生物工程技术金钱松

生物工程技术在提高金钱松有效组分生产中关键技术研究项目概述本项目首次将生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术、转基因技术和细胞悬浮培养技术有机结合，在离体培养条件下，成功地诱导培育出金钱松有效组分含量高、生长速度快的悬浮培养体系并诱导出优良、安全性高的金钱松试管苗；进一步探明金钱松四倍体悬浮培养物、转基因培养物中有效成分的积累动态和时空分布规律及生物工程的微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程，筛选出生产目标产物的内生菌并进行发酵培养，优化培养条件、发酵工艺，利用基因工程技术定向改变其生理过程，稳定、高效、安全的生产目标产物。最终实现工业化生产金钱松药用成分及抗生素的目的。并完成对培养物中各化学物质的提取、分离和纯化的工艺研究；最终实现大规模工业化生产金钱松土槿酸药物有效组分，极大地缓解金钱松药材市场的紧缺、种子丰产时间长对其大量繁殖的明显影响和更有效地保护金钱松野生植物资源。一、项目研究主要目标、主要内容、技术关键、技术路线和应用方案。1、主要目标：采用组织培养、多倍体诱导、转基因及微生物发酵等多项生物工程技术，初步建立金钱松有效组分规模化快速繁殖细胞系和微生物发酵工程，为金钱松有效组分工业化快速生产及大量繁殖组培苗奠定基础。2、主要内容（1）诱导金钱松幼苗选用优良的金钱松种子在适宜的温度、水分、光照、促发剂等条件下，经过适当的预处理，分别通过土壤培养、培养皿培养以及无菌体系培养诱导其萌发，并采用均匀法筛选出金钱松中年种子萌发的最佳条件，并诱导成植株。（2）建立金钱松无菌繁殖体系选出生长健壮的金钱松幼苗，通过探讨其消毒条件、抗生素试验、最佳诱导分化培养基，建立金钱松愈伤组织无菌培养体系。（3）建立金钱松快速繁殖体系筛选出有效组分含量高、适宜进行细胞悬浮培养的金钱松外植体；采用单因素试验和正交试验筛选出最佳培养基配方及培养条件，建立金钱松细胞悬浮培养体系。（4）建立金钱松低温保存技术为了保存金钱松的优良品质以及珍惜物种资源，从材料选择、材料预处理、冰冻保护剂、冰冻方法等的影响因素的探讨，建立高效的金钱松种质超低温保存技术。（5）建立金钱松60Co-r射线诱导技术 采取60Co-r射线诱导技术诱导金钱松遗传基础的改变，通过改变酶活性等提高金钱松的有效成分含量及重新组合得到有利用价值的金钱松突变体，并对60Co-r射线不同的剂量和辐射时间长短来进行研究。（6）建立金钱松多倍体诱导技术体系为了明显提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，对金钱松不同外植体进行实体人工诱导加倍法和离体培养加倍法的多倍体诱导以及对诱导后材料进行形态学鉴定和染色体核型鉴定试验。将培养的外植体和种子用不同浓度的秋水仙素在不同温度，光照等条件下处理不同时间并对所诱导的多倍体材料进行细胞染色体核型鉴定，筛选出诱导成功的金钱松多倍体组织和最佳诱导条件。（7）建立快速高产的金钱松多倍体悬浮培养体系采用均匀法对金钱松多倍体愈伤组织的悬浮培养基本培养基MS、B5、SH、White等的筛选；培养基中激素配比、各种附加物、接种量、光照条件、碳源、氮源、pH值等因素对培养细胞的生长速度和有效组分含量的影响研究；对金钱松多倍体悬浮细胞进行细胞活力的测定，测定培养细胞的生长曲线。（8）建立金钱松转基因体系为了提高金钱松有效成分含量、生产速度以及新的药用成分的发现，采用农杆菌介导植物建立金钱松转基因体系并对诱导条件进行优化；对诱导后的材料进行PCR扩增实验选出转基因成功的材料，再对转基因成功的材料进行不定芽、不定根的诱导生产出转基因植株。（9）建立金钱松发根生产体系为了更快、更高质量的生产药物有效成分，将转基因诱导成功的发状根进行离体发酵培养，初步生产药物有效成分，优化生产条件，初步建立金钱松发根生产体系。（10）多倍体及转基因培养产物成份累积及时空分布规律研究采用动态采样检测的方法，应用HPLC等检测技术对金钱松四倍体悬浮培养物和离体培养的发根系中有效组分的动态积累及时空分布规律进行研究。（11）建立金钱松内生菌培养体系筛选优良金钱松外植体，培养、分离内生菌，通过不同氮源、碳源、诱导因子、温度、PH等因素的实验，确定最佳培养基和培养条件，建立金钱松内生菌培养体系。（12）筛选、分离、鉴别金钱松内生菌通过对金钱松内生菌的各种生物活性特性实验，筛选出能产生药物有效成分、抗生素类物质的目标菌种并运用微生物分离技术分离出目标菌种；运用微生物形态学、细胞学、基因工程学等技术鉴别其所属。（13）建立产物特性菌种发酵培养体系将分离、鉴别后合成目标代谢产物的菌种进行发酵培养，通过对不同氮源、碳源、诱导因子、温度、PH等因素的实验，确定最佳发酵工艺，并绘制微生物生长曲线，确定其生长周期以及代谢产物动态积累曲线，建立金钱松特性内生菌发酵培养体系。