生物下游技术实验!!!!

生物下有技术期末大实验一、实验目的：1、熟练酵母扩大培养的技术。2、学习酵母蔗糖酶的提取方法以及原理。3、了解双缩脲法测蛋白质含量。二、酵母的扩大培养:l一级培养：取新鲜苹果汁液，分装在两只经过杀菌的试管中，每只装量10~20毫升，加绵塞。在0.06~0.10兆帕压力下杀菌30分钟，冷却至常温，接入纯酵母菌1~2针，摇动分散，在25~28摄氏度下培养24~48小时，使发酵旺盛。l二级培养：用杀过菌的三角瓶（1000毫升），装鲜果汁500毫升，如上法杀菌，接入培养旺盛的试管酵母液两支，在25~28摄氏度下培养24~28小时，待发酵旺盛期过后使用。三、酵母蔗糖酶的提取（一）、部分纯化试剂：1．啤酒酵母2．一氧化硅3．甲苯（使用前预冷到0℃以下）4．去离子水（使用前冷至4℃左右）5．冰块、食盐6.1N乙酸7.95％乙醉（二）、仪器：1．研钵1个2．离心管3个3．滴管3个4．量筒50ml1个5．水浴锅1 个6．恒温水浴7．烧杯1000ml2个8．广泛pH试纸9．高速冷冻离心机（三）、操作步骤：1．提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适最（约10g）一几氧化硅，放入研钵中．二氧化硅要预先研细。（3）量取预冷的甲苯3Oml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟．研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。（4）缓慢加入预冷的40ml去离了水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃,4000rpn，30min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相．（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，4000rpn，离心30min。（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5耐测定酶活力及蛋自含最。剩余部分转入清洁离心管中。（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”2．热处理（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管．（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000甲m，离心10min。（3）将上清液转入量筒，最出体积，留出1.5间测定酶活力及蛋白质含最（称为“热级分II”）。 3．乙醇沉淀将热级II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少最食盐），逐滴加入等体积预冷至一20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全．于4℃，400Orpm,离心30min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分III”）。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查托酶活性（于下一个实验一起做）。四、双缩脲法测定酵母蔗糖酶含量（一）、原理：凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。（二）、步骤：1.标准曲线的制备取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液试剂123456标准酵母酶溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9生理盐水（ml）1.00.90.70.50.30.1双缩脲试剂(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白浓度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.样品测定:（1）各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数：详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考：粗级分I:10--50倍热级分11:10--50倍 醇级分川：10--50倍确定了稀释倍数后，每个级分取3个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算出各级分蛋白质浓度。（2）取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。3.试剂（1）．10g/L标准酵母蔗糖酶溶液：准确称取干酵母10g，用生理盐水配成浓度为10mg/ml。（2）．双缩尿试剂：称取CuSO4•5H2O2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200g/LNaOH300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000ml。（3）.生理盐水附录：试剂配制方法：1.1M乙酸：取5.8ml冰乙酸（17M）加H:0稀释至100ml。2.0.5MNaOH：称2gNaOH溶于100ml水。3.0.5MHCI：取4.2ml浓HCI(12M）加入水稀释到100耐（注意必须是酸缓慢倒入水中，决不可反之）。4.0.02MpH7.3Tris一HCL缓冲液：先配0.1MTrisBuffer贮液：称1.21gTris（三经甲基氨基甲烷Mw121.1）加70ml水溶解，再滴加4MHCL约21ml，调pH=7.3，再加水至10Oml．取此贮液50ml，加水至250ml。 5.4MHCI：取166.7ml浓HCI(12M)，加水至500ml。