生物技术制药完整

第一章生物技术：以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程学相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。第二章：基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。透析培养：透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。高密度发酵：是指培养液中菌体的浓度在50gDCW/L以上，目的是降低成本，提高效率。离子交换层析：离子交换层析是以离子交换机为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。疏水层析：利用蛋白质表面的疏水区域和固定相上疏水基团之间的相互作用力差异，对蛋白组分进行分离的层析方法。亲和层析：亲和层析是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使结合解除。如抗体与抗原、激素与受体、酶与底物或抑制剂之间的作用。凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。基因工程技术生产药品的优点：1.利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。2.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。3.利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。4.内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程对其进行改造。5.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程药物制造主要步骤：1.目的基因的克隆，构建DNA重组体，构建工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验。化学合成目的基因的先决条件：必须已知其核苷酸排列顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的核苷酸序列。人工合成基因的限制：1. 不能合成太长的基因。2.人工合成基因时，遗传密码的简并性会为选择密码子带来很大困难，当以氨基酸顺序推测核苷酸序列时，不一定与天然基因完全一致，已造成中性突变。3.费用较高。基因工程宿主菌应满足条件：1.具有高浓度、高产量、高产率；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行重组DNA技术；产物容易提取纯化。目前应用最广泛的宿主菌:大肠杆菌。表达载体需具备的条件：载体能够独立地复制；应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；具有很强的启动子。能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；有阻遏子，是启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的ｍＲＮＡ较为稳定。真核基因在大肠杆菌中的表达形式：1.以融合蛋白的形式表达药物基因。2.以非融合蛋白的形式表达药物基因。3.分泌型表达蛋白药物基因。表达用的酵母菌应满足的条件：1.菌体生长力要强。2.菌体内源蛋白酶要较弱。3.菌株性能要稳定。4.分泌能力要强。基因工程在发酵过程中对发酵罐的要求：1.要提供菌体生长的最适条件。2.培养过程不得污染、保证纯菌培养。3.培养及消毒过程中不得游离出异物，不能干扰细菌代谢活动。离子交换层析原理：离子交换剂由三部分组成：①不溶性的惰性高分子聚合物基质，也被称为载体②共价键结合于载体上的不能移动的荷电基团，称为活性基团或功能基团③与活性基团以离子键连接的活性离子，带有与活性基团相反的电荷，又称为平衡离子或反离子。疏水层析原理：蛋白质表面多由亲水基团组成，也有一些疏水性较强的疏水区。在高盐浓度时，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水作用增强，与固定相上的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来。亲和层析原理：通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质（也称载体）上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。凝胶过滤层析优缺点：优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性。缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间。第三章：细胞工程：细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。悬浮培养：细胞自由地悬浮在培养基内生长繁殖。贴壁培养：细胞贴附在某种基质上细胞才能生长繁殖的培养方法。 代谢工程：利用基因工程手段，使工程细胞增加或减少某种酶改变它的代谢能力和途径，降低培养需要，减少代谢产物的危害，以便控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。组织工程：通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏等，并用于临床治疗。动物细胞生理特点：1细胞分裂周期长，动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。2细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象3二倍体细胞寿命有限（异倍体细胞系寿命长）4对生长环境要求敏感5培养基要求高6合成的蛋白质有修饰动物细胞培养是加入血清的作用机制：1.提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素。2.提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子。3.提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白。4.提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。5.良好的PH缓冲系统无血清培养基的优点：1.提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响。2.减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险。3.供应充足、稳定。4.细胞产物易于纯化。5.避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。6.减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。动物细胞大规模培养的的方法：1.悬浮培养。2.贴壁培养。3.贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养。（微载体培养，包埋和微囊培养，结团培养）动物细胞悬浮培养的优缺点：优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细胞发酵的经验。缺点：细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。动物细胞贴壁培养的优缺点：优点：使用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式是细胞达到高密度。缺点：操作比较麻烦，需要合适的贴壁材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。**动物细胞包埋或微囊培养的优缺点：优点：1.包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。2.获得较高的细胞密度，一般在10^7到10^8个/ml以上。3.当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在为囊内，从而有利于下游产物的纯化。4.可采用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生物反应器。。**动物生物反应器作用：生物反应器满足要求：制造生物反应器锁采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的。生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能。密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染。对培养环境中多种物理化学参数能自动监测和调节控制，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一。可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要。容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积。拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。设备成本尽可能低。动物细胞生物反应器类型： 搅拌罐式生物反应器。气升式生物反应器。中空纤维式生物反应器。透析袋或膜式生物反应器。固定床或流化床式生物反应器。第四章抗体：由B细胞接受刺激后分化为浆细胞产生的能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白。凝集反应：在颗粒抗原（细菌、红细胞）中加入相应抗体，在有适量电解质存在下，能形成肉眼可见的凝集块。反向被动血凝试验：用纯化的抗体致敏栓化血细胞测定相应抗原。免疫导向疗法并没有成功的障碍：1.