（14）生产抗小卷蛾金钱松植株 将抗小卷鹅目的基因转入某菌种中，诱导生产抗小卷蛾“工程菌”并采用微生物细胞学鉴定，筛选出转基因成功的内生菌将其导入诱导的无菌金钱松再生植株中，运用细胞学、生态学、基因工程学等手段鉴定转基因植株。生产抗小卷蛾金钱松植株。（15）初步建立基因代谢工程采用微生物酶和蛋白质工程的手段和方法研究目标菌种的某些代谢控制酶和其底物的关系，初步探讨代谢途径，并将控制合成该酶的基因片段导入受体细胞中，影响其代谢途径，从而大幅度提高目的产物。（该研究初步）（16）金钱松培养产物和发酵产物分离纯化及药效毒理评价研究采用化学分离等技术对培养产物有效组分进行提取、分离和纯化工艺研究；采用比较药理学和毒理学方法对金钱松多倍体悬浮培养产物、转基因诱导产物进行全面系统的药效学和安全性评价研究。（17）规模化快速繁育技术体系优化初步建立根据上述研究结果，优化培养条件，完善基于生物工程技术的金钱松有效组分的快速繁育，和微生物发酵关键技术，初步建立大规模工业化生产金钱松药材药用成分、抗生素和转基因植株的技术体系。3、拟采用的技术路线 优良金钱松种质外植体筛选无菌体系建立最佳培养条件的建立建立农杆菌诱导金钱松转基因培养物成分的测定与含量分析培养产物的药理学及安全性评价建立金钱松多倍体悬浮体系多倍体鉴定建立秋水仙碱诱导金钱松多倍体体系建立金钱松发根生产体系及转基因植物的诱导PCR扩增鉴定初步建立金钱松四倍体悬浮培养和发状根发酵工业化生产关键技术金钱松Co60诱导金钱松种质超低温保存外植体的选择 → 金钱松无菌体系的建立 → 筛选出金钱松愈伤组织诱导、增殖的最佳培养基和培养条件→ 金钱松Co60诱导→金钱松种质低温保存→秋水仙素处理不同浓度、时间以及处理方式的确定 → 秋水仙素诱导离体培养体系的建立 → 金钱松四倍体的形态学、细胞学的鉴定 → 金钱松四倍体细胞的筛选 →  金钱松四倍体细胞悬浮体系的建立→  农杆菌处理不同浓度、时间、温度等条件的确立→农杆菌诱导金钱松体系的建立→ 金钱松转基因产物的细胞学鉴定→ 金钱松转基因产物的筛选→ 金钱松发根体系的建立→ 金钱松转基因植株的诱导→ 金钱松培养物成分的提取、纯化、结构分析和含量测定→ 对金钱松培养产物进行全面系统的药理学和毒理学和安全性科学评价→ 建立在离体培养条件下，大规模工业化生产金钱松有效组分和转基因植株的关键技术。 优良金钱松外植体内生菌分离建立内生菌培养体系确定最佳培养配方和培养条件分离、筛选目标内生菌生理生化实验建立目标菌种发酵培养体系确定最佳发酵工艺构造抗小卷蛾的“工程菌”分离纯化代谢产物并分析、含量测定建立基因代谢工程酶合成代谢研究生产抗小卷蛾金钱松植株初步建立目标微生物发酵产生药物有效成分和抗生素培养产物的药理学及安全性评价优良金钱松种子定殖实验 外植体的选择 → 金钱松无菌外植体的处理 → 金钱松外植体的预培养 →金钱松内生菌的培养 →扩大培养、确定最佳培养配方和培养条件 →内生菌生物学特性实验 →筛选，形态学、细胞学的鉴定 →确定目标菌种→ 抗小卷蛾基因的确定→将小卷蛾基因转入某菌种获得工程菌→细胞学鉴定工程菌→将工程菌转入金钱松再生植株 → 抗小卷蛾金钱松植株的筛选→ 建立目标内生菌培养体系 → 优化培养条→分离纯化代谢产物并分析、含量测定→对代谢产物进行全面系统的药理学和毒理学和安全性科学评价→研究代谢酶和底物的关系→确定控制酶基因→将控制酶基因转入目标菌种→建立基因代谢工程→初步建立目标微生物发酵产生药物有效成分和抗生素4、研究方案本课题的研究方法是以生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术、细胞悬浮培养技术、转基因技术为支撑点，筛选出金钱松愈伤组织分化增殖的最佳培养基配方和培养条件，采用秋水仙素实体人工诱导加倍法和离体培养加倍法两种方式对金钱松不同外植体和种子进行多倍体诱导，诱导出金钱松同源四倍体，并运用细胞悬浮培养的技术建立高产、稳定的金钱松四倍体细胞悬浮体系；采用农杆菌诱导金钱松转基因产物，并运用离体培养技术建立高效、高产、稳定、安全的金钱松发根培养体系和诱导转基因植株。同时以生物工程的微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程为支撑点，筛选出生产目标产物的内生菌并进行发酵培养，运用正交设计手段优化培养基配方和培养条件，稳定高效的生产目标产物。采用化学分离等技术对培养产物有效组分进行提取、分离和纯化工艺研究；采用比较药理学和毒理学方法对金钱松多倍体悬浮培养产物、转基因诱导产物进行全面系统的药效学和安全性评价研究。最终实现工业化生产金钱松药用成分及抗生素的目的。（1）诱导金钱松幼苗选用优良的金钱松种子在适宜的温度、水分、光照、促发剂等条件下，经过适当的预处理，分别通过土壤培养、培养皿培养以及无菌体系培养诱导其萌发，并采用均匀法筛选出金钱松中年种子萌发的最佳条件，并诱导成植株。