今研究开发的热点（JitemdraDD，1997）。1968年，Arima等（ArimaK，1968）首次发现了枯草芽胞杆菌菌株（Bacillussubtilis）产生的一种脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素（surfactin）。研究表明，自从被发现以来，表面活性素的表面活性一直是最强的，是迄今为止报道的效果最好的生物表面活性剂之一（KakinumaA等，1969；高学问，2003；李蔚等，2004；杨世忠，2004；吕应年；2004）。另外，脂肽类表面活性剂还被证明具有抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，可作为新型药物或用于保健食品中，必将具有更广阔的应用前景（PeypouxF，2005）。生物表面活性剂已经广泛应用于日常生活、工业、农业及高新技术领域，是现今最重要的工业助剂，它的应用已渗透到几乎所有的工业领域，被誉为“工业味精”。未来的生物表面活性剂的发展方向主要围绕在如何降低生产成本，扩展应用的范围，完善作用机理，消除可能造成的二次污染及提高活性的问题上，并且随着人们对环境意识的逐渐增强和生物表面活性剂研究的深入，“绿色表面活性剂”在堆肥过程中的应用将是发展趋势，前景广阔。1.1.1.3生物表面活性剂存在的问题随着深入研究，生物表面活性剂作为一种新型的表面活性剂，正在得到认可。但它也存在着严重的不足：一是生产成本高，资料表明生物表面活性剂的生产成本比化学表面活性剂的成本高3-10倍（MulligonCN等，1993）；二是生物表面活性剂在堆肥中的作用机理暂未形成完整的理论，它对微生物细胞、堆肥原料及环境介质的具体作用原理还不能进行明确说明；三是一些生物表面活性剂是否会造成二次污染，是否对环境及人类健康有危害还有待于进一3 东北农业大学理学硕士学位论文步考证；四是如何保持、提高生物表面活性剂的活性，加快对堆肥原料的降解速率，都需要深入研究；五是现有的生物表面活性剂应用还大多还局限在土壤及石油污染的生物修复等，其应用范围有待进一步拓宽。目前，生物表面活性剂生产的高成本影响了广泛应用，未来生物表面活性剂的兴衰决定于生产成本和使用收益之间的净的经济所得，深入的认识生物表面活性剂的生产途径、分子结构及功能间的关联，是工业发展的方向（左晶等，2005）。生物表面活性剂由于能够增强疏水性物质的亲水性和生物可利用性，已被用作生物修复技术的一种重要原料。但HOCs污染土壤的生物修复目前还是处于实验室研究和初步应用的阶段，还有许多问题未解决。如：生物表面活性剂大多处于实验室研究阶段，提取的成本较高，暂时还未进行大规模的工业化生产。据估计，目前生物表面活性剂的生产成本是化学表面活性剂的3-10倍（MulliganCN等，2005）。许多生物表面活性剂及其生产过程都有人申请专利，但迄今为止只有很少的一部分应用商业化。另外，人们对于它在污染现场的作用机理和作用过程认识的不足，也限制它的大规模应用。虽然生物表面活性剂已经开始直接应用于原油的生物修复中，但还未能确定由营养物诱导现场产生的微生物群落生成的生物表面活性剂在增强污染海岸的原油生物利用及生物降解过程中所起的作用。今后需要通过发展生物学工艺及菌种选育技术来发展出一种低成本、高产率的生产工艺来促进生物表面活性剂的生产；在实际应用过程中，应当加强对生物表面活性剂结构和其在污染现场的作用过程和作用机理的研究；对不同种类的HOCs培养对应的生物表面活性剂进行研究，以最大程度地提高利用率。由于生物表面活性剂产量较低，而生产成本较高，大规模的工业应用暂时还未能实现，在价格上很难取代化学表面活性剂，因而推广应用受到限制。而在制药和治疗方面，作为抗菌药物、抗真菌、抗病毒制剂，通常具有使用剂量低、活性高的特点，可弥补成本高的问题。另外，随着生物工程的发展和生物技术的不断进步，人们对于脂肽类生物表面活性剂，特别是对产生菌株的研究不断深入，有望在将来可大规模的应用具有商业价值的脂肽类物质。开发生物表面活性剂的应用潜力，降低它的生产成本是当前研究开发的热点和主要目标。决定生物表面活性剂生产成本的主要因素有：原料、发酵工艺和下游技术等。因此解决问题的途径有如下三种：一是通过选育高产菌株、构建基因工程高产菌；发展快速检测表面活性剂高产菌株并评价其潜力的方法；二是通过寻找廉价发酵原料、改进发酵工艺、用先进的下游技术等方法提高生物表面活性剂的发酵产率和提取得率，从而大大降低生产成本；三是利用生物表面活性剂的特殊性，开发出它的二次产品，提高其附加值（赵明梅等，2007）。1.1.2秸秆分解菌降解粗纤维的机理秸秆分解菌能分解粗纤维，主要是因为它能够产生各种分解粗纤维的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶等。（1）纤维素酶1950年Reese等曾经阐明了没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能够分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，4 前言因此提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C1-Cx假说，这个假说认为：当纤维素酶作用时，首先对纤维素的C1组分起作用，继而使Cx组分变成纤维低聚糖，再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。Wood在研究木霉（Trichodermareesei）、青霉（Penicilliumfuniculosumde）的纤维素酶水解纤维素时，发现培养液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同作用，Faterstam也发现两种外切酶（CHIⅠ和CBHⅡ）具有协同作用，Kanda等还发现了只是对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡萄糖酶在结晶纤维素的水解过程中也具有协同作用，协同作用一般认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位，形成葡萄糖，一般地说，协同作用与酶解底物的结晶度成正比，当酶组分的混合比例与霉菌发酵滤液中各组分比相近时，协同作用最大，不同菌源的内切与外切酶之间也具有协同作用。纤维素的生物降解过程涉及到了一族复合的纤维素酶，一般认为它包括三种成分：一种是内切β-1.4-葡聚糖（endoglucanase，EC3.2.1.4）简称为内切酶，也称为Cx酶；一种是外切β-1.4-葡聚糖水解酶，即外切型葡聚糖酶。EC3.2.1.91，也称C1酶外切酶；另一种是β-葡萄糖苷酶即EC3.2.1.21，也称纤维二糖酶，纤维素的降解必须依靠以上三种组分的协同作用才能完成。纤维素酶主要有3个来源：一是微生物来源，主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细菌、放线菌和一些原生动物；二是动物性来源，利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶的粗酶制剂；三是生物工程来源，迄今人们已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了纤维素酶基因，并构建了这些酶的基因文库。目前使用最广泛的饲用纤维素酶包括绿色木霉、里氏木霉、根霉、青霉、反刍动物瘤胃细菌和嗜纤细菌等，其中绿色木霉、白腐真菌的应用最为广泛。纤维素酶水解纤维素的机理现已普遍接受协同作用理论，如何提高酶解效率及其它因子对纤维素酶水解纤维素的影响是这方面研究比较活跃的领域，李传友等以木霉201、79、9A3和1096产生的纤维素酶影响水解木屑若干因子的研究提出，粉碎处理法对于提高酶解效率具有很大的潜力，提出碱处理优于酸处理；同时还指出提高酶解率的主要途径是寻求某种有效的方法，把对酶亲和力小的木屑转变为对酶亲和力大的底物，黄彬汉报道在培养物中添加诱导物或激活剂，如纸浆粉末纤维二糖、槐糖、乳糖、龙胆二糖、纤维二糖八醋酸脂、聚乙二醇抗坏血酸、醋酸铵及一些表面活性剂对于提高纤维素酶活力有促进作用。另外，根据国内外的实验报道，应用磷酸脂甲盐、油酸钠、吐温（20、40、60、80）、平平加、F68巨聚、209、Tx10、烷基磺酸钠、FAE等多种表面活性剂进行试验，证实多数有不同程度的效果。采用丙二醇、聚氧丙烯、聚氧乙烯醚（简称聚醚）作为纤维素酶的激活剂，应用0.4%的添加量，平均每株提高CMC酶活力45.5%，聚醚既有增加酶活力作用，又有消泡作用，用量少、作用强。王冬等研究了ATP及cAMP在纤维素酶合成调节中的作用，通过严格控制葡萄糖浓度可使胞内ATP含量始终处于能起阻遏作用的水平以下，从而可能获得纤维素酶的持续生产。纤维素酶活力的测定结果会受多种因素的影响，尤以底物浓度、反应温度、稀释倍数影响最大、DNS用量、底物性质、反应时间也都会有明显的影响，酶活力是用酶所催化的化学反应速度来表示的，但在实际测定中常常与所用的测定方法、底物特性、催化反应条件和DNS与糖反应条件等因素有关。因而采用不同的测定方法则会有不同的结果。目前纤维素酶活力的测定，仍存在方法和单位表示不统一的问题。为了今后能统一单位，各方应依据该酶的特5 东北农业大学理学硕士学位论文性，综合考虑，以便将有关的因素恒定在最适当的数值范围内，制定出统一的分析方法，这样才有可能将来源不同的同种酶制剂加以比较。酶活性是指在一定条件下酶所催化反应的速度。在一定的温度条件下，一定酶液用量和酶反应时间对测定结果的影响比较大，底物浓度与酶液用量的影响都遵循反应动力学原理。在底物浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度的增加成正比关系、底物浓度过高时，由于高浓度底物的抑制作用，酶促反应的速度反而会下降，酶解反应时间的选择，由酶促反应速度曲线可见，反应速度随着反应时间延长，酶促反应的速度下降，这主要是因为随着反应进行，底物浓度降低，产物浓度的增加，从而加速了逆反应的进行，因此，为了准确地表示出酶活性，需采用初速度来表示，试验结果证明酶解时间为30min为宜；酶液稀释度的选择应根据标准曲线，将吸光度A控制在0.3-0.7的范围内；显色时间控制为5min可以得到较稳定的测定值；酶解温度宜选用酶反应的最适温度40℃。（2）半纤维素酶半纤维素结构较为复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖和木葡聚糖等多种组分，而其中又以木聚糖和甘露聚糖与食品、饲料及制浆造纸工业关系最大。β-甘露聚糖酶，水解甘露聚，木聚糖酶，水解木聚糖。