6.0.02mol/LpH7.3Tris一HCI缓冲液（含0.02mol/L浓度NaCI):称0.584gNacl(Me55.4）用0.02mol/LpH7.3的Tris一Hcl缓冲溶液溶解,定容到50ml。7.0.2mol/LpH4.9乙酸缓冲液：称2.461g无水乙酸钠（Mw82.03）溶于15ml水。，加约40一50ml0.2M乙酸，调pH=4.9，存于4℃冰箱，瓶日用薄膜封日。实验报告实验目的：1、熟练酵母扩大培养的技术。2、学习酵母蔗糖酶的提取方法以及原理。3、了解双缩脲法测蛋白质含量。实验原理：1.采用机械法和酶法结合的方法破碎酵母细胞壁，其中器械法具体采用的为珠磨法，用石英砂加研钵研磨细胞壁。酶法采用的时蜗牛酶，其原理是破坏酵母肽聚糖层中的Ｂ-1,4-糖苷键。2.采用甲苯自溶法提取酵母中的蔗糖酶，其原理是在研磨破壁时，加入甲苯，有助于细胞破壁。然后与水混合，使酵母蔗糖酶溶于水相，离心去杂质。3.采用乙醇沉淀法，来沉淀蔗糖酶。其原理是，破坏蛋白表面的水层，并且吸收电荷，破坏蛋白的解离平衡。使蛋白凝结。实验步骤：酵母的扩大培养: l一级培养：取新鲜苹果汁液，分装在两只经过杀菌的试管中，每只装量10~20毫升，加绵塞。在0.06~0.10兆帕压力下杀菌30分钟，冷却至常温，接入纯酵母菌1~2针，摇动分散，在25~28摄氏度下培养24~48小时，使发酵旺盛。l二级培养：用杀过菌的三角瓶（1000毫升），装鲜果汁500毫升，如上法杀菌，接入培养旺盛的试管酵母液两支，在25~28摄氏度下培养24~28小时，待发酵旺盛期过后使用。酵母蔗糖酶的提取操作步骤：1．提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适最（约10g）一几氧化硅，放入研钵中．二氧化硅要预先研细。（3）量取预冷的甲苯3Oml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟．研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。（4）缓慢加入预冷的40ml去离了水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃,4000rpn，30min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相．（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，4000rpn，离心30min。（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5耐测定酶活力及蛋自含最。剩余部分转入清洁离心管中。（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”2．热处理（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中， 50℃下保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管．（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000甲m，离心10min。（3）将上清液转入量筒，最出体积，留出1.5间测定酶活力及蛋白质含最（称为“热级分II”）。3．乙醇沉淀将热级II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少最食盐），逐滴加入等体积预冷至一20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全．于4℃，400Orpm,离心30min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分III”）。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查托酶活性（于下一个实验一起做）。考马斯亮蓝法测定酵母蔗糖酶含量（一）、原理：蛋白与考马斯亮蓝作用，产生在波长为595nm的紫外线下有吸收峰的复合物。（二）、步骤：1.标准曲线的制备取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液试剂123456标准酵母酶溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9蒸馏水（ml）1.00.90.70.50.30.1考马斯亮蓝试剂(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白浓度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.样品测定:（1）各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数：详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考：粗级分I:10--50倍 热级分11:10--50倍醇级分川：10--50倍确定了稀释倍数后，每个级分取3个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算出各级分蛋白质浓度。（2）取待测蛋白样品0.1ml，加蒸馏水0.9ml，再加考马斯亮蓝4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。实验数据记录和处理：123456标准溶液吸光度0.9290.9921.0051.1031.1731.224粗级分吸光度1.8881.9261.952热级分吸光度1.6121.9841.981醇级分吸光度1.2911.2901.280蛋白质含量为： 结果与讨论，建议：实验已提取出目的蛋白，但是在用考马斯亮蓝法测蛋白质含量时，法先水相上面有一层油相，根据实验过程分析，由于实验室没有甲苯，所以用Tris-100代替，可能是在提取水相时，将油相同时吸取了，所以推测油相是tris-100.建议：小实验一人一组，大实验两个人一组，不想一组人去了，两个人在干活，其他人在看热闹!