（2）建立金钱松无菌繁殖体系选出生长健壮的金钱松幼苗，通过探讨其消毒条件、抗生素试验、最佳诱导分化培养基，建立金钱松愈伤组织无菌培养体系。（3）建立金钱松快速繁殖体系筛选出有效组分含量高、适宜进行细胞悬浮培养的金钱松外植体；采用单因素试验和正交试验筛选出最佳培养基配方及培养条件，建立金钱松细胞悬浮培养体系。（4）建立金钱松低温保存技术为了保存金钱松的优良品质以及珍惜物种资源，通过单因素试验饿正交试验，从金钱松种质的类别、年龄、生理状态以及冰冻保护剂、预处理方法、冰冻方法、解冻方法等的影响因素的探讨，建立高效的金钱松种质超低温保存技术。 （5）建立金钱松60Co-r射线诱导技术采取60Co-r射线诱导技术诱导金钱松遗传基础的改变，通过改变酶活性等提高金钱松的有效成分含量及重新组合得到有利用价值的金钱松突变体，并对60Co-r射线不同的剂量和辐射时间长短以及外植体种类、生理状况等来进行研究。并且为了观察射线对金钱松种子萌发的影响和希望提高金钱松种子萌发率，我们通过用60Co-r射线对金钱松种子进行诱导处理。分别从种子的浸泡时间、浸泡温度、剥皮与否、辐射剂量、辐射时间等因素来研究金钱松种子的萌发率。以找出能诱导出有利材料的最适条件。（6）建立金钱松多倍体诱导技术体系为了提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，选择生长状况良好的金钱松愈伤组织团块，以及已采用KNO3稀溶液处理低温保存的种子，使用将秋水仙素药剂用实体人工诱导加倍法和离体培养加倍法诱导金钱松多倍体；并依据不同的诱导材料，确立出使用秋水仙素溶液的最佳浓度、处理时间及处理条件，建立高效金钱松多倍体技术体系并对诱导后的材料的形态学和显微结构进行鉴定。（7）建立金钱松转基因技术体系为了提高金钱松有效成分含量、生产速度以及新的药用成分的发现，采用农杆菌介导植物的方法，从基本培养基的种类、激素配比、光照条件、农杆菌浓度、农杆菌种类、预处理时间、共培养时间、抗生素浓度、培养温度、pH值等多方面进行深入研究，确立金钱松不同外植体诱导发根的最佳条件，建立金钱松转基因体系；并对诱导后的材料进行PCR扩增实验测定转基因外植体中的rolB、rolC基因的整合，选出转基因成功的材料，再对转基因成功的材料进行不定芽、不定根的诱导生产出转基因植株。（8）建立快速高产的金钱松多倍体悬浮培养体系和多倍体培养产物成份累积及时空分布规律研究采用植物形态学、组织学和细胞遗传学等技术对诱导后的材料进行多倍体鉴定，选择多倍体诱导率高、生长状况好和有效组分含量高的材料进金钱松行悬浮培养。为了进一步提高金钱松有效成分的生产效率以及为工业化生产打下基础，依据使用金钱松多倍体的材料，从基本培养基的种类、激素配比、接种量、光照条件、碳源、pH值等多方面进行深入研究，确立影响金钱松多倍体细胞悬浮培养生长的最佳因素。测定培养细胞的活力，绘制出悬浮培养细胞的生长曲线，科学的确立多倍体悬浮培养的继代时间和生产周期。定时取样检测悬浮培养细胞中土槿酸化学物质的变化，弄清金钱松有效组分的积累动态和时空分布规律。开展生物转化研究，将悬浮培养基中的蔗糖浓度提高、改变培养基中无机盐含量、加入某种微量元素和适当添加外源前体，进一步提高各金钱松有效组分的含量。（9）建立快速高产的金钱松发根液体培养体系和培养产物成份累积及时空分布规律研究 采用形态学、PCR扩增等技术对诱导后的材料进行转基因鉴定，选择转基因成功、生长状况好和有效组分含量高的材料进金钱松发根液体培养体系培养。从基本培养基的种类、激素配比、光照条件、温度、pH值等多方面进行深入研究，确立金钱松不同外植体诱导发根的最佳条件。测定培养细胞的活力，绘制出毛状根的生长曲线，科学的确立毛状根培养周期。定时取样检测培养物中土槿酸化学物质的变化，弄清金钱松发状根有效组分的积累动态和时空分布规律。开展生物转化研究，在培养液中适当添加营养元素、外源前体，进一步提高各金钱松发状根继代速度和有效组分的含量。（10）建立金钱松内生菌培养体系筛选优良金钱松外植体，培养、分离内生菌，通过不同氮源、碳源、诱导因子、温度、PH等因素的实验，确定最佳培养基、培养条件以及最佳分离培养基及条件，建立金钱松内生菌培养体系。（11）筛选、分离、鉴别金钱松内生菌通过对金钱松内生菌进行各种生物活性特性及生理生化实验，筛选出能产生药物有效成分、抗生素类物质、多糖类物质等其他有用成分的目标菌种，并运用微生物分离技术分离出目标菌种；运用微生物形态学、细胞学等技术鉴别其所属。（12）建立目标菌种发酵培养体系将分离、鉴别后合成目标代谢产物的菌种进行发酵培养，通过对不同氮源、碳源、诱导因子、温度、PH等因素的实验，确定最佳发酵工艺，并绘制微生物生长曲线，确定其发酵周期以及绘制代谢产物动态积累曲线，建立金钱松目标内生菌发酵培养体系。