这两类酶均是内切型酶，可随机切断主链内糖苷键而生成寡糖，然后再由不同的糖苷酶（β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶或木β-糖苷酶）以外切型机制作用于寡糖。半纤维素酶的来源于能够产生木聚糖酶的菌种包括细菌、真菌、黑曲霉、木霉等，关键是要选择合适的诱导底物和最佳的培养基组成。丝状真菌可以分泌胞外木聚糖酶且产酶水平高于酵母和细菌，但其产木聚糖酶的同时也产纤维素酶。以木聚糖为碳源从而有选择性地生产木聚糖酶在木霉属和曲霉属微生物已获得成功。廉价的半纤维素物质比如玉米秆、麦麸、米糠和稻秆对于某些特定微生物菌株（Aspergillus-awanori,Penicilliumpurpurogenum和耐碱耐热型杆菌NCIM59）产生木聚糖酶是非常合适的。（3）木质素酶木质素的降解酶系是一个非常复杂的体系，其中最重要的木质素降解酶有三种：木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）。另外还有芳醇氧化酶AAO）、乙二醛氧化酶（GLOX）、葡萄糖氧化酶、酚氧化酶、过氧化氢酶等都参与了木质素的降解或对其降解产生一定的影响。1.1.3复合微生物菌剂概述1.1.3.1复合微生物菌剂的应用前景（1）复合微生物菌剂在种植中的应用前景复合微生物菌剂中的光合菌群，不仅仅在叶子上，而且在土壤、在水中都可以利用太阳热能，它可以合成抗氧化物质、氨基酸、糖类和各种生理活性物质来促进植物的生长，还会使土壤中的其它有益微生物活跃壮大起来，抗氧化物质使有机肥料不臭而发出香味，使植物根部的活力加强，提高吸收养分的能力。复合微生物菌剂中微生物的群体连携作用，可改善土壤环境，抑制有害微生物，丰富有益微生物，形成再生机制，溶解磷、钾、固氮，使能量6 前言立体化汇集，并改善土壤的酸、碱、粘、沙和易涝、易旱等不良性质，促进团粒化，提高土壤的保水和透气性能。复合微生物菌剂群分泌与合成的物质如各种有机酸、氨基酸、活性激素、抗氧化酵素等，可直接促进植物生长，还能分解残留的农药，使土壤还原于抗氧化状态，充分发挥农作物在良性状态中惊人的生长能力。（2）复合微生物菌剂在水产业中的应用前景复合微生物菌剂渗入水体后，能抑制病原微生物和有害物质，调整养殖生态环境，提高水中溶氧量，促进养殖生态系中的正常菌群和有益藻类活化生长，保持养殖水体的生态平衡，拌入饵料投喂，直接增强鱼类的吸收功能和防病抗逆能力，促进健壮生长。复合微生物菌剂中的光合菌还能利用水中的硫化氢、有机酸、氨及氨基酸兼有反硝化作用消除水中的亚硝酸铵，从而净化养殖池中的排泄物和残饵，改善水质，减少鱼病。（3）复合微生物菌剂在环境保护中的应用前景利用微生物治理污水和城市生活垃圾是今后环保产业的主攻方向。作用机理是以光合菌群和酵母菌群为主导，协同其它有益微生物共同作用，产生抗氧化物质，通过氧化还原发酵等途径，分解氧化有机物，把有害有毒转化为无害无毒，变有害为有用。在厕所去臭、生活垃圾利用、生活和工业废水治理等环保领域，应用前景广阔且成本低廉。（4）复合微生物菌剂在养殖业中的应用前景复合微生物菌剂掺入饲料和饮水进入动物肠道后，与肠道内有益菌一起形成强有力的优势种群，抑制和消灭致病菌群，同时分泌、合成大量氨基酸、蛋白质、维生素、促生长因子等营养与激素类物质，以调整和提高畜禽机体各器官功能，提高饲料转化率，对畜禽产生免疫、营养、生长刺激等多种作用，达到防病治病、提高成活率、促进生长和繁殖、降低成本、消除粪尿臭味、净化环境、增产增收等明显效果。1.1.3.2复合微生物菌剂存在的问题复合微生物菌剂作为一种高效生物菌剂，随着深入研究正在逐步得到认可。但它也有不足：一是生产成本高；二是一些复合微生物菌剂是否会造成二次污染，是否对环境及人类健康有危害还有待进一步考证；三是如何保持、提高复合微生物菌剂的活性，加快对环境的影响，都需要深入研究；四是现有复合微生物菌剂的应用目前大多局限在养殖业中，应用范围有待进一步的拓宽。因此，未来生物表面活性剂的发展方向主要是围绕在降低生产成本，扩展应用范围，消除可能造成的二次污染以及提高活性问题上，并且随着人们对环境意识的增强和复合微生物菌剂在各行业研究的深入，复合微生物菌剂的应用前景将越来越广阔。1.1.3.3复合微生物菌剂在堆肥中的应用（1）作用机理目前，生物表面活性剂在堆肥中的作用机理（ZhangY等，1992；梁生康等，2006）并没有一个具体明确的解释，还处于探索的阶段。生物表面活性剂应用于堆肥过程的作用机理主要是涉及微生物细胞、堆肥原料、生物表面活性剂及环境介质之间的多种物理化学和生物作用过程，其具体作用过程可能是：①生物表面活性剂的脱附作用促进了有机物从堆肥颗粒上脱除进入堆肥间隙液相中，这样就间接减少了微生物的降解时间；②生物表面活性剂的乳化或增溶作用，有利于有机物的溶解和分散，增大了堆肥有机物与降解菌细胞的接触面积及可利用性，从而提高其生物可降解性；③生物表面活性剂可降低堆肥颗粒间隙液相的表面张7 东北农业大学理学硕士学位论文力，有利于有机物和菌体的传输，加强了堆肥有机物与菌体的接触，提高堆肥效率；④生物表面活性剂的渗透特性，促进了水分在堆肥颗粒中传输和分散，缩短水分渗透到堆肥深层的时间，而且生物表面活性剂良好的保湿性能，减缓了堆肥中水分的蒸发，有利于保持微生物的活性；⑤生物表面活性剂的抗菌、抗病毒等作用会对堆肥中的病原菌起到一定的去除作用。但是，堆肥的微生物、有机物及环境介质复杂多样，生物表面活性剂是否影响微生物的生长、微生物是否影响生物表面活性剂的活性、不同环境介质对生物表面活性剂的作用效果如何以及生物表面活性剂对不同有机物的降解是否起积极作用都需要大量实验来验证。因此，生物表面活性剂对固体废弃物堆肥的作用在形成完整理论之前，当前的研究还只是局限于某一种生物表面活性剂在堆肥中的试验效果。（2）应用展望：堆肥过程是利用微生物在一定温度、湿度和pH值的条件下，使固体废物中的有机物发生生物化学降解，形成一种类似腐殖质土壤的物质。随着城市人口的增多，传统堆肥方法的效率已不能满足要求。考虑到生物表面活性剂在土壤修复中表现出来的优越性，将复合微生物菌剂应用于堆肥过程，提高堆肥效率应该是可行的。其作用可能有以下几个：①复合微生物菌剂的解吸附作用有利于有机物从堆肥颗粒上脱除进入堆肥间隙液相中，再由微生物进行降解，这样也就间接的缩短了堆肥时间。②复合微生物菌剂的存在可能降低堆肥颗粒间隙液相的表面张力，有利于有机物和菌体的传输，使堆肥各个层面的有机物与菌体充分接触，必然会提高堆肥的效率。③加入复合微生物菌剂可能促进水分在堆肥颗粒中传输和分散，使水分在较短的时间内渗透到堆肥的深层，而且复合微生物菌剂具有良好的保湿性能，能够减缓堆肥中水分的蒸发，有利于长时间保持微生物的活性。（3）堆肥化技术的发展趋势研究发现多数堆肥中N、P元素的含量大大高于土壤，但其可利用率较低；K的可利用率虽高于许多钾化肥，其含量却低于大多数土壤；有研究发现城市固体废弃物堆肥中绝大多数微量金属的含量低于美国环保局规定的允许值，但高于大多数农业土壤。堆肥质量的某些不足正是堆肥销路不畅的本质原因之一。因此，提高堆肥质量，进一步开发利用堆肥产品成了未来堆肥得以进一步发展的重要途径。考虑到堆肥化技术是以微生物为媒介的生物化学过程。因此为缩短发酵时间，提高产品肥效，稳定产品质量，实现工业化生产规模，选择、培育能提高堆肥速度的菌种，发展高效生物肥，是堆肥化技术的探索方向之一。有关研究发现，白腐真菌对含苯环的有毒污染物有很强的耐受和降解能力。因此，培养这类真菌投放到堆肥中，可以增强对有害废物的处理能力，拓宽堆肥原料的来源，消除有毒有害化学物质混入垃圾后给堆肥带来的影响，提高堆肥产品质量。为提高堆肥产品质量，进一步开发堆肥产品，将堆肥工艺与其他方法结合起来，即在好氧堆肥过程中利用家蝇、蚯蚓等生态链将是新的研究内容。另外，有研究表明，生物表面活性剂的加入，能改善堆肥的微环境，提高堆肥效率，缩短堆肥周期。因此，将生物表面活性剂加入，可能是堆肥未来的发展方向。总之，无论是从理论上还是从实践上都表明，堆肥化技术将再次显示威力，成为对有机固体废物进行无害化、资源化、减量化切实可行的好办法，在世界各国特别是发展中国家将大有发展前途。8 前言1.2国内外研究动态1.2.1生物表面活性剂的研究进展在20世纪40年代，Zobell在研究硫酸盐还原细菌从沙粒中释放原油之机制时指出：由微生物产生表面活性剂是细菌驱油之主要机制之一。1957年，捷克的Dostalek和Spumy把脱硫弧菌（Desulfovibrio）和假单胞菌同糖蜜一起注入油层，使原油产量提高。他们认为：可能是由细菌产生的表面活性物质，而改变了岩石-油-水三相系统的界面张力所致。20世纪60年代后，石油工业开始发展，微生物对烃类物质的乳化机制引起人们的关注。在北美，许多规模较大的石油公司及跨国化学公司都致力于研究、开发这种生物表面活性剂，把研究重点放在了用微生物法生产表面活性剂、助表面活性剂以及其在微生物采油中的应用中。到目前为止，已经有了很多该方面专利，一些产品已经商业化，而且其性能完全可与化学合成的表面活性剂相媲美（ArimaK等，1968）。对提取的微生物表面活性剂的研究集中于结构、性能、生物合成及调控等方面，1976年，Zajie和Panchal综述了微生物乳化剂的来源及特性，预测了它的应用潜力。1980年，Cooper和Zajie评述了微生物表面活性剂的化学特性。1984年，Zajie和Seffens阐述了关于微生物表面活性剂的理化性能。1991年，Vander等进行了轴对称液滴分析（ADSA）非常有效，其它的较简单的方法有快速液滴破裂实验、产表面活性剂菌落的薄层层析及比色法检测解烃细菌与产鼠李糖脂的细菌。近年来研究热点是发展快速检测表面活性剂高产菌株并评价其潜力的方法。用微生物发酵法生产表面活性剂是在70年代后期发展起来的。加拿大、英国、德国、前苏联等国家主要研究并开发各类新型生物表面活性剂、寻找最佳生产条件，表面活性剂结构剖析与改性，物化性能的测试，室内驱油物理模拟等。Zajie实验室的几个产品已商业化。Singer实验室选育的一种细菌，以正构烷烃作为唯一碳源，产生了一种胞外和胞内糖脂型表面活性剂，可使重油粘度降低95%以上，形成了稳定的水包油乳状液（姜成林等，2001）。李祖义教授多年以来与全国各大油田和科研院所积极合作，为各研究部门提供相关技术帮助，一直从事于用生物表面活性剂在三次采油中应用的研究（中村义夫鉴修，1973；原田笃也等，1974），对我国生物表面活性剂研究及应用起到了较大的推动作用。薛燕芬等（李祖义等，2001；马歌丽等，2003）对石蜡酪杆菌B126产糖脂的适宜条件和糖脂理化性质进行了研究。1998年，华兆哲等（李祖义等，2002）对使用假丝酵母（Candidaantarctic）生产生物表面活性剂及降解正构烷烃进行研究。张翠竹等（李祖义等，1999）研究地衣芽饱杆菌（Bacilluslicheniformis）和假单胞菌（Pseudonomassp）代谢的糖脂和脂肽类生物表面活性剂结构和理化性质。