lspr生物传感技术的研究与应用_

LSPR生物传感技术的研究与应用刘国华,孙辉,张维，王程，王育剑，徐凯，岳钊（1.南开大学信息技术科学学院，天津300071；）摘要：基于局域表面等离子体共振（LSPR）现象的传感器是目前传感技术领域的一个研究热点。LSPR传感器在物理、化学特别是生物等学科的检测分析方面具有明显的技术优势。本文介绍了LSPR传感器的技术原理和特点，对目前研究的几种LSPR传感器结构和制作方法进行了比较，并且对LSPR传感技术的应用、未来发展趋势和商业化前景等进行了分析讨论。关键词：局域表面等离子体共振（LSPR）；生物传感器；纳米颗粒ResearchandApplicationontheLSPRBio-sensingTechnologyLiuGuohua,Sunhui,ZhangWei,WangCheng,Wangyujian,Xukai,YueZhao(1.CollegeofInformationTechnologyandScience,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)Abstract:Recently,theresearchonthelocalizedsurfaceplasmonresonance(LSPR)sensorsisoneofthehot-spotsinthefiledofsensortechnology.TheLSPRsensorshaveobviouslytechnologyadvantageindetectingandanalyzingthepropertiesofphysicsandchemistry,especiallybiology.ThisreviewintroducesthetechnicalprinciplesandfeaturesofLSPRsensorsandcomparesthecurrentresearchofseveralLSPRsensorstructuresandproductionmethods.Meanwhile,itdiscussesthefuturedevelopmentsandcommercialviewsofLSPRsensors.KeyWords:LocalizedSurfacePlasmonResonance(LSPR);Biosensor;Nanoparticle1．引言近年来，纳米材料由于其独特的光学、电磁学和力学特性而得到了研究人员的广泛关注。贵金属纳米粒子显示了很强的紫外－可见光吸收带特性[1-8]。科学研究表明，贵金属纳米粒子的这种特有性质取决于它们和光的强烈作用。对贵 金属纳米粒子光学性质的研究在理论和实践上都具有重要的意义。从理论上说，它对于系统研究纳米量级结构和引起光学性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等起到了十分重要的作用。从实践上说，如果纳米结构的光学性质可调试，则它可以应用于表面增强光谱[9-13]，光学滤波器[14,15]，等离子体设备[16-19]和传感器等领域。LSPR（LocalizedSurfacePlasmonResonance,LSPR）纳米传感器的传感机理与SPR（SurfacePlasmonResonance,SPR）传感器有一定的相似性，LSPR传感器可以看作是SPR传感器的拓展和延续。前者的表面等离子体共振发生在金属纳米颗粒局部，后者的共振发生在连续金属薄膜表面；然而，发生在纳米颗粒局部的共振表现出的光学特性与SPR不同，在传感领域具有很大的应用潜力，因此得到了广泛研究[20-26]。贵金属（如金、银）纳米粒子，在紫外－可见光区域表现出独特的光学响应[27,28]，有强吸收作用。LSPR现象发生时，入射光子频率和金属纳米粒子或金属岛传导电子的整体振动频率相匹配，对光子能量产生很强的吸收作用，而且吸收率随着光子能量的减少呈指数衰减，因此出现LSPR带。研究显示，LSPR吸收谱对粒子结构和周围环境媒介等很多因素都非常敏感[29-35]。被测溶液和固定探针分子的纳米颗粒之间的反应能够引起生物分子层厚度的变化，从而引起LSPR吸收峰的位移，因此基于LSPR的检测方法能够对这种即时变化进行动态检测[36,37]。