（13）构造抗小卷蛾的“工程菌”采用分子生物学和细胞遗传学方法，确定抗金钱松小卷蛾基因，并进行复制、剪切，将其导入某种菌株，构造抗金钱松小卷蛾“工程菌”，采用分子生物学手段进行鉴定。（14）生产抗小卷蛾金钱松植株筛选出构造成功的“工程菌”将其导入诱导的无菌金钱松再生植株中，运用细胞学、生态学等手段鉴定转基因植株。生产抗小卷蛾金钱松植株。（15）分离纯化代谢产物并分析、进行含量测定采用动态采样、检测、分离的方法，应用HPLC等检测技术对发酵产物有效组分的动态积累及时空分布规律进行研究。（16）初步建立基因代谢工程采用微生物酶和蛋白质工程的手段和方法研究目标菌种的某些代谢控制酶和其底物的关系，初步探讨代谢途径，并将控制合成该酶的基因片段导入受体细胞中，影响其代谢途径，从而大幅度提高目的产物。（该研究初步）（17）初步建立目标微生物发酵产生药物有效成分和抗生素 根据上述研究结果，优化培养条件，完善基于生物工程技术的金钱松内生菌发酵生产药物有效组分和抗生素的关键技术，初步建立大规模工业化发酵生产药用成分和抗小卷鹅转基因植株的技术体系。一、立项的必要性及国内外研究现状、发展趋势1、立项的必要性及国内外研究现状、发展趋势（1）金钱松资源状况分析　金钱松(PseudolarixkameferiGord.)是我国特有的著名古老孑遗松科(Pinaceae)树种。据化石资料推断，金钱松大约起源于白垩纪中晚期,曾广泛分布于北纬33°～52°地区，世大冰期后,各地金钱松相继灭绝,只有在长江中下游地区幸存下来。加上金钱松结子有大小年之分，一般3～5年丰产一次，由此对其大量繁殖有明显地影响，同时残存个体稀少，分布零星，人为的破坏，使其生存环境受到严重威胁，现在正处于濒危状态,已被列为国家二级保护植物。金钱松材性优良,耐水湿,树形优美,是优良的建筑、家具等用材树种；树干端直挺拔，树冠呈尖塔形，叶线形，长3～7cm，簇生于短枝端，形似古钱，叶初展色翠绿，入秋时转为金黄色，为世界闻名的五大观赏树种之一。据《本草纲目抬遗》第六卷木部记载：“汪连任采药书，罗汉松一名金钱樵，又名仓松，其皮治一切血，杀虫痒癣，台芦荟香油调擦，按其主治应为金钱松。金钱松树皮和根皮(中药名为土槿皮或土荆皮)因为性辛,温,有毒,具有止痒杀虫的功能，外用于治手脚癣、神经性皮炎、湿疹。自20世纪80年代以来,金钱松的化学成分及其药理作用再次受到关注.研究发现:金钱松的化学成分主要有二萜类化合物、三萜类化合物、木脂素类化合物、倍半萜类化合物以及其他类型化合物，其中最主要的有效成分是属二萜类化合物的土槿酸。现代药理实验表明:这类化合物还具有抗真菌、抗肿瘤、抗早孕、使胆囊自截等功效。这些研究结果预示着随着对金钱松活性成分的不断深入研究，其用途还将进一步增多。植物内生菌是指那些寄生在植物体中，度过全部或部分生活史而对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，由于内生菌长期生活在植物体微环境中，与之协同进化，在演化过程中二者形成了互惠关系。内生菌不仅能参与植物次生代谢成分的合成，或对植物次生代谢产物进行转化，而且还能够有效的抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性和独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物新的重要来源。最新研究表明某些植物内生真菌能产生与宿主植物相同或相近的代谢产物和其它新的天然产物近来发现的天然产物11%来自植物和动物38%来自土壤微生物而来自植物内生真菌的则占51%之多。内生菌存在于所有植物体中，但金钱松含有丰富的内生菌，何佳等人在快速筛选金钱松内生真菌抗真菌活性的研究中根据菌落培养特征，先后四次共从金钱松茎和叶中分离出内生真菌105株。随着医药卫生事业的发展，人们对金钱松的需求量还将进一步增加，最终导致其价格不断攀升，药材市场的缺口越来越大。 （2）金钱松人工栽种现状分析   大量开展人工栽种金钱松药材是解决其供不应求的重要途径。金钱松人工种植方式主要为有性繁殖和营养繁殖2种情况。有性繁殖即种子繁殖，金钱松对环境适应力不强、结实率低、结实间隔期较长(一般3～5a结实1次)、采种条件苛刻（采种母树年龄以100年左右为最好），尽管金钱松种子不存在形态后熟和生理后熟的特性但种子成活率低（成活率60%-70%）、种子保存条件要求高（室内常温条件对保持金钱松种子的生命力极为不利，贮藏金钱松种子需过低的温度，尽管如此种子的发芽能力也只能保持两年且发芽能力仅相当于贮藏前发芽能力的50以下）等特点也对金钱松大量繁殖有明显限制。