从上个世纪末开始，我国关于生物表面活性剂方面的研究者逐年增加，不断出现在使用生物表面活性剂对原油进行三次开采的现场试验报道（薛燕芬等，1995），湖南大学的曾光明等人将生物表面活性剂应用到了环境修复与加速堆肥进程中，得到了良好的效果（曾光明等，2009）；我国目前已取得有关生物表面活性剂的研究的专利（薛燕芬等，1996；华兆哲等，1998）。9 东北农业大学理学硕士学位论文通过结构筛选和计算机模拟等手段，生产特定用途和高附加功能的生物表面活性剂是将来研究发展的中心任务。在目前的发展水平上，可通过改变脂肽的疏水基或人工合成相似结构的分子的方法来得到特种生物表面活性剂，一旦优选出高效的脂肽，研究的关键便是在于优化出最佳的生产条件和提纯方法，并找到与之相关联的应用领域。生物表面活性剂在生产、纯化、应用中的每一环节，结合其它学科和各种技术（模拟技术、纳米技术、生物技术等），也是目前发展趋势之一（Magali等，2004）。生物表面活性剂的快速应用是从20世纪中期开始的。目前在环境修复中应用较多的有假单胞菌产生的鼠李糖脂（rhamnolipid）、枯草芽孢杆菌产生的莎梵亭（surfactin）及南极假丝酵母产生的甘露糖赤藓糖醇脂（MEL）等。由于生物表面活性剂的产量比较低且发酵液中的成分复杂，使得提取生物表面活性剂的成本比较高。目前，生物表面活性剂在工业规模的应用与化学表面活性剂相比是相对滞后的。近10年来，生物表面活性剂的生产技术已经大大的提高了，如鼠李糖脂的浓度已经超过了100g·L-1，而且在国外已经有了规模化的生产（Lang等，1999）。我国对生物表面活性剂的研究起步较晚，大多数正处于实验室研究阶段（马歌丽等，2003）。1.2.2纤维素分解菌的研究进展1.2.2.1白腐真菌目前，国际上研究最多并能表现出有效降解能力的白腐真菌是黄孢原毛平革菌（PhanerochaeteChrysosporium）。木质素经过白腐真菌降解后，大部分低质非蛋白氮（NPN）转化为较高质量的菌体蛋白，蛋白质品质（主要是氨基酸平衡）得到较大程度的改善。自然界中参与降解木质素的微生物种类有真菌、放线菌和细菌，而真菌则是最重要的一类。现已发现的可降解木质素的真菌有苍烟管菌（Bjerkandera）、鬼伞菌（Coprinus）、灵芝菌（Ganoderma）、香菇（Lentinula）、蜜孔菌（Pycnoporus）、平革菌（Phanerochaete）、侧耳菌（Pleurotus）、多孔菌（Polyporus）、射脉菌（Phlebia）等。根据真菌降解木质素时木材的变化，可将其分为白腐真菌（Whiterotfungi）、褐腐真菌（Brownrotfungi）和软腐真菌（Softrotfungi），白腐菌降解木质素的能力强于降解纤维素的能力，这类菌首先使木材中的木质素发生降解并且不产生色素，而后两者降解木质素的能力弱于降解纤维素的能力，它们首先开始纤维素的降解并分泌黄褐色的色素使木材发生黄褐变后，才能部分缓慢地降解木质素。由于白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，因此被认为是主要的木质素降解微生物。白腐真菌是已知的唯一的在纯培养条件下能够将木质素最终矿化的微生物，虽然褐腐菌、软腐菌、放线菌和细菌在木质素的降解过程中也能发挥一定作用，但一般被认为它们仅起二次性的作用，因此，白腐真菌已成为目前研究木质素降解的首选微生物，它们通过分泌漆酶（Lacs），木质素过氧化物酶（LiPs）、锰过氧化物酶（MnPs）、纤维素酶（Cels）和半纤维素酶（Hcels）等降解植物的生物质。白腐真菌侧耳属（Pleurotussp）被发现具有自身合成能力并具有分泌多种木质素降解酶的能力，因此深入研究白腐真菌木质素降解酶活性对开发和利用富含木质纤维素的秸秆资源10 前言具有重要的意义，木质素的分解是一个复杂的生化过程，涉及一系列酶的协同作用，不同酶的活性高低可能与它们在木质素分解中作用的大小和不同分解阶段中的作用顺序有关。木质素的生物降解酶主要有多酚氧化酶和木质素过氧化物酶漆酶等。白腐真菌的降解活动只发生在次生代谢阶段，与降解过程有关的酶只有当一些主要营养物质如氮、碳和硫限制时才能形成。白腐真菌在对营养限制应答反应时形成一套酶系统，包括以下几种：（1）产生H2O2的氧化酶：一种是细胞内的葡萄糖氧化酶，一种是细胞外的乙二醛氧化酶，它们在氧分子的参与下各自氧化相应底物葡萄糖或乙二醛形成H2O2，从而激活过氧化物酶启动酶的催化循环。（2）需要H2O2的过氧化物酶：白腐真菌主要合成两类过氧化物酶-木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）。LiP是一系列含有Fe（Ⅱ）-卟啉环（Ⅸ）血红素辅基的同功酶，能通过单电子氧化并引起一系列的自由基反应，氧化富含电子的非酚类芳香化合物，能够使木质素大分子降解；MnP也是一系列含有血红素的同功酶，在Mn（Ⅱ）和H2O2存在时氧化大量酚类底物，这两类酶均在细胞内合成，分泌到细胞外以则H2O2为最初氧化底物。（3）漆酶、还原酶、甲基化酶、蛋白酶及其他酶，这些酶共同组成了白腐真菌降解系统的主体。木质素是一个以芳香族为基本结构的复杂聚合物，在自然界物质大循环中，它的降解主要是以微生物代谢中产生的酶做为催化剂，在常温常压下把复杂的不溶性聚合物转化成水溶性含有苯环的简单化合物，苯环最后破裂时产生简单的有机小分子。在微生物处理中，只有少数真菌能同时分解所有的植物聚合物。白腐真菌能以自由基为基础的链式反应对木质素进行降解，先是木质素解聚形成许多有高度活性的自由基中间体，继而以链式反应方式产生许多不同的自由基导致各种连接键断裂，使木质素解聚成为各种低分子量片段，其中小于1kf的占大多数，再经完全彻底氧化直到降解为CO2，这种自由基式反应是高度非特异性和无立体选择性的，正好对应于木质素结构的多变性完成这种异质大分子高聚物的瓦解。白腐真菌降解木质素的机理如下：在适宜的条件下，白腐真菌的菌丝首先利用其分泌的超纤维素酶溶解表面的蜡质，然后菌丝进入秸秆内部并产生纤维素酶、半纤维素酶、内切聚糖酶和外切聚糖酶降解秸秆中的木质素和纤维素，使其变成含有酶的糖类从而使秸秆变得易于消化吸收。其中关键的两类过氧化物酶LiP和MnP，在分子氧的参与下依靠自身形成的H2O2启动一系列自由基链反应，实现对木质素无特异性的彻底氧化，从而使秸秆变得易于消化。白腐菌降解木质素主要有三个特点：一是能彻底降解木质素生成CO2，而细菌至多将20%木质素碳转化成CO2；二是木质素降解主要是氧化反应，产物中不出现木质素单体；三是木质素降解本身不提供菌体生长和维持所需的碳源和能源，需要提供另外的碳源和能源供菌降解木质素。白腐菌降解木质素产物所含的碳、甲氧基、氢比相应原木质素少，而含较多氧、羰基、芳香性降低，α、β不饱和链烃增加，但分子量近似于原木质素。根据木质素降解产物分析，木质素降解可分以下几步：脱甲基和羟基化形成多酚结构；加氧裂解多酚环，产生链烃；水解使脂肪烃链缩短。为此可以设想酶系是在胞外或束缚于细胞壁上包括：过氧化氢H2O2产生的酶系；利用O2和H2O2的木质氧化酶系，以产生木质素自由基和醌；木质素活性中间体还原形成稳定单体的醌还原酶系；木质素小分子片段在胞内发生环开裂反应，分解产物经TCA环生成CO2。11 东北农业大学理学硕士学位论文1.2.2.2里氏木霉里氏木霉（Trichodermareesei）是一类好气菌，其菌落在PDA平板上生长快，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色、平坦、后期因产生分生孢子而呈深绿色。产孢区常排列成同心轮纹状，菌落背面无色，有的时候呈浅黄色，菌丝透明，有隔，细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出、无色、分枝多，对生或互生二至三级分枝，整体类似树枝，分枝与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶形，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺单胞，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。以里氏木霉为出发菌种。经过初筛、复筛、诱变后，固态法发酵或液体深层培养发酵生产纤维素酶，里氏木霉发酵生产的纤维素酶是胞外酶，经过粗提、分离纯化后，就得到了纯化的纤维素酶制剂。里氏木霉能用于纤维素酶生产在于它具备如下条件（鄢永琦等，1999）：里氏木霉生产纤维素酶产量要高。而且通过物理或化学诱变获取高产菌株；里氏木霉容易培养和控制，里氏木霉要求的生长环境粗放，适应性较强，易于控制，便于管理；里氏木霉产纤维素酶的稳定性较好。在通常的生产条件下，能够稳定的用于生产，不宜退化；里氏木霉产生的纤维素酶易分离纯化。其产生的纤维素酶是胞外酶，发酵完成后，纤维素酶容易与菌体分离纯化得到所需的酶；里氏木霉及其代谢物安全无毒副作用，不会影响生产人员和环境安全，也不会对纤维素酶的生产造成不良影响。1.2.3复合微生物菌剂的研究进展席北斗等（2003）针对城市垃圾和污泥的混合堆肥系统，应用了复合微生物群，使垃圾加速腐熟；李欣等（2008）研究了复合微生物菌剂与ZnSO4包衣处理对玉米幼苗形态及生理指标的影响。结果表明，复合微生物菌剂与硫酸锌包衣处理能明显促进玉米幼苗的生长发育。在干旱胁迫下，叶绿素和SOD的含量高于对照，脯氨酸的含量低于对照，表现出一定的抗旱性。硫酸锌包衣处理对玉米幼苗形态的影响较大，复合微生物菌剂包衣处理对玉米生理指标的影响较大；刘咏等（2008）进行了投加复合微生物菌处理垃圾渗滤液的试验研究。结果表明，在一定的好氧条件下处理渗滤液时，试验组和对照组的处理效果差异显著。试验组在最佳的好氧条件下可使COD的去除率达到72.15%，高于对照组26.13%。在好氧条件下处理渗滤液，试验组出水中小分子COD的比例高于对照组；熊小京等（2007）研究了复合微生物菌在污水生物处理工艺中的应用，实验表明复合微生物菌剂菌投加到污水生物处理单元时，可有效地强化微生物对DEF、GH和GI的处理效果，减少曝气时间以及污泥产生量，显示出复合微生物菌剂较好的经济性；王永科等（2006）进行了利用复合微生物菌剂处理皂素生产废水的试验研究，试验结果表明复合微生物菌剂好氧条件下废水CODcr去除率为82.1%，厌氧条件下废水CODcr去除率为62.5%，菌好氧处理效果在皂素废水处理上优于厌氧处理；谭兆赞等（2007）研究复合微生物菌剂对番茄青枯病和土壤微生物多样性的影响，实验表明施入复合菌剂后，能延迟番茄青枯病的发病时间并降低发病株率；12 前言1.2.4复合微生物菌剂在堆肥中应用研究现状：好氧堆肥的实质是在微生物作用下的生物化学反应过程（李国学等，2000；ShihoWakase等，2008），而这整个生物化学过程都是在酶参与下进行的酶促反应，微生物对有机物的分解代谢能力取决于酶的活性(TiquiaSM等，2002；PaolaCastaldi等，2008），堆肥底物越丰富多样，所需要的酶系统就越复杂而且越综合，不同的微生物分泌的酶种类不同（黄得扬等，2004）。