单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h,难以维持有效药物作用靶组织时间。2.完整的抗体分子，Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。对单克隆抗体进行改造：1.降低单克隆抗体的免疫原性。2.降低单克隆抗体的相对分子质量。**单克隆抗体制备流程：145页动物体内诱生法制备单克隆抗体优缺点：优点：操作简便，比较经济，获得单克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。**鼠源性单克隆抗体改造后类型及各自特点：人-鼠嵌合抗体：改性抗体：小分子抗体：1.Fab。2.Fv或ScFv。3.单域抗体。4.最小识别单位。多功能抗体的优点：具有高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。有应用价值的抗体应具备特征：1.能搞选择性、高亲和性地同把抗原或肿瘤相关抗原结合。2.在血循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力。3.应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，是重复给药不受限制。4.分子应大小适中，机能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的滞留时间。抗体导向酶前药疗法：活化酶最好来源于非哺乳动物，人体内部存在相应的类似物，以保证高度的特异性。能通过化学交联与单抗结合，在较长的一段时间内保持稳定性和活性。前药：本身无活性或活性很低，只能被相应的酶活化为高度扩散型的小分子，以实现在肿瘤组织内的广泛分布和杀伤肿瘤细胞。还应具有极短的生物半衰期，避免重新进入循环产生非特异性毒性。第五章植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、制造新品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门技术。 植物细胞全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。植物组织和器官培养：指在无菌和人工控制条件下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。植物分化：胚胎发生：从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚，进而发育为成熟胚和种子。器官发生：种子在适宜的条件下萌发，通过器官分化过程，形成根、茎、叶、花、果实。脱分化：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下变成未分化的细胞和组织过程。再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下再分化成为胚状体或直接分化出器官。愈伤组织培养：从植物体的各种组织、器官等外植体，经脱分化而形成的细胞聚集体的培养。胚胎培养：未成熟或成熟的胚胎的离体培养。分生组织培养：在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。外植体：指用于植物组织培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、花药和花粉等。无性繁殖系：即克隆，在植物细胞工中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。变异体：无性繁殖培养中，局部组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，继续进行选择培养，则可从同一无性系分离形成两个或多个不同系列。突变体：经过确证已发生遗传变异或新的培养物至少通过一种诱变处理而发生变异所得的新细胞。植物抗毒素：指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。诱导子：在植物抗病生理过程中诱发植物生产植物抗毒素和引起植物过敏反应亦称抗性反应或自身防御反应的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。生物诱导子：植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质。非生物诱导子：所有不是植物细胞中天然成分但又能触发形成植物抗毒素信号的因子，内源性诱导子：指来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物及沉积在细胞壁上的木质素。外源性诱导子：病源微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物。生物转化：指利用生物离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应。次级代谢作用的定义与特征：定义：次级代谢作用是由特异性蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。特征：1.有明显的分类学区域界限2.其生物合成需在一定的条件下才能发生3.缺乏明确的生理功能4.是生命活动的多余成分。植物细胞培养中细胞体产生原因：1.细胞分裂之后没有进行细胞分离。2.在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌黏多糖和蛋白质，或者以其他方式形成黏性表面，从而形成细胞团。植物细胞培养中常用灭菌剂：次氯酸钙次氯酸钠氯化汞P185植物细胞两步培养法目的：第一步使用适合细胞生长的培养基目的：得到最佳生长第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基目的：得到最佳次级代谢产物影响植物次级代谢产物产生和累积的因素：1.生物条件2.物理条件3.化学条件4.工业培养条件 植物与微生物的差异：具有细胞壁，液泡和质体。P181植物细胞培养的反应器类型：1.机械搅拌反应器2.鼓泡塔生物反应器3.气升式生物反应器4.转鼓式生物反应器5.固定化细胞生物反应器**在植物细胞大规模培养中应综合考虑的因素：两相培养细胞需满足的条件：1.添加的固相或液相对细胞无毒害作用，不影响其细胞生长和产物合成。2.产物易被固相吸附或被有机相溶解。3.两相易分离。4.如为固相，不可吸附培养基中的添加成分。第六章：酶工程：酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科，它是从应用的目的出发研究酶，应用酶的特异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。固定化酶：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。酶化学修饰：广义：凡涉及共价键的形成或破坏的转变都可看作是酶的化学修饰。狭义：在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。用微生物生产酶制剂的优点：1.微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都可以从微生物中得到2.微生物繁殖快、生产周期短、产量高。3.微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。4.培养方法简便，原料丰富，经济效益高，并可通过控制培养条件来提高酶的产量良好的酶菌株应具备的条件：a、繁殖快，产酶量高，产生胞外酶的菌；b、不是致病菌，不产生有毒物质；c、产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。固定化酶优点：1.可在较长时间内多次使用，稳定性好。2.反应后，酶与底物和产物易分离，易纯化。3.反应条件易于控制，可实现连续化与自动控制。4.效率高。5.比水溶性酶更适合于多酶反应。物理吸附法制定固定化酶的优缺点：优点：操作简便，可选用不同电荷和不同形状的载体，固定化过程可与纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，对不同载体不同酶的吸附条件不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，载体与酶结合力弱，酶易脱落，导致酶活力下降并污染产物。共价结合法： 酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。酶的固定化过程中，选择载体的依据以及载体符合条件：依据：酶促反应性质底物类型固定化方法条件：1.固定化过程中不引起酶变性。2.对酸碱有一定的耐受性。3.有一定的机械强度。4.有一定的亲水性及良好的稳定性。5.有一定的疏松网状结构，颗粒均匀。6.共价结合时具有可活化基团。7.有耐受酶和微生物细胞的能力。8.廉价易得。固定化细胞的优缺点：优点：1.无需进行酶的分离纯化；2.细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；3.细胞内酶比固定化酶的稳定性高；4.细胞内酶的辅因子可以自动再生；5.细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；6.抗污染能力强。缺点：1.利用的仅是胞内酶，胞内其他酶形成副产物。2.细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。3.载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。固定化酶和细胞的反应器类型：间歇式搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器填充床反应器流化床反应器循环反应器连续流动搅拌罐-超滤膜反应器其他反应器有机相中酶催化反应的优点：1.可增加疏水性底物和产物的溶解度2.可抑制有水参与的副反应3.酶不溶于有机介质，易于回收再利用4.容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物5.无微生物污染6.热力学平衡向合成方向移动7.能测定某些在水介质中不能测定的常数8热稳定性好9.方法简单