无性繁殖即扦插繁殖，为10年以下植株的枝条扦插，金钱松为菌根性树种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地，或在土内有菌的林间育苗，喜光爱肥，适宜酸性土壤，生长受气候因素影响明显加之整齐度不理想，生长周期长，易受金钱松小卷蛾(CelphapseudolaxicolaLiu)的严重危害，轻则使金钱松叶枯，长势弱，重则使金钱松枯死，如湖南安化县芙蓉山林场的金钱松林因该虫的危害而枯死，以致砍伐殆尽这给金钱松药材野生抚育的人工栽培和生产管理带来了许多困难，同时也在很大程度上限制了金钱松药材的大规模生产。而且长久如此栽种,还易引起品系的退化,降低对病虫害的抵抗力,产量也随之大幅度下降。另外，利用野生抚育技术栽培的金钱松药材，生长周期和野生药材一样都需要9-10年较长的时间，并且药材中总药用成分的含量没有明显地增高。当前我国要实现中药现代化，正好进一步促使了传统中医药与现代生物工程技术相结合。为此，本课题采用生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术、转基因技术和细胞悬浮培养技术相结合，很好地解决金钱松药用植物栽培困难、生长周期长、有效成分含量低的难题，极大地提高有效成分生产率，排除病菌和虫害的侵扰，并从源头上严格控制药材质量，保证金钱松药材的“安全、高效、稳定、可控”问题，大力开发金钱松药材资源。同时采用生物工程的微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程将金钱松中丰富的内生菌运用起来，开发新的药用资源，发酵生产有效成分。解决市场药物急缺现象。（3）金钱松生物工程繁育的优势分析 由于金钱松药材在生长过程中对环境的温度、土质、气候等条件有特殊的要求，采用生物技术生产金钱松中药材可不受外界环境影响，通过筛选出高产的金钱松细胞株系进行大规模悬浮培养及再生植株培养，并对培养基和培养条件进行有效调控，可得到产率高，产量、质量可靠和可控的优质中药原料，最终实现金钱松名贵中药材快速规范化生产的目的。采用生物工程的微生物的各项技术，用金钱松内生菌进行发酵生产药用成分。   由于金钱松是近年才被世界关注的，还没有对金钱松组培方面的相关报道，但对金钱松内生菌、化学成分、生物活性、药理应用及培育栽培技术的相关报道很多。如何佳等的快速筛选金钱松内生真菌抗真菌活性的研究，蒋宣斌等的金钱松育苗试验初报，刘洪亮等的金钱松化学成分及生物活性研究现状与展望。为了快速繁殖金钱松 和生产出有效成分含量更高的药材以缓解金钱松野生资源面临的危机，我们实验室决定进行组织培养和内生菌发酵两方面的研究工作。研究出诱导金钱松愈伤组织的最佳培养基及诱导多倍体、转基因的最佳培养基和诱导条件，建立建立金钱松多倍体悬浮体系、发根生产体系及完整的不依赖于基因型的金钱松植株再生体系；目标内生菌发酵的最佳培养基和培养条件；对培养物进行成分的测定与含量分析及培养产物的药理学及安全性评价达到初步建立川贝母四倍体悬浮培养工业化生产关键技术的目的。 药用植物和农作物不同，是一类具有特殊用途的经济植物，其主要成分来自植物的次生代谢产物，植物次生代谢产物对植物本身不是必要的但是对人类却有很大的使用价值和意义，但其合成量极少，合成途径很复杂。多倍体诱导技术已成为选育优良品种，克服源远杂交不孕性、不实性，提高中药材产量和质量的有效途径。这主要是由于药用植物一般以植物的特定器官为收获对象供药用,由于多倍体植株染色体加倍,往往具有器官“巨型性”特征,所以多倍体诱导可更大幅度的提高药材的产量；另外，药用植物由于染色体数目加倍，也使得染色体上基因调控有效化学成分含量较正常二倍体也增高，使得次生代谢产物含量也明显的增加，从而进一步提高了药用植物的质量。目前自然环境遭到严重的破坏，野生药用植物资源种类和数量急剧减少，为了更好地解决这一问题，开展药用植物的多倍体诱导是非常重要的。高山林等人最早成功地培育了四倍体丹参优良品系,段英姿等用秋水仙碱成功的诱导南丹参多倍体，陈柏君等人采用秋水仙素成功诱导了黄芩同源四倍体，对本项目的研究具有一定的指导意义。毛状根诱导转基因技术已成为高效、高质量的生产药用植物有效成分和再生植株的新的有效途径，通过外植体诱导的毛状根具有生长迅速和遗传稳定以及能在无激素的培养基上生长的特点，它能合成与原植物含量相当或高于原植物含量的次生代谢产物。同时将诱导成功后的毛状根置于含不同生长调节物质配比的培养基上诱导获得转基因再生植株。王跃华等人成功建立了川黄柏高效遗传转化系统和植株再生系统，赵寿经等在发根农杆菌诱导人参产生发根及离体发根中人参皂苷含量的测定中诱导的发状根中人参皂苷含量高达10.38mg/g超过六年生人参中的人参皂苷含量6.45mg/g。Parr等,通过诱导长春花形成发根，从发根中检测到了长春碱。长春碱和长春新碱是存在于长春花中的具有抗癌作用的双体吲哚生物碱。一直以来，通过长春花的细胞培养都没有能够得到这两种生物碱，这说明发根能够合成某些悬浮细胞不能合成的次生物质.这些研究对本项目的研究具有一定的指导意义。植物内生菌与宿主植物协同进化，有相同或相似的生理活性，内生菌也能单独合成产生与宿主植物相同的有用次生代谢产物，它们不是微生物本身所必须的，因此植物内生菌是生产药物有效成分的又一巨大宝库。