因此，对堆肥过程中微生物及酶活性变化进行研究，有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响，从而为堆肥工艺的控制、微生物菌剂的应用提供了重要理论依据。复合微生物菌剂有机堆肥能够提高土壤细菌、真菌和放线菌的数量，在相同有机物料投入水平下，比传统堆肥更有效，且对细菌作用明显（阳文锐等，2006）表面活性剂，可以增加细胞膜的通透性，有利于细胞内外物质的交换，以及微生物的生长与产酶（张宇等，2009）。并且生物表面活性剂含有不饱和脂肪酸，有利于促进纤维素分解菌的脂肪氧化体系，以更好地催化降解木质素中的非酚结构（KennethA等，1996）。由中科院成都生物所、微生物所和清华大学等单位共同完成的“环境微生物菌剂研制及其在炼油与印染废水生物处理中的应用”项目通过了成果鉴定。该项目是在“863”计划及四川省重点攻关项目支持下完成的。首次实现生物模块与菌剂和助剂相结合的废水生物强化处理系统的微生物种群优化调控。通过菌剂的批量生产和示范工程的推广应用，实现了菌剂在重点行业废水治理中的高效、经济、安全应用，为菌剂的推广应用提供了设计与运行依据，产生了较显著的社会效益、经济效益与环境效益。堆肥化处理可减少占用土地、节约投资、充分利用废物资源且堆肥产品也有较好的市场（UtaK，2001；MarquesGA等，2002；马福刚等，2006）。堆肥中加入VT菌剂对过氧化氢酶活性没有影响；对脲酶、纤维素酶活性均有明显的提高；对转化酶不仅可提高其活性，还可以使其提前到达峰值；同时，它还能降低与堆肥腐熟呈负相关性的多酚氧化酶活性。这说明VT菌剂可以加快堆肥中有机质的分解和转化，促进堆肥腐熟（顾文杰等，2009）。戴芳等（2005）进行了生物表面活性剂在农业废物好氧堆肥中的研究。以富含难降解纤维素类的稻草秸秆和麸皮为堆肥原料，添加糖脂形式的生物表面活性剂——鼠李糖脂，进行了控温条件下的堆肥一次发酵。结果表明，添加鼠李糖脂能够改善堆肥处理的微环境，增强聚合物的水合程度，促进有机质降解，从而加快堆肥进程，提高堆肥产品品质。傅海燕等（2005）研究了生物表面活性剂对堆肥中含烃有机质降解过程的影响，以不同的生物表面活性剂鼠李糖脂及莎梵婷对被石油烃污染过的堆肥进行降解处理。结果发现，生物表面活性剂的加入可明显地提高堆肥中石油烃的降解效果，提高了堆肥效率，缩短了堆肥时间，试验证明：鼠李糖脂发酵液的效果比莎梵婷发酵液的效果好。王伟等（2005）进行了鼠李糖脂对铜绿假单胞菌在堆肥颗粒介质中吸附与传输影响的初步研究，以铜绿假单胞菌及其发酵生产的鼠李糖脂为研究对象，通过柱淋洗试验考察了不同浓度鼠李糖脂对堆肥颗粒中单一菌属铜绿假单胞菌吸附传输情况的影响。试验结果显示，一定浓度的鼠李糖脂能够有效地减弱细菌在堆肥颗粒介质中的吸附作用，增强细菌在介质中的传输和分散，使细菌得以传输到样品柱的更深层，13 东北农业大学理学硕士学位论文更利于深层堆肥有机物的生物降解。目前，生物表面活性剂在堆肥中的试验研究还处于起步阶段，这方面的文献资料还较少，大多还局限在对生物表面活性剂的综述方面。1.3目的及意义秸秆是一种生物质能资源，是当今世界上仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源，是唯一可再生的能源。但是我国秸秆资源45%-47%作为农村燃料，15%以烧荒形式烧掉，只有很少一部分过腹还田或直接还田。秸杆直接焚烧不仅污染环境，而且造成资源浪费。利用微生物发酵降解秸秆是肥料化的优良途径，但是秸秆直接还田，存在很多具体问题，如秸杆利用率低，不易腐烂，影响下茬播种，容易浮出土面飘的到处都是等，还有报道表明秸秆直接还田更容易引起作物烂根和病害。秸秆间接还田技术是将作物秸秆堆腐沤制后还田，包括秸秆堆腐、高温堆腐、秸秆腐熟剂堆腐等形式；秸秆作基料生产食用菌，再将废渣还田以及沼肥还田等。这些技术同样存在各种具体问题和不足，例如技术不成熟，效率不高，菌种不优良等。因此，为了修复退化的土壤，发展循环经济，实现可持续发展，必须研制一种高效优良的微生物菌剂。复合微生物制剂的应用，是将表面活性剂和纤维素分解菌按比例配制成复合微生物制剂用作秸秆的降解，将复合微生物菌剂均匀地施在新鲜秸秆表面，复合微生物制剂的用量为新鲜秸秆重量的4-5%。所采用的生物表面活性剂与纤维素分解菌是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样、腐烂的植物根部和牛场的堆肥中，经过富集培养、平板划线初筛、复筛而得到的。复合微生物制剂及其在作物秸秆的微生物降解中的应用为秸秆快速还田提供了一种模式，提高了农业废弃物生产有机肥的转化效率，利于退化土壤的修复，增加了土壤肥力。本试验采用的生物表面活性剂是从常年堆积的各种秸秆堆下面的土样和牛场的堆肥中，在低温培养条件下（5-10℃），经过细菌富集培养、血平板划线初筛、蓝色凝胶平板法复筛，筛选出具有表面活性的菌株，其在低温条件（0-10℃）下仍具有较低的表面张力（均小于35mN·m-3）。生物表面活性剂进行红外光谱鉴定，鉴定结果为菌株G3-6的代谢产物是糖脂类。1.4课题项目来源基金项目：国家“863计划”（2006AA10Z424）14 材料与方法2材料与方法2.1实验原料堆肥采用玉米秸杆，取自哈尔滨香坊牛场，风干后切割成5-7cm的小段。产生物表面活性剂的细菌，由本实验室研制，属于假单胞菌属（Pseudomonas）与土壤杆菌属（Agro-bacterium），所分泌的生物表面活性剂为糖脂类，共13株，本实验取菌液表面张力最小的三株（G3-6，G3-9，G2-16）进行实验。纤维素分解菌A，由本实验室分离保存，共3株，属于木霉属。纤维素分解菌B，由哈工大提供，共4株，真菌ZJ-005属于曲霉属、ZJ-007属于青霉属、ZJ-008属于木霉属、ZJ-009属于木霉属。2.1.1培养基（1）纤维素琼脂培养基（NH4）2SO42g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，Nacl1g·L-1，CaCO32g·L-1，琼脂20g·L-1。121℃，20min灭菌倒平板后，盖与平板大小一致的无菌滤纸（2）纤维素刚果红培养基K2HPO40.5g·L-1，微晶纤维素1.88g·L-1，MgSO40.25g·L-1，明胶2g·L-1，刚果红0.2g·L-1，琼脂14g·L-1，121℃，20min灭菌倒平板，培养结果观察：视纤维素分解菌是否产生水解圈及水解圈大小（3）赫奇逊培养液KH2PO41g·L-1，CaC120.1g·L-1，MgSO4.7H2O0.3g·L-1，NaCl0.1g·L-1，FeC130.01g·L-1，NaNO32.5g·L-1，pH7.2-7.3，分装成试管，内放滤纸条（1cm×6cm），121℃灭菌20min（4）羧甲基纤维素培养基CMC-Na15g·L-1，NH4NO31g·L-1，酵母膏1g·L-1，MgSO4.7H2O0.5g·L-1，KH2PO41g·L-1。（5）菌种保藏培养基（PDA培养基）：去皮马铃薯200g·L-1，葡萄糖20g·L-1，琼脂45g·L-1，加蒸馏水至1000mL。（6）选择培养基：愈创木酚10g·L-1，酒石酸铵0.1g·L-1，蛋白胨2.6g·L-1，MgSO4·7H2O0.5g·L-1，KH2PO41.0g·L-1，Na2HPO40.2g·L-1，琼脂18g·L-1，用于筛选。（7）液体发酵培养基：葡萄糖30g·L-1，酵母膏3g·L-1，（NH4）2HPO41.5g·L-1，KH2PO41g·L-1，MgSO4.7H2O0.5g·L-1。（8）细菌发酵液：NaCl2g·L-1，牛肉膏3-5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，葡萄糖20g·L-1。（9）细菌培养基：NaCl2g·L-1，牛肉膏3-5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，葡萄糖20g·L-1，琼脂10g·L-1。15 东北农业大学理学硕士学位论文2.1.2纤维素分解菌的筛选（1）在腐烂的草根，秸杆堆垛根部腐烂处取样（取样温度在30-45℃范围内）。（2）将样品截成3-5cm小段放入纤维素琼脂平板，置于37℃恒温恒湿培养。挑取平板上生长速度快、透明圈大的培养物。（3）通过上述方法挑选的培养物分别在羧甲基纤维素培养基上反复划线和用稀释平板法筛选出单个菌落，直到得到纯菌株，另接种PDA斜面保存。（4）将PDA斜面培养基中保存的纤维素分解菌接种于赫奇逊培养液中，37℃恒温恒湿培养，将滤纸分解速度快的菌种挑选出来，接入PDA培养基保存。2.2生物表面活性剂的制备:（1）分别接种产生物表面活性剂的细菌到细菌培养基培养24h。（2）将细菌分别接入发酵罐培养48h，发酵液为牛肉膏－蛋白胨培养基，细菌的生长条件是37℃，pH7.0。（3）48h发酵充分后，将发酵培养液10000r·min-1离心20min后去除去菌体细胞，留发酵液备用，发酵液中含有生物表面活性剂（表面张力均小于小于35mN·m-3），堆肥时将发酵液混合使用。2.3堆肥实验方法堆料分5组。分别为：（1）CK（空白对照）；（2）BS（加入含生物表面活性剂的发酵液400mL）；（3）BN（加入含生物表面活性剂的发酵液与纤维素分解菌A液各200mL）；（4）BG（加入含生物表面活性剂的发酵液与纤维素分解菌B液各200mL）；（5）THREE（加入含生物表面活性剂的发酵液200mL，纤维素分解菌A液，纤维素分解菌B液各100mL）。每组堆料设3次重复，将秸杆堆制成长2米，宽1.5米，高1米的料堆，定期补水，保证堆料含水率60%左右。堆肥在室温中进行，每隔一天进行通风，以确保堆料获得足够的氧气。堆肥持续27d，分别在第1d，3d，5d，7d，9d，11d，13d，20d，27d上午10时于堆肥中取样分析，采用多点取样法，即从堆肥左20cm处、中部、右20cm处3个截面的上20cm处、中部、下20cm处3个高度各取200g样品混合，同时测量堆体温度。16 材料与方法2.4测定项目与方法2.4.1微生物数量测定2.4.1.1细菌数量采用梯度稀释法制备悬液，涂抹平板计数法。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g·L-1，蛋白胨10g·L-1，氯化钠5g·L-1琼脂15g·L-1。2.4.1.2真菌数量采用梯度稀释法制备悬液，涂抹平板计数法。