以NSL（nanospherelithography,NSL）技术制作的银纳米粒子为例，当增加被吸附物层的密度和厚度时，会产生连续波长的红移。纳米粒子表面分子的大小和密度决定波长的移动响应，表面结合的配体和溶液中的目标分子共同决定系统的检测能力，整个反应归因于分子间的特异性选择。LSPR纳米传感器的性能优化可通过调整所使用的纳米粒子的大小和形状实现[30,38]。纳米材料与生物高分子、蛋白质、核酸等在尺寸大小上具有相同的量级，所以在生物医学领域，基于金属纳米颗粒的LSPR传感器具有明显的技术优势。这种传感器可以广泛应用于药物研究、生物检测、细胞标记、定点诊断、分子动力学研究及疾病诊断等方面[22,39,40]。2．LSPR传感器原理LSPR现象是发生在金属纳米结构中的传导电子共振现象[41-45]，常见的金属纳米结构包括纳米球，纳米三角形[46]，纳米岛[42]等。当光子跟金属纳米粒子中的传导电子振动相匹配时，就会产生LSPR现象。通过入射光电场激发产生LSPR，出现强光散射和强表面等离子体吸收带，同时出现 局部电磁场增强。纳米粒子在紫外光区域表现出唯一的光学响应[28]。表面等离子吸收带的频率、最大吸收波长和强度都高度取决于纳米粒子的化学成分、尺寸、分布、结构和周围的环境[29,30,34,47]。当入射光子与金属纳米粒子中的自由电子的集体振动发生共振时，会产生LSPR现象。最简单的纳米粒子光学响应模型是Mie理论，它描述长波段球形金属颗粒的消光量。具体形式如下[35]：其中，E(λ)为消光量，即吸收和散射光量的总和；NA是纳米粒子的局部密度；a是金属纳米球的半径；εm是金属纳米球周围介质的介电常数(假设为正实数，且与波长不相关)；λ是入射光波长，εi、εr分别表示金属纳米球介电常数的虚部和实部。当分母中的共振项(εr+2εm)2接近零时，即达到了LSPR的共振条件。从这个最原始的模型可以看出，金属纳米颗粒的LSPR光谱特性取决于以下几个方面：纳米粒子的半径a、纳米粒子材料(εi和εr)以及纳米粒子周围介质的介电常数εm。进一步研究表明，在实际情况中，即纳米粒子不是球体时，吸收光谱还将取决于纳米粒子的几何线度和形状。在这种情况下，分母中的共振项应写作其中χ是形状因子项[11]，用来描述纳米粒子形貌比例。此外，LSPR还取决于粒子间距和表面绝缘常数等。由式(1)还可以看出，贵金属纳米粒子的最大消光位置高度取决于周围环境的电介质性质，并且纳米粒子最大消光波长的移动响应能够被用于检测由纳米粒子周围分子引起的变化。3．LSPR生物传感系统的基本结构LSPR器件制作容易，它不像SPR器件那样需要特殊的系统结构，如衰减全反射光学或波导耦合器件，它可以利用NSL等技术达到很高的小型化程度。图1LSPR生物传感器系统的示意图一般来说，LSPR生物传感器系统包括光学系统，转换介质（光和化学/生物信号转换）和电子系统（具有光电器件并能进行数据处理）。 转换介质把电荷转化为LSPR器件能识别的最大吸收波长和强度的变化。LSPR的光学系统包括一套光源并能产生表面等离子体波。在LSPR现象发生时，会产生一个电信号，并通过电子系统处理。LSPR传感器系统的性能主要取决于传感器子系统，传感器的敏感度和稳定度取决于光学系统和转换介质，传感器的选择性和响应时间主要取决于转换介质。以基于光纤的生物传感系统为例，LSPR生物传感系统主要包括激光器、斩波器、光纤耦合器、传感光纤、样液池、光接收器、锁相放大器和数据采集器等器件[48]，如图1所示。LSPR生物传感器系统具有结构简单，操作方便，成本低廉等优点。4．LSPR传感器制作及工艺LSPR传感器制作的关键是金属纳米结构的制作，金属纳米结构主要包括纳米线阵，纳米粒子，纳米岛等，下面我们详细介绍这三种金属纳米结构的LSPR传感器的制作过程及工艺。4.1金纳米线阵表面结合自组装分子在硅基板上旋涂浓度为1.25%的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶液，膜厚约50nm，在150°C下烘烤半小时，去除水气并使PMMA排列定型。使用原子力显图2金纳米阵列制作流程示意图微镜（Smena-HV,NT-MDT,Russia）进行纳米压印，力学常数为40N/m，探针针尖直径约20nm（NSC15,MikroMasch,Russia）。