内生菌发酵生产药物有效成分，条件易控制，产物易分离，生产周期短能有效的解决药物短缺问题。当前，市场上金钱松药材商品非常短缺，现在也只采用金钱松培育栽培，需要严格的培育条件和操作管理，在实际生产很难解决市场需求。而细胞系悬浮培养技术是一种广义组织培养，仅通过对愈伤组织的诱导培养后，将游离的细胞和毛状根 悬浮在液体培养基中进行的一种培养方法。此种悬浮培养方式使得培养物生长速度明显加快，生长周期大大缩短，操作的技术难度有效降低，并且适合于大规模的工业化生产，是目前生产药用植物有效成分最有希望的途径之一。微生物发酵技术同样如此。同时通过毛状根诱导再生植株也能很好的解决种子获得难、贮存难、萌发率低、生长条件苛刻等问题大量繁殖植株苗，在一定程度上解决栽种问题。（4）植物内生菌生物学效应和研究现状分析由于内生菌生活在没有外在感染的健康植物组织内部，长期以来其存在和作用一直为人们所忽视。近年来随着人们对植物内生菌研究的深入，对微生物资源的不断开发，微生物研究领域的不断扩展，植物内生菌成为了巨大且宝贵的微生物资源库。由于植物内生菌能产生多种活性物质，在生物防治，医药卫生等领域有着巨大的潜力，现已成为国内外研究学者的热点。番茄、辣椒、长春花、云南红豆杉等多中植物中的内生菌已经得到成功的分离。对植物内生菌生物学效应的研究成果也比比皆是如促生作用，内生菌能产生促植物生长物质如植物激素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。张集惠等从兰科药用植物中分离出5种内生菌，并从这些真菌发酵液和菌丝体中分别提取出5种植物激素，它们对兰花的生长发育有较好的促进作用。沈德龙等已证明水稻内泛菌YS19能分泌四种不同的植物生长激素，他们共同调节水稻的生命活动，能影响水稻乳熟期光合产物的分布。内生菌也能增强植物吸收N、P等营养元素或与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而间接促进植物生长。Lyons等报道，在低水平氮源的土壤中，内生真菌可增加宿主对N元素的吸收。内生菌有和宿主相同或相似的生理活性，能产生有效药物成分，如产生抗肿瘤物质，Stierle等从短叶红豆杉的韧皮部中分离到一株negotiations产生紫杉醇的内生真菌紫杉醇是近年来发现的重要抗肿瘤药物之一。张玲琪等分别从抗癌药用植物长春花、桃儿七和美登木分离到产抗癌药物长春碱、鬼臼毒素类似物和毛壳甲素的内生真菌。抗生素，StrobelG等从雷公藤的茎中分离得到一株内生菌，它不但能抑制灰葡萄孢等一些植物病原真菌，对白色念毛霉及发癣菌也具有强烈抑制和杀灭作用还能抑制白假丝酵母等人类病原真菌。内生菌能增强宿主植物的抗逆性，王万能等人从烟草根部分离的内生菌118菌株能防治烟草黑胫病。Chen等用来自棉花的内生菌回接棉花，可以减轻人工接种感染的棉花枯萎症状。在植物内生菌中转入抗病抗虫基因，将其作为外源基因载体是现代植物病虫害生物防治又一新思路。加上在植物中直接转入抗病虫基因没有在植物内生菌中转入抗病虫基因简单容易，被转入抗病虫基因的内生菌在宿主中表达，抗病虫物质直接分泌在植物体内，更易被运转而且绿色环保。Snyman，S.J等人将Bt杀虫蛋白基因crylAc7导入甘蔗内生菌构建出工程菌并使其成功表达，对甘蔗害虫E.saccharina表现出杀毒作用。（5）金钱松内生菌研究现状分析近年来金钱松的抗真菌、抗肿瘤、抗早孕、使胆囊自截等功效才被世人发现，金钱松内生菌才被研究者关注，对其生物学研究还不全面，只涉及几个领域如抗真菌、杀螺等。何佳等在快速筛选金钱松内生真菌抗真菌活性的研究中筛选出抗真菌的金钱松内生菌。郭尚彬等人在 金钱松内生真菌杀螺活性菌株筛选中筛选出杀螺活性的金钱松内生菌。郭尚彬等在金钱松内生真菌JJ18杀螺作用实验研究中研究了金钱松内生真菌JJ18的杀螺活性。郭尚彬等在金钱松内生真菌JJ18灭螺活性与菌株鉴定中得出杀螺活性最强的JJ18为黑曲霉。郭尚彬等在具有灭螺活性的金钱松内生真菌JJl8发酵条件优化中对接种量、装液量、温度、代谢调节因子磷酸二氢钾、培养基、初始pH值、马铃薯的加入量、碳源、氮源等液体发酵工艺参数进行优化得出JJ18的最佳发酵条件。（6）种质超低温保存研究超低温保存为液氮（-196）低温下的保存，在此温度下，植物材料的物质代谢和生命活动几乎完全停止。目前，超低温种质保存技术在许多药材、果树等植物上成功的得到应用。该技术不仅能长期保存无性优良品系和纯种，还可解决组织和细胞继代培养中的变异，保存稀有珍惜和濒危的种质资源。低温保存最重要的是对种质的预处理，其原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水含量，增强细胞抗寒力。超低温处理之所以能保护种质有如下原因1、降低温度时，膜脂由液晶态向凝胶态转变，提高膜磷酸酯的不饱和程度而增加抗低温能力。