真菌培养基：蛋白胨10g·L-1，琼脂20g·L-1，麦芽糖40g·L-1。2.4.1.3放线菌数量采用梯度稀释法制备悬液，涂抹平板计数法。高氏培养基：可溶性淀粉20g·L-1，硝酸钾1g·L-1，磷酸氢二钾0.5g·L-1，氯化钠0.5g·L-1，硫酸镁0.5g·L-1，硫酸亚铁0.01g·L-1，琼脂20g·L-1，pH值到7.2-7.4。2.4.2羧甲基纤维素酶的测定方法（1）测定原理羧甲基纤维素酶水解羧甲基纤维分子中β-1,4葡萄糖苷键，释放出的还原糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放还原糖（以葡萄糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以葡萄糖为标准物）可以确定还原糖生产的量，从而确定出酶的活力单位。（2）葡萄糖标准曲线制作葡萄糖于80℃烘干至恒重，准确称取1.000g溶于1000mL水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。取1mg·mL-1标准葡萄糖溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL补加水至2.0mL，加入2.0mLDNS试剂，具塞，沸水浴中加热10min，冷却后定容至15mL，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复实验的均值用最小二乘法拟合Y=aX+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。（3）羧甲基纤维素（CMC）酶活测定15mL刻度试管中加入稀释酶液0.2mL（三支平行样），再各吸取1.8mL1%的CMC溶液，摇匀，50℃水浴30min，取出待冷却后，再吸取2mLDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10min，冷却后，补加水定容到15mL，轻轻上下摇匀，空白用0.2mL稀释酶液加1.8mL0.1mol/LpH4.8醋酸缓冲溶液，不加CMC溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测OD值。定义每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位U（胡平平等，2001）。羧甲基纤维素酶活力单位用下式计算：17 东北农业大学理学硕士学位论文CMC纤维素酶活力=A×D×10×100060U/g（干样）式中：A——OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（mg）D——酶液稀释倍数2.4.3半纤维素酶活的测定（1）测定原理半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3,5-二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。（2）木糖标准曲线制作木糖于80℃烘干至恒重，标准称取1.000g木糖溶于1000mL水中，加10mL叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。取1mg·mL标准木糖溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL补加水至2.0mL，加入2.0mLDNS试剂，具塞，沸水浴中加热10min，冷却后定容至15mL，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法拟合Y=aX+b一元线性方程，由光密度值引得木糖量。（3）半纤维素酶活测定15mL刻度试管中加入稀释酶液0.2mL（三支平行样），再各吸取1.8mL的木聚糖溶液，摇匀，50℃水浴60min，取出待冷却后，再吸取2mLDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10min，冷却后，补加水定容到15mL，轻轻上下摇匀，空白用0.2mL稀释酶液加1.8mL0.1mol·L-1pH4.8醋酸缓冲溶液，不加木聚糖溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测OD值。定义每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位U。半纤维素酶活力单位用下式计算：半纤维素酶活力=A×D×10×100060U/g（干样）式中：A——OD值在标准曲线上对应的木糖量（mg）D——酶液稀释倍数2.4.4漆酶活性测定（1）葡萄糖标准曲线制作同2.4.2方法（2）漆酶活性测定方法lmL酶液用pH4.5醋酸缓冲液适当稀释后与lmL0.5mol·L-1的ABTS[2,2-连氮-双-(3-乙基18 材料与方法苯并唆毗咯琳-6-磺酸)]在30℃下，反应5min，测定420nm下吸光值随时间的变化。定义每分钟消耗1μmolABTS为一个漆酶活力单位，以U/mL表示。漆酶活性测定公式如下：B=106×V总×AV酶×ε×t式中：V总——反应体系的总体积V酶——反应酶液的体积ε——吸光系数A——1min内吸光度变化值t——1min2.4.5碳氮比的测定方法2．4．3．1TOC测定使用本实验室的TOC测定仪测定样品TOC：将样品风干，放入烘箱90℃烘至恒重，使用粉碎机粉碎后过100目筛后用TOC测定仪测定其TOC。2．4．3．2总氮测定（1）主要仪器：消煮炉、半微量定氮蒸馏装置、半微量滴定管（5mL）。（2）试剂：①硫酸，ρ=1.84g·mL-1，化学纯；②10mol·L-1NaOH溶液。③甲基红—溴甲酚绿混合指示剂，0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL乙醇中。④20g·L-1H2BO3—指示剂。⑤混合加速剂，K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100gK2SO4（化学纯）、10gCuSO4·5H2O（化学纯）、和1gSe粉混合研磨，通过80号筛充分混匀。消煮时每毫升H2SO4加0.37g混合加速剂。⑥0.02mol·L-1（1/2H2SO4）标准溶液。⑦0.01mol·L-1（1/2H2SO4）标准液。⑧高锰酸钾溶液，25g高锰酸钾溶于500mL无离子水，贮于棕色瓶中。⑨1:1硫酸。⑩还原铁粉，磨细通过孔径0.15mm（100号）筛。（3）测定步骤①称取风干土样（通过孔径0.149mm筛）1.0000g，同时测定土样水分含量。②土样消煮不包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶（或消煮管）底部，加少量无离子水（0.5-1mL）湿润土样后，加入加速剂2g和浓硫酸5mL，摇匀，将开氏瓶倾斜置于19 东北农业大学理学硕士学位论文300W变温电炉上，用小火加热，待瓶内反应缓和时（10-15min），加强火力使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土样相同。包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶（或消煮管）底部，加高锰酸钾溶液1mL，摇动开氏瓶，缓缓加入1:1硫酸2mL，不断转动开氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通过长颈漏斗将0.5g（±0.01g）还原铁粉送入开氏瓶底部，瓶口盖上小漏斗，转动开氏瓶，使铁粉与酸接触，待剧烈反应停止时（约5min），将开氏瓶置于电炉上缓缓加热45min（瓶内土液应保持微沸，以不引起大量水分丢失为宜）。停火，待开氏瓶冷却后，通过长颈漏斗加加速剂2g和浓硫酸5mL，摇匀。按上述①的步骤，消煮至土液全部变为黄绿色，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定。③氨的蒸馏蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶4-5次（总用水量不超过30-35mL）。若用半自动式自动定氮仪，不需要转移，可直接将消煮管放入定氮仪中蒸馏。于150mL锥形瓶中，加入20g·L-1H2BO3—指示剂混合液5mL，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上3-4cm处。然后向蒸馏室内缓缓加入10mol·L-1NaOH溶液20mL，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50mL时，即蒸馏完毕。用少量已调节至pH4.5的水洗涤冷凝管的末端。用滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红色。记录所用酸标准溶液的体积（mL）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4mL。（4）结果计算土壤全氮量=(V−V0)×c(1H2SO4)×14.0×10−32m×103式中：V——滴定试液时所用酸标准溶液的体积（mL）；V0——滴定空白时所用酸标准溶液的体积（mL）；c——0.01mol·L-1（1/2H2SO4）或HCl标准溶液浓度；14.0——氮原子的摩尔质量（g·mol-1）；10-3——将mL换算为L；m——烘干土样的质量（g）。2.4.6木质素、纤维素和半纤维素含量的定量分析程序测定纤维废物的微生物发酵物中纤维素、半纤维素、木质素含量的方法很多。如纤维素20 材料与方法含量的测定方法有浓酸水解定糖法、硝酸乙醇法、氯化法，还用近年为人们所普遍采用的Vansoest酸性洗涤剂法；半纤维素含量的测定方法有NaOH溶液抽提法、2M盐酸水解法、2%盐酸水解法，还有将中性洗涤剂和酸性洗涤剂结合使用的洗涤剂法；木质素含量的测定方法有浓酸水解法、紫外分光光度法、红外光谱定量分析法和同位素标记法。由于红外光谱法和同位素标记法对实验室要求较高，所以应用并不普遍。本实验中参照定量分析程序（王玉万等，1987）测定木质纤维素三种组分含量，并计算出各组分的绝对含量及其降解率。（1）半纤维素的测定每3d称取0.5g烘干样放置于100mL碘量瓶中，加入50mL中性洗涤剂之后放入已沸的高压蒸汽消毒器中，100℃保温1h，取出冷却后用3号砂芯坩埚过滤，滤液弃去，残渣用水、丙酮洗（去除脂肪、腊及松香等可溶性糖类）。洗后连同坩埚一起置于80℃的烘箱中干燥8~12h，在干燥器中冷却后称重M1。