分生物学试验-农杆菌

新疆农业大学研究生课程论文题目：关于农杆菌介导法的植物遗传转化姓名：学院：专业：班级：学号：2013年12月21日新疆农业大学教务处制 目录目录I摘要1关键词11农杆菌遗传转化机制11．1农杆菌遗传转化的原理11．2与农杆菌转化相关的基因21．3 Vir基因的诱导表达21．4 T-DNA复合物的形成21．5 T-DNA复合物的跨膜转运32农杆菌操作步骤33农杆菌介导基因转化效率因素33．1农杆菌菌株类型33．2植物基因型及外植体类型43．3培养方法43．4再生植株的细胞起源44农杆菌转化的特点44．1农杆菌转化优点：44．2农杆菌转化局限性5展望5参考文献6I 关于农杆菌介导法的植物遗传转化摘要：农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一本文从农杆菌介导的基因转化机制，农杆菌操作步，骤影响农杆菌转化率的因素，农杆菌转化的优点与局限性做论述。关键词：农杆菌遗传转化植物遗传转化技术也称植物转基因技术是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术本世纪70年代初分子生物学研究领域取得的一系列重大进展为植物基因转化奠定了基础。1974年，人们发现根癌农杆菌在感染植物时，可将其中环状的Ti质粒上的一段DNA插入植物基因组中，引起植物遗传特性的变化。以下对农杆菌介导遗传转化的机理、方法、应用范围及其影响因素等方面做一简要评述。1　农杆菌遗传转化机制1．1　农杆菌遗传转化的原理农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，1907年人们发现它是植物致瘤的起因，它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位。植物细胞被侵染后，形成肿瘤，能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌，诱导毛发状根的称为发根农杆菌。用于植物遗传转化的农杆菌主要是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。在农杆菌中存在一种与肿瘤诱导有关的质粒，称为Ti质粒(Tumorinducingplasmid)。农杆菌能够把Ti质粒上的一段DNA转移至植物细胞，并整合进植物基因组得以表达，其中可转移的DNA片段称为T-DNA。T-DNA的转移与边界序列有关，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关，因此可以将T-DNA区段上的致瘤基因和其他无关序列去掉，插入外源目的基因，从而实现利用Ti质粒作为外源基因载体的目的。这使人们受到启发，利用根癌农杆菌Ti质粒这一天然的载体来构建植物基因工程载体，将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，7 并利用植物细胞的全能性，经过细胞或组织培养，由一个转化细胞再生成完整的转基因植株。整合进植物基因组的T-DNA片段能够通过减数分裂传递给后代从而得到稳定遗传的具有某种功能的转基因株系[1]。1．2　与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti质粒上T-DNA以外Vir区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD蛋白可能在低pH和磷酸饥饿情况下提高VirG蛋白的合成水平。ChvE与VirA蛋白共同对virG起激活作用。Ti质粒的vir区大小为30 kb分virA、virB、virC、virD、virE、virG、virH等7个操纵子有24个基因共同控制着T-DNA的加工和转移总称为调控子[2]。1．3 　Vir基因的诱导表达 在植物受到创伤后创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物如乙酰丁香酮（acetosyringoneAs）。当农杆菌接受到此类信号时其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA基因开始的。VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白可直接对植物产生的酚类化合物感应其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能自身被磷酸化激活后使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结合活化蛋白可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域从而成为其它vir基因转录的激活因子打开VirB、virC、virD、virE、virH等几个基因。