2、低温时细胞发生保护性脱水，从而免遭细胞内大量结冰引起细胞死亡。3、低温使液泡发生内吞作用，将细胞质中的大分子物质吞入，提高液泡渗透势，阻止冰核形成，出现过冷状态即低于水（溶液）的凝固点却不结冰的现象。4、低温可以诱导抗冻蛋白，当细胞内水分形成冰核后抗冻蛋白与之结合，阻止冰核的扩大，起到抗冻的效果。为了保护金钱松种质的优良品系和资源，研究金钱松的超低温保存技术。（7）金钱松60Co-r射线诱导技术研究60Co-r射线诱导技术是以60Co-r射线照射，利用射线的高能量诱发生物的遗传变异，促使遗传基础的改变和重新组合得到有利用价值的突变体。辐射育种最早是1927年美国人穆勒用果蝇做实验时发现的，至1989年已有51个国家在136种植物中获得成功并推广了1330个品种。目前辐射育种主要用于农业和畜牧业。60Co-r射线诱导有以下效应：1、60Co-r可以改变细胞内一些酶的含量及活性来增加有效成分在生物体中的积累，减少它们的生长周期。如三楚桃在用60Co-r射线辐照蜜环菌时发现其对生长及酶活性有较大影响，能通过提高SOD酶的活性来增加SOD的积累。2、射线辐射可以改变细胞中的基因序列，从而导致变异。我们则可以从变异的品种中筛选有利的新品种。3、60Co-r射线辐射也是一种打破种子休眠，促进萌发的有效方法之一。这是因为有时射线可以激活细胞内的一些与萌发有关的酶从而达到打破休眠，促进萌发的作用。因此用60Co-r射线进行物理诱导变异来提高种子的萌发率和研究有效成分含量高、生长周期短的新品种有重大意义。（8）生物工程技术在中药增产中研究现状分析    悬浮培养技术是当今药用植物实现工业化生产的必经之路，传统中药材对土地、气候、生长年限等环境条件有很大的依赖性。利用生物技术培养高产细胞株系，大规模进行细胞悬浮培养，并不断改善植物细胞体外培养条件，可大大地提高药材细胞中次生代谢的含量，并且还可以通过向培养基中添加药物合成的前体物质，经培养将其转化为目的化合物，以此来增加有效成分的含量，最终实现名贵中药材快速大规模生产药物的目的。近年来,悬浮培养技术日益完善，国内外学者利用该技术已进行了几十种药材的有效成分生产,其中人参、红豆杉、毛地黄、紫草、日本黄连等都已实现了工业化生产。如抗癌药物紫杉醇的药用植物红豆杉的细胞悬浮培养物，已可用75t发酵罐培养生产，实现了大规模商业化生产水平；中国药科大学组培室已进行了人参的大规模生产培养，并对其培养细胞进行化学成分（皂甙、灰分、金属离子、氨基酸）和药理活性（急性毒性、镇静作用、抗疲劳作用、抗高温作用、吞噬机能）比较分析,结果与种植人参无差异；我国工程院院士、上海医科大学的胡之壁教授建立了丹参酮的细胞培养系统，并发现丹参培养物具有丹参酮和隐丹参酮的合成能力，证明了来源于组培根的悬浮培养物中的隐丹参酮的含量为原植物的6.8倍。发根培养体系生产药物有效成分技术日益受到世界科学家的关注并在研究中得到一定成果。Shimomura等诱导紫草再生植株产生的发根在2L气升式反应器中生长迅速，通过与反应器连接的AmberliteXAD-2大孔树脂柱将分泌到培养基中的紫草色素回收，每天可吸收5mg紫草色素，且可连续生产220d。这充分展示了生物工程技术在生产药物有效组分方面的光辉前景。而目前还未见有关利用生物工程技术大规模地生产金钱松有效成分的研究报道。为此本课题采用多项现代生物工程技术，通过对金钱松离体培养材料的诱导培育，筛选出生长速度快、金钱松有效组分含量高、药理作用优于原药材、无毒副作用和安全可靠的金钱松快速繁殖细胞系，进一步建立生产条件可控并能大规模快速生产金钱松有效组分的培养体系，很好地解决了金钱松药材在传统生产过程中存在的生长条件苛刻、周期长，药材产量和有效成分含量低等问题，最终实现工业化发酵生产金钱松的化学成分主要有二萜类化合物、三萜类化合物、木脂素类化合物、倍半萜类化合物以及其他类型化合物等药物有效组分，以缓解金钱松药材市场的紧缺和更有效地保护金钱松野生植物资源。一、项目的创新性。(理论创新、应用创新、技术创新)1、思路创新  长期以来金钱松药材主要采用种子和扦插枝条进行繁殖，由于金钱松生长周期长，繁殖系数低，种植技术难度大，生产成本投入高等方面的因素，大大地限制了金钱松药材的大规模生产。本研究采用多种生物技术联合和多种微生物工程技术的思路，可以有效解决上述不足。在研究思路上具有创新性。2、方法集成创新  本项目首次利用组织培养技术、多倍体诱导技术、转基因和细胞悬浮培养三项生物技术相结合,快速培养出金钱松四倍体细胞、和转基因细胞系，并最终建立高产、稳定的金钱松四倍体、毛状根离体细胞悬浮培养的关键技术。同时采用微生物分离技术、微生物培养技术、微生物菌种选育技术、微生物发酵技术及微生物基因工程发酵生产优良、高质量的代谢成分。体现了多种技术方法结合的技术集成创新。 一、项目应用前景金钱松是濒危药材，目前存在人工栽种难度大、药材生长周期长、有效成分含量低等问题。