洗后残渣放置于100mL碘瓶中，加入50mL2M盐酸溶液，放入已沸的高压蒸汽消毒器中，100℃保温1h，取出冷却后用3号砂芯漏斗过滤，残渣用水、丙酮洗。洗后连同坩埚一起置于80℃的烘箱中干燥8~12h，冷却干燥后称重M2。（2）纤维素的测定步骤步骤（1）中干燥后坩埚置于50mL烧杯中，加入45mL72%的硫酸，20℃水解3h，然后加水45mL，室温过夜。次日取出坩埚过滤，滤液弃去，残渣用水、丙酮洗。洗后连同坩埚一起置于80℃的烘箱中干燥8~12h，冷却干燥后称重M3。（3）木质素的测定步骤（2）中干燥后坩埚在550℃灰化4h，冷却干燥后称重M4。由上述步骤得出半纤维素、纤维素和木质素的相对含量如下式：半纤维素含量=×100%0.5纤维素含量=×100%0.5木质素含量=(M4−M3)0.5×100%2.4.7种子发芽指数测定将新鲜堆肥样品与水按10:1（V:W）比例混合振荡2h，上清液经滤纸过滤后待用；把一张大小合适的滤纸放入干净无菌的9cm培养皿中，滤纸上整齐摆放20粒白菜种子；准确吸取3ml滤液于培养皿中，在25℃、黑暗条件下的培养箱中培养48h，测定种子的发芽率和根长，同时用去离子水做空白对照。其计算公式为：GI=（堆肥处理的种子发芽率×种子根长）/（对照的种子发芽率×种子根长）21（M2−M1）(M3−M2) 东北农业大学理学硕士学位论文2.4.8堆肥pH值测定方法称取堆肥样品10g于250ml锥行瓶中，加去除CO2的水100ml，充分震荡30min，使样品充分分散，过滤后使用pH计对滤液进行pH值测定。22 结果与分析3结果与分析3.1复合微生物菌剂的确定按1:4、1:2、1:1、2:1、4:1的比例将生物表面活性剂发酵液与纤维素分解菌液混合，37℃恒温摇床培养48h后，测定其纤维素分解菌含量。图3-1中可以看出，生物表面活性剂发酵液与纤维素分解菌液按1:1浓度混合培养后，纤维素分解菌数量最高，确定复合微生物菌剂配方为：生物表面活性剂发酵液与纤维素分解菌液按1:1混合使用。表面活性剂对纤维素分解菌数量的影响４．５４３．５３２．５２１．５１０．５０１／４１／２１２４表面活性剂／纤维素分解菌图3-1表面活性剂对纤维素分解菌数量的影响Fig.3-1Theeffectofthenumberofsurfactantforcelluloseondecomposingbacteria3.2添加微生物菌剂对堆肥温度变化的影响表3-1中数据表明：未施入复合微生物菌剂的堆体温度在第2-3天出现一个高温阶段，然后温度有所下降，25天后降到30℃以下。添加微生物菌剂对玉米秸秆堆体温度有不同程度的提高。所有堆体温度最高为BN处理，在第10天达到55℃，其次为THREE处理在第10天达到54.3℃，CK处理的最高温度在第4天达到52.8℃。这说明添加菌剂对堆肥的温度上升有所帮助，而堆体温度的升高对加速秸杆的腐熟，杀灭堆肥中的有害菌和寄生虫都是有利的。23纤维素分解菌数量（１０）７ 东北农业大学理学硕士学位论文表3-1复合微生物菌剂添加对秸秆堆肥过程温度变化Tab.3-1TendoftemperatureofcomplexmicrobialagentinmaizestrawdecompositCK(℃)BS(℃)BG(℃)BN(℃)THREE(℃)环境(℃)1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d11d12d13d14d15d16d17d18d19d20d21d22d23d24d25d26d27d47.0±0.1(cB)44.2±0.4(fEF)52.2±0.2(bA)52.8±0.3(aA)44.9±0.3(deCDE)45.2±0.4(dCD)45.4±0.4(dC)40.0±0.1(iI)41.6±0.1(hH)44.2±0.1(fEF)47.0±0.1(cB)47.2±0.3(cB)40.2±0.4(iI)40.2±0.3(iI)44.6±0.5(efDE)44.2±0.4(fEF)43.4±0.3(gG)43.5±0.3(gFG)42.1±0.3(hH)42.0±0.1(hH)37.2±0.2(jJ)37.0±0.2(jJ)33.4±0.2(kK)30.4±0.4(lL)29.4±0.3(mM)29.2±0.2(mM)29.4±0.1(mM)41.2±0.3(hH)47.2±0.2(dD)48.8±0.3(cC)50.0±0.3(bB)39.4±0.2(jIJ)40.0±0.1(iI)38.7±0.1(kK)47.0±0.2(dD)47.2±0.1(dD)51.2±0.3(aA)46.8±0.4(dD)42.8±0.3(fF)42.7±0.3(fF)45.6±0.3(eE)45.4±0.3(eE)42.7±0.2(fF)42.0±0.3(gG)39.1±0.5(jkJK)37.5±0.4(lL)34.1±0.1(mM)32.0±0.2(oO)34.3±0.2(mM)33.2±0.2(nN)30.0±0.4(qQR)31.0±0.2(pP)30.4±0.3(qPQ)29.4±0.1(rR)44.6±0.2(iH)53.1±0.3(aA)53.2±0.2(aA)52.2±0.3(bB)50.6±0.2(dC)52.9±0.3(aA)52.9±0.4(aA)38.6±0.2(nLM)38.4±0.2(nM)43.4±0.4(jI)51.2±0.2(cC)46.6±0.4(gF)42.0±0.2(kJ)43.2±0.4(jI)48.5±0.2(eD)48.4±0.1(eD)48.5±0.2(eD)47.6±0.2(fE)45.7±0.1(hG)44.2±0.3(iH)41.2±0.2(lK)39.2±0.3(mL)36.7±0.2(oN)31.2±0.4(rQ)34.4±0.1(pO)32.2±0.2(qP)31.2±0.3(rQ)45.3±0.2(fFG)47.2±0.1(dD)44.6±0.2(gH)45.6±0.3(fEF)45.4±0.5(fF)49.2±0.2(cC)41.0±0.3()42.5±0.1(iI)52.0±0.4(bB)55.0±0.3(aA)47.6±0.4(dD)44.2±0.1(ghH)40.8±0.2()44.0±0.4(hH)46.2±0.3(eE)44.0±0.2(hH)44.0±0.1(hH)44.5±0.3(ghH)44.7±0.3(gGH)41.2±0.2(jJ)40.4±0.2(kK)35.8±0.1(lL)34.7±0.2(mM)34.0±0.2(nN)34.0±0.3(nN)32.5±0.2(oO)28.7±0.1(pP)47.6±0.2(gEF)46.2±0.4(ijHI)45.6±0.2(klIJ)48.4±0.2(deCD)47.1±0.4(hFG)46.1±0.2(ijkHI)44.2±0.2(mK)46.5±0.1(iGH)50.3±0.3(bB)54.3±0.2(aA)48.6±0.1(dC)44.2±0.2(mK)41.2±0.2(nL)48.2±0.1(defCDE)49.7±0.3(cB)48.0±0.3(efgCDE)47.8±0.2(fgDE)45.7±0.1(ijkHI)45.2±0.1(lJ)40.0±0.2(oM)40.0±0.5(oM)36.2±0.3(pN)31.0±0.3(rP)33.2±0.2(qO)33.4±0.2(qO)31.4±0.3(rP)31.2±0.2(rP)28.127.828.826.830.132.034.027.228.128.232.027.728.231.233.034.032.034.029.432.330.629.323.923.624.124.023.3注:平均值比较采用Duncan法测验，不同小写字母为差异达显著水平（P<0.05），不同大写字母为差异达极显著水平（P<0.01）24 结果与分析施入BS的秸秆堆体在前四天温度在50℃左右，之后下降，10天左右温度有所回升，并且在堆肥第10天出现最高温度为51.2℃。单纯添加生物表面活性剂对堆体温度的升高影响不明显，但复合菌剂对堆体温度升高有明显的效果，可见对温度起主要作用的是符合菌剂中的纤维素分解菌。纤维素分解菌分解秸杆中的纤维素、半纤维素、木质素等物质，为微生物活动提供能量，并使堆体温度明显升高。3.3添加微生物菌剂对堆肥pH变化的影响堆肥过程中pH值呈现先降低后升高的趋势，5个处理之间区别不明显。各处理在堆肥初期pH值为7.4~7.5，堆肥达到7天时pH值降到最低，pH值在7.1~7.2，7天以后堆肥pH值有所上升，至13天以后堆肥pH值基本稳定在7.9左右，直至堆肥完成。８．２８７．８７．６７．４７．２７６．８６．６ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-2堆肥过程pH值变化Fig.3-2ThechangeinthepHofcompostingprocess3.4堆肥菌群数量变化3.4.1细菌数量变化菌剂对堆肥细菌数量影响总体趋势为：添加了生物表面活性剂与纤维素分解菌的处理，细菌数量明显高与不添加菌剂的处理，单独添加生物表面活性剂的处理效果要比混合菌剂稍差。从图3-3中可以看出，BS处理其细菌最大数量出现在第七天，达到3.2×1010CFU·g-1；BN处理细菌数量在第三天达到5.7×1010CFU·g-1，为所有处理最高，且远远高于CK。可见混合25ｐＨ 东北农业大学理学硕士学位论文菌剂在堆肥前期对细菌生长有一定促进作用，生物表面活性剂作为一种细菌的分泌产物对细菌生长产生没有抑制作用，而纤维素分解菌可以分解部分纤维素为细菌生长提供营养物质。细菌数量变化７６５４３２１０ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）-图3-3堆肥过程细菌数量变化Fig.3-3Thechangeinthenumberofbacteriaofcompostingprocess3.4.2真菌数量变化实验结果表明，堆肥过程中真菌数量呈现先升高再降低的趋势。从图3-4中可以看出，堆肥3-5天时真菌数量最多，然后开始下降，到第13天，真菌数量降到107CFU·g-1左右。因为施入的纤维素分解菌本身是真菌，所以对堆肥中真菌数量产生了影响，真菌快速繁殖，于3-5天达到最大，然后随着堆体营养物质消耗，真菌数量随之减少，而随着纤维素分解菌对秸杆中的纤维素、半纤维素、木质素分解作用的进行，堆体中产生了糖类等物质，所以堆体内真菌数量在一定时期内可以稳定在107CFU·g-1；THREE处理的真菌数量在第三天达到108CFU·g-1，为所有处理中最高，可见堆肥过程真菌数量与堆肥初始状态真菌数量有关；生物表面活性剂对真菌有一定抑制作用（任焕等，2009），但本实验中，生物表面活性剂处理的真菌数量并未明显少与其他处理，应与施入的生物表面活性剂量有关。