这个过程主要是在铺有PMMA的硅基板上刻划出纳米凹槽后，用电子枪蒸镀系统。蒸镀时，要先蒸镀厚度约为1nm的钛层，再蒸镀厚度为20nm的金层。制作中还要辅助剥离与清洗过程。最后，可以得到线宽小于100nm金纳米线阵列，流程图如图2所示。在室温下，把制作好的金纳米线阵列芯片浸入浓度为10-3M的十八烷硫醇（ODT）酒精溶液中，经过一段特定时间后取出芯片，立即用酒精清洗并用氮气枪风干。最后，在空气中用加热板在100°C下烘烤约10分钟，确保残留在芯片上的水分完全去除，进而可以得到表面结合了ODT分子的金纳米线阵列[49]。 4.2利用NSL技术制作Ag纳米微粒纳米球光刻（NSL）技术是一种纳米加工制造技术，利用这种技术能够控制表面纳米微粒的形状、尺寸和结构。在实验研究中，利用这种技术合成面宽约为100nm，高为500nm的Ag纳米三角形微粒，并采用LSPR光谱测量法测量微粒的光学特性。为制备LSPR生物纳米传感器，需要用自组装单层膜使Ag纳米三角形微粒具备吸附功能，然后利用零长度耦合试剂将生物素共价连接到羧基上。图3银纳米微粒的NSL加工工序如图3所示，Ag纳米微粒的制作步骤如下：（1）清洁基片；（2）将单一溶剂聚苯乙烯纳米球滴落覆盖在基片上；（3）烘干六边紧密填充的纳米球单层膜，形成纳米球掩模；（4）Ag蒸发沉积在样品上；（5）在乙醇中进行超声波降解去除纳米球掩模；（6）制备出Ag纳米微粒样品[50]。4.3金纳米岛芯片的制作在金纳米岛芯片上旋涂SU-8100（Microchem,USA）（先在500rpm下持续5秒，后在1500rpm下持续30秒），涂层厚度为200μm，然后在95°C下前烘100分钟。在波长为365nm处进行紫外曝光（每次能量密度为630mJ/cm2），可以形成一个8×8的井（Φ=800μm）阵列图案。在曝光后，在95°C下进行30分钟后烘，然后将其置于SU-8显影液中，进行3分钟弱超声波处理，去除井区域不交联的SU-8树脂并使部分井中的金纳米岛表面曝光。向金纳米岛芯片表面的井中放入0.2μL不同含量GST-hIL6细胞裂解液，将芯片在25°C下放置在密闭的培养皿中，以防止样品溶液蒸发，然后将芯片用磷酸盐缓冲溶液（PBS）和去离子水彻底冲洗，并用氮气风干[51]。4.4纳米材料表面加工工艺图4压印光刻和离子刻蚀制作金纳米岛图案示意图纳米刻蚀过程如图4所示。首先沉积一层金属铬 膜（2nm）增强金层和衬底的黏合，然后通过电子束蒸发技术在玻璃衬底上沉积厚度为40nm的金膜，并在金膜上旋涂不同浓度的聚苯乙烯（PS）溶液（质量分数分别为1.5,0.8,0.5%，PS的分子量为45,730）。聚合薄膜在玻璃化转化温度以上退火并且选用混合PDMS模式刻蚀。刻蚀过程在真空中150°C，1.60kPa低压下进行，持续30分钟到1小时。图4中，方案A适合高PS浓度，由于PS膜足够厚，所以可填充在PDMS和衬底之间的圆柱孔；方案B适合低PS浓度，质量分数在0.8%以下，由于PS膜很薄，所以对于缝隙只能部分填充。PS薄膜在毛细管力的作用下沿PS壁上升并且在壁周围形成环形波动。PS图案经过CF4/O2的RIE处理后，可以去除衬底表面多余的PS层。RIE过程改进了PS图案的形体尺寸。在冷却到室温后，用氩离子铣掩模2分钟，使PS图案位于金阵列图案的后面。离子刻蚀的直流偏置是400V，同时要保持氩气压在5×10-4Torr以下。带有波浪边缘的薄环形PS点最后制成的金环图案如图4B所示。最后，使用超声波在甲苯中降解衬底15分钟，去除残余的PS掩模。我们使用氨基烷链硫醇（AUT）的自组装单分子膜（SAM）对金岛表面进行修饰，如图4C所示。为了保证经过AUT修饰的SAM在金岛上能够良好生长，我们先将样品放在AUT溶液中，经过24小时后，彻底冲洗并在纯氮气中风干。然后使用含有10mM双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯（BS3）的PBS溶液活化金图案阵列。最后把衬底放在质量分数为10%的端氨基聚酰胺－胺（PAMAM）G4树状大分子的甲醇溶液中，锚定的PAMAM会和活化生物素sulfo-NHS-LC-biotin共价结合形成胺基键。