利用生物技术建立金钱松高产四倍体细胞悬浮培养体系和毛状根培养体系，可大规模、快速生产有效成分含量高、质量可控的优质金钱松药材原料，较好地解决金钱松药用植物栽培周期长，繁殖较困难的难题；并且该技术是在无菌条件下进行的细胞悬浮培养和根系培养，可排除病菌和虫害的侵扰，严格控制药材质量，完全解决农药残留和重金属含量问题，生产出真正意义上的绿色药物；同时，通过对金钱松离体培养条件的改变，还可进一步筛选出具有明显生理活性的新物质。采用植物内生菌微生物发酵技术生产有效成分生产周期短，生产效率高，也是当今世界研究的热点。因此，采用生物技术生产金钱松中药材具有非常广泛的应用前景。       五、项目应用意义数据显示，人类癌症有100余种，癌症发病率为25%，在我国发病率最高的是消化道癌症和呼吸道癌症如胃癌、肺癌等。2003年4月8日，世界卫生组织国际癌症研究中心公布，就目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增长50%。现在中国癌症发病率也呈明显上升趋势，最新统计资料显示，中国每年癌症新发病例为二百二十万，因癌症死亡人数为一百六十万。近二十年来，中国癌症死亡率上升了近30%，每4、5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。面对如此威胁，现在的抗癌药物却屈指可数且价格昂贵。放疗、化疗正抑制癌细胞生长的同时也会抑制其他正常细胞的生长、复制，副作用相当大且无可避免。为此，高效、安全、经济的抗癌药物的开发利用是当今世界亟待解决的问题。现代药理研究发现，从金钱松根皮和近根皮中提取出来土槿酸及其衍生物具有抗癌作用，能作用于多种癌细胞如人胃癌细胞、人宫颈癌细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人卵巢癌细胞等。且具有明显的量效关系。研究发现土槿乙酸及其衍生物的抗癌机制是通过破坏肿瘤细胞凋亡来实现的。细胞凋亡主要有两种通路，一种是以FAX和TNFR为代表死亡受信号传导途径；另一种是以线粒体为核心的凋亡途径。线粒体在细胞生理活动中起着关键作用，线粒体膜电位的下降将影响线粒体乃至整个细胞的功能活动，最终使线粒体内凋亡活性物质释放。bax和bel_2是bel家族的两个成员，通常是以复合物的形式存在，前者为凋亡因子，后者为抗凋亡因子，在细胞凋亡过程中土槿酸及其衍生物能够诱导肿瘤细胞产生凋亡小体，DANladder和细胞凋亡峰，上调凋亡基因bax的表达，促凋亡蛋白可与线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC）相互作用促进线粒体通透性转变孔（MPIP）开放，MPIP高水平开放的直接效应是导致线粒体膜电位下降，细胞色素C释放进而激活caspase，最终导致细胞凋亡。同时下调抑凋亡基因bel_2的表达，抗凋亡蛋白可拮抗bax的上述作用而抑制细胞凋亡。土槿酸及其衍生物上调bax，下调bel_2表达的同时，线粒体膜电位水平下降，表明土槿酸及其衍生物可通过bax，bel_2，蛋白表达的改变进而通过上述途径导致线粒体膜电位下降，细胞色素C释放，激活caspase，导致细胞凋亡。因此，对金钱松有效组分的生产和研究具有重大意义。六、已有研究基础和承担优势 我们实验室已经对青蒿、川芎、杜仲、半夏、川黄柏等药用植物进行了各种生物技术的研究都取得了很好的成功，现在正在对卷叶贝母进行研究，很多研究已取得成果。六、项目的年度进度及预期目标项目的年度进度年度进度2010年 金钱松愈伤组织、鳞茎诱导及增殖的最佳培养基配方的筛选 金钱松各种培养物的最佳培养条件的筛选金钱松愈伤组织四倍体的诱导和鉴定金钱松四倍体的诱导和鉴定金钱松内生菌的分离、培养金钱松内生菌的生物学效应试验金钱松种质超低温保存金钱松60Co-r射线诱导2011年 金钱松毛状根的诱导金钱松转基因鉴定金钱松四倍体细胞的扩大培养研究金钱松四倍体细胞悬浮培养体系的建立金钱松内生菌的筛选、鉴别金钱松目标菌种的培养，条件优化2012年金钱松发根培养体系的建立金钱松毛状根诱导再生植株再生植株转基因鉴定 对培养细胞和液体培养液进行成分的提取、分离 诱导抗小卷蛾金钱松植株2013年 构造转基因目标微生物 对提取的物质进行纯化和结构分析与含量的测定 对培养物进行全面系统的药理学、毒理学和安全性检测2014年试验结果的分析和总结撰写、发表论文和研究报告，申报专利成果鉴定预期目标◆获得金钱松愈伤组织及增殖的最佳培养基配方和培养条件的关键技术；◆建立优质、高产和稳定地生产金钱松有效组分的关键技术。◆建立优质、高产和稳定地内生菌发酵生产目标产物的关键技术。◆探讨酶和蛋白质、基因工程在微生物代谢途径中的控制机理。◆实现在离体培养条件下大规模工业化生产金钱松药用组分的目的。◆发表高质量研究论文12-14篇。