26细菌数量（１０）１０ 结果与分析真菌数量变化６０５０４０３０２０１００ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-4堆肥过程真菌数量变化Fig.3-4Thechangeinthenumberoffungiofcompostingprocess3.4.3放线菌数量变化图3-5可以看出，堆肥中放线菌数量呈现先升高后降低趋势，在3-7天放线菌数量达到最大，施加菌剂处理的放线菌数量明显大于空白处理，其中THREE处理在第三天放线菌数量达到1010CFU·g-1，达到所有处理中最高值，可见纤维素分解菌对放线菌的生长有所促进；生物表面活性剂对放线菌表现出抑制和激发两种作用，在1-5天抑制放线菌的生放线菌数量变化１２１０８６４２０ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-5堆肥过程放线菌数量变化Fig.3-5ThechangeinthenumberofactinomycesBacteriaofcompostingprocess27真菌数量（１０）７数量（１０）９ 东北农业大学理学硕士学位论文长，随后抑制作用变为激发作用，使得放线菌数量在第七天突然增加，然后随着生物表面活性剂作用的减弱，放线菌数量趋同与其他处理。3.5堆肥中酶的活性变化3.5.1堆肥中纤维素酶活性变化实验结果说明，施入微生物菌剂对堆肥中的纤维素酶活性有明显影响。图3-6中可以看出，BS、BN、BG、THREE处理的纤维素酶活性明显高于CK。CK的纤维素酶活性最高值出现在第9天，达到0.142mg·g-1·d-1，BS、BN、BG、THREE处理的纤维素酶活则出现在堆肥第11天且均高于0.16mg·g-1·d-1，THREE处理的酶活在第11天达到0.182mg·g-1·d-1，比CK的最高值高出25%BS处理的纤维素酶活性表现出初期降低然后升高的效果，这是由于表面活性剂对胞外酶的分泌具有先抑制后激发的效果（苏峰峰等，2009）。其峰值也出现在11天，达到0.174mg·g-1·d-1。纤维素酶活性变化０．１８ＣＫ０．１３０．０８０．０３ＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-6堆肥过程纤维素酶活性变化Fig.3-6Thechangeinthecellulaseactivityofcompostingprocess3.5.2纤维素酶活性与温度变化的关系图3-7中可以看出，堆肥过程中，纤维素酶活性与温度呈现线性正相关，因此高温有利28纤维素酶活性（ｍｇ・ｇ－１・ｄ－１） 结果与分析纤维素酶活性的增加。施加复合微生物菌剂的处理温度对纤维素酶的影响的相关系数要高于空白处理的0.5817，可见微生物对温度的敏感性促进了纤维素酶活性的增加。BS处理的相关系数为0.6882，高于CK而低于BN、BG、THREE，复合菌剂对纤维素酶活性对温度的敏感性的影响高于生物表面活性剂处理，说明堆肥中纤维素酶的主要来源为纤维素分解菌，生物表面活性剂只在一定程度上影响酶活。０．１４０．１３０．１２０．１１０．１０．０９０．０８０．０７０．０６０．０５０．０４ＣＫ线性　（ＣＫ）ｙ　＝　０．００２５ｘ　－　０．０３７６Ｒ２　＝　０．５８１７３５４０４５５０５５温度（℃）０．１２０．１１ＢＳ线性　（ＢＳ）０．１０．０９０．０８０．０７０．０６ｙ　＝　０．００３８ｘ　－　０．０９１９０．０５０．０４Ｒ２　＝　０．６８８２３５４０４５５０５５温度（℃）29纤维素酶活性（ｍｇ．ｇ－１．ｄ－１）纤维素酶活性（ｍｇ．ｇ－１．ｄ－１） 东北农业大学理学硕士学位论文０．１４０．１３０．１２０．１１０．１０．０９０．０８０．０７０．０６０．０５０．０４ＢＮ线性　（ＢＮ）ｙ　＝　０．００５ｘ　－　０．１１６９Ｒ２　＝　０．７８３４３５４０４５５０５５温度（℃）０．１４０．１３０．１２０．１１０．１０．０９０．０８０．０７０．０６０．０５０．０４ＢＧ线性　（ＢＧ）ｙ　＝　０．００４８ｘ　－　０．１３３５Ｒ２　＝　０．６２５４３５４０４５５０５５温度（℃）30纤维素酶活性（ｍｇ．ｇ－１．ｄ－１）纤维素酶活性（ｍｇ．ｇ－１．ｄ－１） 结果与分析０．１４０．１３０．１２０．１１０．１０．０９０．０８０．０７０．０６０．０５０．０４ＴＨＲＥＥ线性（ＴＨＲＥＥ）ｙ　＝　０．００４９ｘ　－　０．１２２８Ｒ２　＝　０．７６７４３５４０４５５０５５温度（℃）图3-7堆肥过程中纤维素酶活性与温度的关系Fig.3-5Therelationshipbetweencellulaseactivityandtemperatureofcompostingprocess3.5.3堆肥过程半纤维素酶活性变化秸杆堆肥中半纤维素活性在第9-11天达到最大，与堆肥温度的变化相同。BN在第11天达到297U·ml-1为所有处理中最高。CK处理的酶活性最高值出现在第9天，达到159U·ml-1，BS、BN、BG、THREE处理的半纤维素酶活性总体表现要高于CK。BN、BG、THREE处理的酶活呈现先升高后降低再升高的趋势，而BS则表现出初期较低，后期升高半纤维素酶活性变化３５０３００２５０２００１５０１００５００ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-8堆肥中半纤维素酶活性的变化Fig.3-8Thechangeinthehemicellulaseactivityofcompostingprocess31纤维素酶活性（ｍｇ．ｇ－１．ｄ－１）漆酶活性（Ｕ・ｍｌ）－１ 东北农业大学理学硕士学位论文的趋势其酶活性最高值在第11天，达到285U·ml-1，只比THREE处理的低，而高于其他处理。3.5.4堆肥过程漆酶活性变化堆肥中漆酶活性的变化呈现先升高后降低的趋势，在堆肥第11天所有处理的漆酶活性达到最高。其中BN处理的漆酶活性最高达到68.91U·ml-1，也是所有处理中最高。CK的漆酶活性要弱于其他处理，最高活性达到55.38U·ml-1。BS处理的漆酶活性与BN、BG、THREE处理相差不大，但在初期3-5天时BS处理的漆酶活性要低于其他处理，甚至要低于CK，表现出对酶活性的先抑制后激发的效果。漆酶活性变化８０７０６０５０４０３０２０１００ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-9堆肥中漆酶活性的变化Fig.3-9Thechangeinthelaccaseactivityofcompostingprocess3.6堆肥过程碳氮比变化3.6.1堆肥过程TOC变化从图3-10中可以看出，所有处理的TOC值呈现下降趋势，这是堆肥中微生物对秸杆的降解作用造成的。填加了生物表面活性剂与纤维素分解菌的处理，在堆肥13天之前与空白处理区别不明显，堆肥进行到20天以后，TOC值要低于空白处理。堆肥27天时BN处理的TOC值最低，为46.53%。32漆酶活性（Ｕ・ｍｌ）－１ 结果与分析ＴＯＣ变化５４．５５３．５５２．５５１．５５０．５４９．５４８．５４７．５４６．５４５．５ＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-10堆肥过程中TOC变化Fig.3-10ThechangeintheTOCofcompostingprocess3.6.2堆肥过程碳氮比变化C/N比是评价堆肥腐熟度的重要指标，C/N比的下降程度可说明堆肥腐熟进程的快慢，通常当C/N降为15-20（姜成林等，2001）和终点C/N：初始C/N值小于0.5-0.6之间时认为堆肥达到腐熟。碳氮比变化５０４５４０３５３０２５２０１５１０ＣＫＢＳＢＮＢＧＴＨＲＥＥ１３５７９１１１３２０２７时间（天）图3-11堆肥过程碳氮比变化Fig.3-11ThechangeintheC/Nofcompostingprocess从图3-11中看出，所有处理的碳氮比呈现降低趋势，从堆肥初期的45-50降到20左右，33ＴＯＣ（％）碳氮比（％） 东北农业大学理学硕士学位论文堆肥第27天时BS、BN、BG、THREE处理的碳氮比低于空白处理，在15-20之间，说明此时堆肥已完全腐熟。而CK的C/N比高于其他处理，说明施加了菌剂的处理的腐熟程度要高于对照，这样就缩短了堆肥所需要的时间。3.7堆肥纤维素降解率比较图3-12中表现，BN，BG，THREE处理的半纤维素降解率明显高于CK与BS，降解率最高的是THREE，半纤维素降解率达到了47%，而CK与BS的降解率只有5.6%和8.5%。说明复合菌剂中的纤维素降解菌对半纤维素的降解有显著效果。BS，BN，BG，THREE处理的纤维素和木质素降解率要高与CK，其中BG与THREE对木质素的降解率最高，分解为39.9%与40.9%，BG与THREE对半纤维素的降解率最高，分别为43.3%与44.5%。说明复合菌剂对纤维素和木质素的降解起促进作用。生物表面活性剂对半纤维素降解的作用要低与对纤维素和木质素降解的作用，可以推测纤维素分解菌对纤维素和木质素的分解起了主要的作用。６０５０４０３０２０１００半纤维素纤维素木质素ＣＫＢＳＢＮＢＧＴＨＲＥＥ图3-12半纤维素、纤维素、木质素降解率比较Fig.3-12Degradationrateofhemicellulose,cellulose,lignin3.8堆肥浸提液种子发芽指数比较由于堆肥腐熟度受到很多因素的综合影响，因此，应用不同的方法评价腐熟度时经常会得到不同的结果，单个参数评价只能片面地反映某个因素的作用，不能直接反映植物的生长特性。目前较为公认的评价有机固体废弃物腐熟度的指标为种子发芽指数（GI）（HuangGF34降解率（％） 结果与分析等，2002），GI值可综合体现堆肥样品的低毒性（影响根长）或高毒性（影响发芽）（CangL等，2003），被认为是最敏感、可靠、有效和最能反映堆肥产品植物毒性的判断堆肥无害化和腐熟度参数。　　图3-13为各堆体在30天时取样所做出的种子发芽率。当GI值>0.8时，堆肥完全腐熟。从图中可以看出，各添加了微生物菌剂的处理的GI值都大于1，基本都达到了1.2，完全达到了无害化标准。而CK的GI也达到0.86，也完成了堆肥的无害化。种子发芽指数１．５１．４１．３１．２１．１１０．９０．８０．７０．６０．５ＧＩＣＫＢＳＢＧＢＮＴＨＲＥＥ图3-13种子发芽指数比较Fig.3-13GerminationIndex35ＧＩ 东北农业大学理学硕士学位论文4讨论4.1复合微生物菌剂对堆肥中微生物数量的影响堆肥系统中存在着大量的细菌，其凭借大的比表面积可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，所以在堆肥过程中，细菌数量远远大于放线菌和真菌数量。低温下牛粪能否升温，细菌起着至关重要的作用，嗜温细菌在发酵初期利用糖类、淀粉、蛋白质等易分解有机物产生热量提高堆体温度，以利于其它微生物生长繁殖，使有机物分解。