ChvE可大大增强vir基因被As诱导的效果ChvE可结合一些单糖也可直接与VirA周质区相互作用以加强As对Vir基因的诱导[2，3]。1．4　 T-DNA复合物的形成T-DNA的加工与转移是由Vir基因被诱导后产生的蛋白完成。VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程。VirD1蛋白是一种拓扑异构酶可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA。VirD2具有特异剪切单链DNA的内切酶活性它可以识别T-DNA底链边界重序列上的特定位点并在底链24 bp重复序列和第四个碱基之间切割将T-DNA从Ti质粒上剪切下来称为T-strand或链。切开7 -DNA后VirD2蛋白与链的5端共价结合避免核酸外切酶降解链。新的T-DNA底链以此链为模板从右端产生的DNA缺口处5’-3’方向进行合成。被取的旧链游离出来与许多VirE2蛋白分子结合组成T-DNA复合体。此外VirD2作为一个导向蛋白可以指导整个T-DNA复合体（或叫复合体）从农杆菌进入到植物细胞核[2，3]。1．5　 T-DNA复合物的跨膜转运 农杆菌的T-DNA转移通道由多达12种蛋白组成包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合体。该通道也可为T-复合体运输器由virB编码的11种蛋白和VirD4蛋白组成。VirB1可在细菌膜上为复合体运输器的装备提供位点；VirB2和VirB5可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的VirB、VirD4为复合体的运输提供能量。合成的复合体经过复合体运输器以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内并在VirD2和VirE2的核定位信号（NLS）序列引导下以VirD2为先导向植物细胞核运动。在人工构建的质粒中vir基因和T-DNA可以放在同一个质粒上也可以放在不同的质粒上[2，3]。2　农杆菌操作步骤转化过程主要包括10个步骤：①农杆菌识别并吸附受体细胞；②农杆菌Vir和VirG蛋白组成信号转导系统诱导植物产生明确的应答信号；③vir基因区的活化；④VirD1/D2蛋白复合体复制T-DNA产生T-链；⑤几种Vir蛋白共同作用使VirD2-DNA复合体(未成熟的T-DNA复合体)进入受体细胞细胞质；⑥VirE2与T-链结合形成成熟的T-DNA复合体并且穿过受体细胞质到达细胞核；⑦T-DNA复合体通过主动运输由核孔进入受体细胞核[4]。⑧T-DNA进入细胞核后达到可以整合的程度；⑨T-复合体除去护卫蛋白；⑩T-DNA整合进入受体基因组。T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似因而可以在植物细胞中表达[5]。3　农杆菌介导基因转化效率因素3．1　农杆菌菌株类型不同菌株对同一种目的材料的感染能力不同。其主要原因是农杆菌吸附数目与菌株类型有关，而吸附是农杆菌感染植物细胞的最初步骤。7 3．2　植物基因型及外植体类型一般认为，基因型的特异性与细胞的生理状态有关，具体来说与细胞受伤后的生理反应(分泌酚类化合物，增强T-DNA的转移)，细胞内源激素水平(影响细胞的生长，分化)，细胞壁的结构(影响细菌的吸附)等有关。来源于植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农杆菌的侵染具有不同的敏感性。同一物种中，不同的外植体会有不同的转化效果。Schlappi和Hohn[6]用农杆菌感染3个玉米品系不同发育时期的幼胚时发现，幼胚中分生组织尚未分化时，农杆菌不能侵染；当幼胚开始分化第1～2小叶时，侵染率为7%～32%；授粉后14～16D的幼胚，侵染率为32%～73%。总的来说，分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最为敏感。从组织培养的角度讲，所选的外植体必须具有较高的再生能力。3．3　培养方法农杆菌介导的转化要经过3个主要步骤：外植体接种农杆菌、与农杆菌共培养、外植体在含有抑菌抗生素和选择抗生素的培养基上培养。因此、菌液的浓度、侵染的时间和共培养的条件(温度、时间、光照、培养基的pH值等)、以及共培养之后的筛选方式等都会影响转化效率。3．