把经过生物素修饰的金点和环阵列放在20μM的链霉亲和素(SA)溶液中曝光，从而诱发SA结合在经过生物素修饰的金表面上[52]。5．LSPR传感器的应用在各种光学传输介质上发生的物理现象促进了LSPR传感器件的发展，包括利用在湿气中多孔薄层和聚合物折射率的变化制作的湿度传感器，基于非晶硅热光效应制作的温度传感器等。在具有有限复杂变化的分析物浓度的特殊系统中，可以通过LSPR传感器直接测量折射率的变化来测量分析物的浓度，如检测蒸馏的过程。大多数的化学LSPR传感器是基于测量分析物跟转化介质间由化学反应引起光学性质的改变而制作的，它可以应用于通过转化层折射率的变化来检测分子的反应。 图5基于LSPR的多组纳米芯片的实验设备LSPR传感器在生物领域也得到了广泛的应用，一些研究小组不断发展检测生物特异性反应的方法。在LSPR生物传感器中，通过对配对反应的直接实现对分析物的测量定量。早期的工作主要集中在抗原－抗体的相互作用，链锁状球菌－生物素的反应，以及IgG测试，特别是分析生物特异性分子相互作用的新的算法的测试，使LSPR生物传感系统发展到一个新的高度，并且促进表面化学的发展。目前一个新的研究领域是检测蛋白质－蛋白质或者蛋白质－DNA的相互作用。使用基于LSPR的纳米芯片蛋白质的无标记监测，在抗体固定在多组芯片上后，利用纳升调剂系统将不同浓度的抗原溶液（从0到100μg/mL）导入到300个点位上，静置30分钟（图5）。在这个过程中，总样品的体积在减少，不同的点位上对应的100nL抗原样品溶液的浓度不同。点位上的反应要持续30分钟。然后立刻用1%的Tween-20溶液冲洗，这样可以抑制非特异性吸收。在室温下，整个吸收光谱从400－800nm在紫外－可见光分光计上排列。光纤束中的白光沿垂直方向入射到纳米芯片上。反射光被耦合进入光纤束的光纤探针，它可以通过紫外－可见光分光计进行分析。从纳米芯片表面获得的数值结果表明特异吸收强度的改变直接由点位上所使用的抗原浓度决定[53]。6．LSPR生物传感器的商业化基于LSPR的光纤生物传感器是建立在光学纤维的端面上，具有容易操作和可以探测小量样品（如蛋白质溶液）等优点。对贵金属纳米粒子的LSPR传感器进行实验研究后发现，这类传感器具有很大的潜力。以金纳米棒传感器为例，它能够利用非光刻方法实现重复制造，即临床诊断 中所需成本能够大幅降低，而且它的测量方法主要基于光谱的移动。如果非特异性结合量很小，基于LSPR波长的传感器在血清中的探测极限可以达到皮摩尔量级。医学报告显示，牛奶过敏症目前已经成为对当今社会人类健康危害程度很大的一种疾病。经过实验发现，金纳米粒子的LSPR免疫传感器可以检测牛奶样品中的酪蛋白过敏原。可见，基于LSPR的生物传感器在医用过敏诊断中用途广泛，还有可能发展成为高集成的食物安全监控系统。LSPR传感系统的灵敏度和探测极限高，结构和制作工艺简单，集成度高，操作方便，而成本却远远低于传统的SPR传感系统。因此，基于LSPR的传感器在医疗诊断，实时探测等方面将会具有很广阔的商业化前景。7．LSPR生物传感器的未来发展趋势纳米材料的小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应等使LSPR传感器呈现出独特的光学和电学性质，同时金纳米粒子具有良好的生物兼容性，容易和DNA分子杂交结合，这些性质构成了它们在分子生物学、临床医学和生物芯片中应用的基础，同时也为DNA计算机的开发带来了光明的前景。因此它们是生命科学中分析化学研究的重要组成部分和当今发展的重点领域。诊断学中未来的发展方向将会继续追求纳米量级的生物芯片技术的小型化。基于LSPR的多通道纳米芯片可以方便地实现在并行结构下生物分子相互作用的特定高灵敏度无标记方法探测，而且成本十分低廉。在透射或反射几何配置的无偏振、紫外－可见光消光光谱等测量的应用中，LSPR纳米传感器配套设备体积小、重量轻、携带方便、操作简单、坚固耐用、成本低廉。这种技术将推进当前分子诊断学和尖端诊断学的发展。生物传感应用的多通道芯片在生物标记研究，癌症诊断，以及传染微生物免疫抗体检测等方面具有很大的潜力。基于LSPR的多通道纳米芯片实现了检测方法的高通用性，它可以应用于在代谢组学和细胞组学中的生物鉴定。