嗜热细菌是高温阶段的主要微生物类群之一，在高温阶段分解有机物。由于菌剂对细菌的促进作用，从而升高了堆肥的反应温度，缩短了堆肥的时间。土壤中养分的转化主要靠细菌完成，细菌比例增大加速了土壤中养分的转化，提高了养分的有效性（张辉等，2004），经过菌剂处理的堆肥，其细菌数量远大于CK处理，有利与堆肥对土壤的改良。在堆肥过程中，真菌对堆肥物料的分解和稳定起着重要的作用，特别是在纤维素和木质素的分解过程中，真菌起着至关重要的作用。真菌不仅能够分泌胞外酶，水解有机物质，而且由于其菌丝的机械穿插作用，对物料进行一定的物理破环，促进生物化学反应。堆肥中一些病原真菌，在堆肥高温阶段被杀死。另外，在发酵后期，微生物产生的许多抗生素类物质，也会极大地缩短病原真菌的存活时间。由于复合菌剂对真菌的促进作用，可以极大程度的促进堆肥中真菌的生长，并且由于对细菌的促进作用，提高堆肥温度，对于堆肥中有害真菌的高温杀灭也是有好处的。放线菌能够比真菌忍受更高的温度和pH值。所以，尽管放线菌降解纤维素和木质素的能力没有真菌强，它们却是堆肥高温期分解木质纤维素的优势菌群。在条件恶劣的情况下，放线菌则以孢子的形式存活，堆肥放线菌数量变化动态可反映腐熟程度和效果。从实验结果可以看出，施加菌剂对堆肥中放线菌数量有很大的促进作用，可以加速堆肥的腐熟，这点与C/N比的变化情况相吻合。4.2复合微生物菌剂对堆肥中酶活性的影响堆肥过程中纤维素降解与碳素代谢密切相关。因此，纤维素酶是碳循环中的一个重要酶，其活性变化可以反映堆肥过程中碳素物质的降解情况。由于施加了微生物菌剂，促进了纤维素酶的分泌，加速了堆肥的腐熟，这从C/N的变化和种子发芽率中可以看出来。复合菌剂促进了堆肥中细菌的生长，进而提高了堆体的温度，而较高的温度对纤维素酶的分泌有促进作用，而纤维素酶的促进可以加速秸杆的分解，对堆肥的快速腐熟起到了促进作用。多数真菌漆酶的最适反应温度较低，一般在25-50℃之间，最适反应pH在4.0-6.0之间36 讨论（许颖等，2005）。堆肥的反应温度适合漆酶的活性，而pH值则在7-8之间，高于漆酶的最佳活性区间，在一定程度上影响了漆酶的反应，可能对加速木质素的分解产生一定的影响。生物表面活性剂对纤维素酶、半纤维素酶、漆酶的活性都表现出了先抑制后激发的作用，导致初期酶活低于CK，但后期表现出来对胞外酶的激发效果，使得堆肥中酶的活性迅速上升，总体上来说对酶的活性是有促进作用的。4.3复合微生物菌剂对堆肥中C/N的影响C/N比是评价堆肥腐熟度的重要指标，C/N比的下降程度可说明堆肥腐熟进程的快慢，通常当C/N降为15-20（姜成林等，2001）和终点C/N：初始C/N值小于0.5-0.6之间时认为堆肥达到腐熟。堆肥20天以后施加菌剂的堆肥的C/N要低于CK，说明施加菌剂加速了堆肥的腐熟。结合种子发芽指数实验，堆肥完全腐熟后已完成了无害化，可以直接用于田间，避免了秸杆直接还田造成的微生物与植物争夺氮源，对植物的生长有利，具有很高的实用价值。4.4存在的问题及建议微生物菌剂接种堆肥中，要适当保持较大的堆体，这对于温度的升高是有益的。本实验堆肥体积受空间限制，无法扩大堆肥，同时因为堆肥物料单一，不够密实，导致堆体温度总体偏低。如果菌剂应用于实际堆肥，应扩大堆体规模，并在秸杆中添加禽畜粪便等其他物料，可以有利于堆体温度的升高，缩短物料腐熟的时间。由于每次堆肥的客观条件存在差异，会一定程度影响测定结果，应进行多次试验，综合判断。施加了复合菌剂的堆肥对于植物生长是否具有更加具体的影响，应做大田定位跟踪实验以确定效果。本实验只复合了生物表面活性剂与5种纤维素分解菌，菌种过于单一，种类不够丰富，应考虑多种菌类的复合使用，比如添加熔磷菌、解钾菌、大豆根瘤菌等多种复合菌剂类型的研发。诱导物的浓度高低对白腐真菌木质素降解酶的合成有着重要的影响。一些诱导物在诱导合成关键酶的同时，还可能起到分散剂、保护剂的作用。诱导物不仅能诱导木质素降解酶的产生，还起到分散剂和保护剂的作用。本实验中添加表面活性剂可以提高细胞膜的渗透性，从而加速秸杆的腐熟。菌种不同，最适的表面活性剂也不同，本实验采用的表面活性剂为糖脂类，是否最适合纤维素分解菌，仍须进行深入实验进行研究。本实验对于复合菌剂对于加速堆肥腐熟的机理研究不够深入，比如表面活性剂与纤维素分解菌在加速秸杆腐熟中占据何种地位，具体对于堆体中细菌与真菌群落造成什么样的影响，还需要采用分子生物学的方法进行深入研究。对木质素降解的研究是秸秆有效利用从实验室走向实际生产的基础，本文仅提供一些实验室研究的参数。因此需要进一步的研究固体发酵参数，为扩大实验和工业化生产提供依据。37 东北农业大学理学硕士学位论文5结论（1）单独添加生物表面活性剂对堆体的温度与pH值变化影响不明显，添加微生物菌剂对堆体温度升高有较大影响。所有堆体温度最高为BN处理，在第10天达到55℃，其次为THREE处理在第10天达到54.3℃。复合菌剂对堆体温度的效果明显，可见对温度起主要作用的是符合菌剂中的纤维素分解菌。纤维素分解菌分解了秸杆中的纤维素、半纤维素、木质素等物质，为微生物活动提供能量，并使堆体温度明显升高。（2）添加菌剂的处理，细菌数量明显高于不填加菌剂的处理；堆肥过程中真菌数量呈现先升高再降低的趋势，于3-5天达到最大，然后随着堆体营养物质消耗，真菌数量随之减少，堆体内真菌数量在一定时期内可以稳定在107CFU·g-1；THREE处理的真菌数量在第三天达到108CFU·g-1，为所有处理中最高；生物表面活性剂处理的真菌数量并未明显低于其他处理，与施入的生物表面活性剂量有关。施加菌剂处理的放线菌数量明显大于空白处理，其中THREE处理在第三天放线菌达到最高值。在堆肥过程中，添加微生物菌剂对堆肥的微生物数量、纤维素酶活性、纤维素、半纤维素、木质素的降解率均有显著的促进作用。纤维素分解菌显著改善了真菌数量，对纤维素、半纤维素和木质素的降解起主要作用，添加一定量的生物表面活性剂对纤维素分解菌不会起到抑制作用，还能在一定程度上激发纤维素分解菌的活性。（3）添加微生物菌剂对堆肥的微生物数量、纤维素酶活性、纤维素、半纤维素、木质素的降解率均有显著的促进作用。THREE处理的半纤维素降解率比CK高出41.4%，纤维素降解率比CK高出17%，木质素降解率比CK高出11.5%。（4）添加微生物菌剂在一定程度上降低了堆肥过程中的TOC值和碳氮比，但效果并非显著；秸杆腐熟后碳氮比在20左右，可以直接用于田间，避免了秸杆直接还田造成的微生物与植物争夺氮源，对植物的生长有利，具有很高的实用价值。（5）总体看来，生物表面活性剂与纤维素分解菌制成混合菌剂效果优于单独施加单一菌剂。BN处理的温度、细菌数量、TOC、碳氮比优于其他处理。THREE处理的真菌数量、放线菌数量、纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率优于其他处理。38 致致谢谢感谢恩师王宏燕教授三年来对我的指导和教诲，我的学业能够顺利得以完成。从课题的选定，试验的实施到论文的撰写，导师倾注了许多心血。恩师严谨的治学风范、高尚的为人为师之道永远的影响着我。攻读硕士阶段，包括个人生活都得到导师的关心和帮助。从导师身上，我不仅学到了扎实的专业知识，也学到了做人的道理。值此论文完成之际，谨向恩师表示最诚挚的感谢和崇高的敬意！东北农业大学的生态教研室不仅是一个善于科研，勇于实践，倾力致学的队伍，更是一个团结奋进，相互关爱充满温情的家庭，三年来并肩作战结下的深厚友谊也将也生难忘。感谢李传宝老师的指导，以及我的师兄师姐师弟师妹等给予我的无私帮助和支持。正是大家的帮助，使我在一个团结快乐的集体中顺利完成论文研究。在此深表感谢。本论文得到了国家863基金的资助，在此一并致谢。感谢父母多年来对我的抚育和培养，是他们在物质上和精神上支持着我完成硕士的学习。将我的成绩献给他们以表示我由衷的感激！最后，向所有关心和帮助过我的老师、亲人、同学和朋友表示由衷的谢意！39 东北农业大学理学硕士学位论文参考文献鲍士旦.2000.土壤农化分析[M].3版.北京:中国农业出版社,220-222戴芳,曾光明,袁兴中等.2005.生物表面活性剂在农业废物好氧堆肥中的应用[J].环境科学,26(4):181-185范立梅.2000.生物表面活性剂及其应用[J].生物学通报,35(8):21-22方长云,薛嘉韵,源亮君.2005.生物表面活性剂及其在环境工程中的应用[J].广东化工,48(12):48-50傅海燕,曾光明,黄国和等.2005.生物表面活性剂对堆肥中含烃有机质降解过程的影响[J].高技术通讯,15(9):96-100高祥照,马文奇,马常宝等.2002.中国作物秸秆资源利用现状分析[J].华中农业大学学报,21(3):242-247高学文,姚仕义,HuongPham等.2003.枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性素变异体的纯化和鉴定[J].微生物学报,43(5):647-665顾文杰,张发宝,徐培智.2009.接种菌剂对堆肥微生物数量和酶活性的影响[J].农业环境科学学报,28(8):1718-1722韩每佳,闰巧娟,刘向阳等.2002.中国农作物秸秆资源及其利用现状[J].农业工程学报,18(3):87-91胡平平,付时雨,余惠生.2003.固体培养条件下氮源对Panusconchatus酶系及漆酶同工酶的影响[J].土壤学报,4(4):618-623华兆哲.陈坚.朱文吕等.1998.假丝酵母生产生物表面活性剂及降解正构烷烃的研究[J].南京大学学报(自然科学版),34(2):149-154黄得扬,陆文静,王洪涛.2004.有机固体废物堆肥化处理的微生物学机理研究[J].环境污染治理技术与设备,5(1):12-18黄国锋,钟流举,张振钿等.2002.猪粪堆肥化处理过程中的氮素转变及腐熟度研究[J].应用生态学报,13(11):1459-1462姜成林,徐丽华.2001.微生物资源开发利用[M].北京:中国轻工业出版,186-189李国学,张福锁.2000.固体废弃物堆肥化与有机复混肥生产[M].北京:北京化工出版社,19-30,91-95李承强,魏源送,樊耀波等.1999.堆肥腐熟度的研究进展[J].环境科学进展,7(6):1-12李吉进,郝晋珉,邹国元等.2004.高温堆肥碳氮循环及腐殖质变化特征研究[J].生态环境,13(3):332-334李敬龙,刘晔,潘爱珍.2004.生物表面活性剂及其应用[J].山东轻工业学院学报,18(2):41-45李蔚,刘如林,刘春林等.2004.一种脂肽类生物表面活性剂的产生及特性研究[J].日用化学工业,34(6):350-352李艳霞,王敏健,王菊思等.1999.城市固体废弃物堆肥化处理的影响因素[J].土壤与环40 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