4　再生植株的细胞起源农杆菌介导的转化方法主要作用于外植体表层细胞，所以只有再生植株的细胞起源于表层才能顺利获得转化植株，否则转化效率较低，转化株表现为嵌合体。只有处于转化感受态和再生感受态的细胞才有可能被转化并形成转基因植株，高效的微繁殖组织培养体系不一定适用于植物转化[7]。因此，在进行转化前，对再生植株的细胞起源需有明确的了解，以免出现“再生”和“转化”的矛盾。4　农杆菌转化的特点4．1　农杆菌转化优点：农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于一种纯生物学的方法，与其它转化方法相比具有明显的优点：转化频率高。①可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切②导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，稳定遗传，多数符合孟德尔遗传规律，③7 农杆菌转化方法使用的技术、仪器简单。由于上述优点，也使它成为目前应用最广泛的转化方法[8]。4．2　农杆菌转化局限性4．2．1　基因型的依赖性，转化频率与植物的基因型具有很大的关系，即使在转化频率比较高的植物中(如马铃薯、烟草、拟南芥等)也有很大的基因型依赖性。4．2．2　宿主范围的限制对单子叶植物尤其是禾谷类作物的转化仍受到限制。4．2．3　农杆菌与受感染植物之间的相互作用农杆菌与受感染植物之间相互作用产生的过敏反应导致感染部位褐化或坏死，从而影响转化效率，如芸苔属作物。4．2．4　可再生细胞部位与转化感受态细胞部位不一致，导致假转化体的出现和转化效率降低。4．2．5　农杆菌转化过程中会对植物材料造成一些拐伤T-DNA转化有时引起左边界的丢失可能会以串联的方式整合在染色体上转化宿主存在局限性等[9,10,11]]。展望农杆菌介导的植物遗传转化系统作为一种天然的植物基因转化系统已经成为当今植物遗传转化的主流方法对它的广泛应用也推动了植物分子生物学及转基因生物技术的发展，目前许多转基因植物都已经或者正在进入田间试验阶段转基因抗虫棉、抗虫玉、抗病小麦等已经在商业化生产由于农杆菌转化系统有着诸多不可替代的优点近年来在直接转化系统研究快速发展的同时农杆菌转化系统研究又重新受到重视目前对于农杆菌介导的遗传转化体系究的重点和难点集中在提高转化效率为得到更优化的转基因植物株系。科学家们在对转化过程中的宿主识别和细胞通路等过程的研究表明农杆菌转化在转基因领域还有着广阔的发展空间。7 参考文献[1]张佳星，何聪芬．农杆菌介导的单子叶植物转基因研究进展生物技术通报2007：2[2]王关林、方宏筠．植物基因工程原理与技术[M]．北京：科学出版社1998．[2]王关林、方宏筠．植物基因工程原理与技术[M]．北京：科学出版社1998． [3]王景雪、孙毅．农杆菌介导的植物基因转化研究进展[J]．生物技术通报1999（15）：7-14．[4]郭敏亮高佃坤金英善D农杆菌L：复合物的形成与转运研究进展［b］D生物化学与生物物理进展200936(11)：1408-1414[5]GelvinSB．Agrobacterium-mediatedplanttransformation：thebiologybehindthe“gene-jockeying”tool[J]．Microbiol．Mivrobiol．Mol．Biol．Rev．，2003，67(1)：16-37．[6]SchlappiM，HohnB．CompetenceofImmatureMaizeEmbr-yosforAgrobacterium-mediatedGeneTransfer[J]．ThePlantCell，1992，4：7-16．陈丽梅农杆菌介导的基因转化研究进展甘肃科学学报2005年6月第17卷　第2期[7]赵恢武，胡鸢雷，林忠平．植物遗传转化技术的研究进展[M]．走向21世纪的植物分子生物学，446-453．[8]陈丽梅农杆菌介导的基因转化研究进展甘肃科学学报2005年6月第17卷　第2期[9]王从丽、陆柏方、张学成等．农杆菌－植物间基因转移的分子基础[J]．生命科学2002（14）1-5． [10]Byebier BF， Deboeck F， Greve HD et al． T-DNA organization in tumor cultres and transgenic plants of the monocotyledon Asparagus officinaolis[J]． Proc Natl Acad Sci USA， 1987（84）：5349． [11]Chan MT， Chang HH，7 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