在选择性和灵敏度方面的进一步改进后，LSPR生物传感器很有可能取代传统方法成为一种新的经济的探测工具，在现场测量和医疗诊断等方面具有很好的应用前景。8．总结近年来，LSPR技术由于其独特的性质得到了广泛的关注和研究。这篇论文综述了LSPR技术的发展状况，并且讨论了LSPR传感器的制作和 应用。通过LSPR传感器在物理、化学、生物领域对于小量分子或高灵敏度物质的探测，我们可以得知LSPR技术具有很大的潜力。LSPR的生物传感器技术将会极大地促进相关领域的监测学和诊断学的发展。由于LSPR生物传感系统结构简单，携带方便，成本低廉，灵敏度高，所以这种传感技术将会具有广阔的商业前景。LSPR传感技术的后续研究和改进完善工作是十分必要的，它对LSPR系统的发展存在着深远的意义。参考文献[1]HaynesC.L.,andVanDuyneR.P.,J.Phys.Chem.B,2001,105,5599~5611[2]MulvaneyP.,MRSBull.,2001,26,1009~1014[3]El-SayedM.A.,AccountsChem.Res.,2001,34,257~264[4]LinkS.,andEl-SayedM.A.,J.Phys.Chem.B,1999,103,8410~8426[5]KreibigU.,GartzM.,HilgerA.,etal.,inDuncan,M.A.,JAIPressInc.,Stamford,,1998,Vol.4,345~393[6]MulvaneyP.,Langmuir,1996,12,788~800[7]KreibigU.,inHummel,R.E.andWissmann,P.(Eds.)CRCPress,BocaRatonFL,1997,Vol.II,145~190[8]HulteenJ.C.,TreichelD.A.,SmithM.T.,etal.,J.Phys.Chem.B,1999,103,3854~3863[9]FreemanR.G.,GrabarK.C.,AllisonK.J.,etal.,Science,1995,267,1629~1632[10]KahlM.,VogesE.,KostrewaS.,etal.,Sens.ActuatorsB,Chem.,1998,51,285~291[11]SchatzG.C.,andVanDuyneR.P.,Wiley,NewYork,,2002,Vol.1[12]HaynesC.L.,andVanDuyneR.P.,J.Phys.Chem.B,2003,107,7426~7433[13]HaynesC.L.,McFarlandA.D.,ZhaoL.,etal.,J.Phys.Chem.B,2003,107,7337~7342[14]DirixY.,BastiaansenC.,CaseriW.,etal.,Adv.Mater.,1999,11,223~227[15]HaynesC.L.,andVanDuyneR.P.,NanoLett.,2003,3,939~943[16]MaierS.A.,BrongersmaM.L.,KikP.G.,etal.,Adv.Mater.,2001,13,1501~1505[17]MaierS.A.,KikP.G.,AtwaterH.A.,etal.,NatureMater.,2003,2,229~232[18]ShelbyR.A.,SmithD.R.,andSchultzS.,Science,2001,292,77~78[19]AndersenP.C.,andRowlenK.L.,Appl.Spectrosc.7,2002,56,124A~135A[20]LoveJ.C.,EstroffL.A.,KriebelJ.K.,etal.Chem.Rev.2005,105,1103~1169 [21]HutterE.,FendlerJ.H.Chem.Commun.2002,378~379[22]Haes,A.J.,VanDuyne,R.P.J.Am.Chem.Soc.2002,124,10596~10604[23]FrederixF.,FriedtJ.M.,Choi,K.H.,etal.Anal.Chem.2003,75,6894~6900[24]NathN.,ChilkotiA.J.Fluoresc.2004,14,377~389[25]StuartD.A.,YonzonC.R.,ZhangX.,etal.Anal.Chem.2005,77,4013~4019[26]SönnichsenC.,ReinhardB.M.,LiphardtJ.,etal.Nat.Biotechnol.2005,23,741~745[27]JinR.,CaoY.,MirkinC.A.,etal.Science2001,294,1901~1903[38]ProdanE.,NordlanderP.,HalasN.J.NanoLett.2003,3,1411~1415[29]HaesA.J.,ZouS.,SchatzG.C.,etal.J.Phys.Chem.B2004,108,6961~6968[30]HaesA.J.;ZouS.,SchatzG.C.;etal.J.Phys.Chem.B2004,108,109~116[31]YonzonC.R.,JeoungE.,ZouS.,etal.J.Am.Chem.Soc.2004,126,12669~12676[32]HongX.,KaoF.J.Appl.Opt.2004,43,2868~2873[33]NathN.,ChilkotiA.Anal.Chem2004,76,5370~5378[34]UnderwoodS.,MulvaneyP.Langmuir1994,10,3427~3430[35]StuartD.A.,HaesA.J.,YonzonC.R.,eta1.IEEProc.Nanobiotechno1.,2005,152(1),13~32[36]HaesA.J.,ChangL.,KleinW.L.,etal.J.Am.Chem.Soc.2005,127,2264~2271[37]HimmelhausM.,TakeiH.Sens.Actuators,B2000,63,24~30[38]HaesA.J.,ZouS.,SchatzG.C.,etal.J.Phys.Chem.B2004,inpress.[39]RibohJ.C.,HaesA.J.,McFarlandA.D.,etal.(2003)JPhysChemB107,1772~1780[40]VanDuyneR.P.,HaesA.J.,McFarlandA.D.(2003)SPIE5223,197~207[41]KreibigU.,VollmerM.,OpticalPropertiesofMetalClusters,Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,1995.[42]HutterE.,FendlerJ.H.,Adv.Mater.16(2004)1685.[43]RiuJ.,MarotoA.,RiusF.X.,Talanta69(2006)288.[44]KreibigU.,GenzelL.,Surf.Sci.156(1985)678.[45]WagnerF.E.,HalsberckS.,StievanoL.,etal.Nature.407(2000)691.[46]MalinskyM.D,KellyK.L,SchatzG.C,etal.(2001)JAmChemSoc123,1471~1482[47]YonzonC.R.,JeoungE.,ZouS.,etal.J.Am.Chem.Soc.126(2004)12669.[48]Tsao-JenLin,Kuang-TseHuang,Chia-YuLiu,BiosensorsandBioelectronics22(2006) 513–518[49]吴宜蓁廖健順林鶴南[50]金友,现代应用光学,2007年1月[51]Yong-BeomShin,Jeong-MinLee,Mi-RaPark,etal,BiosensorsandBioelectronics22(2007)2301–2307[52]SarahKim,etal,Langmuir2006,22,7109-7112[53]TatsuroEndo,etal,Anal.Chem.2006,78,6465-6475