稀有放线菌质粒生物学研究进展论文

　　稀有放线菌质粒生物学研究进展论文田永强赵国屏覃重军【摘要】非链霉菌属的稀有放线菌类群广泛分布在自然环境中，具有重要的基础研究与应用价值。在许多稀有放线菌发现了环型与线型质粒，由质粒发展起来的遗传操作系统可以为研究稀有放线菌的生理及代谢提供强有力的工具。本文综述目前稀有放线菌中的质粒生物学的研究进展。【关键词】稀有放线菌质粒ProgressesonplasmidbiologyoftherareactinomycetesABSTRACTThenonStreptomycesactinomycetes,livingportantforthebasicandappliedresearchespurposes.Theyharborindigenouslycircularasids,ausefulsourcefordevelopinggeictoolforstudyingoftheiruniquephysiologyandmetabolism.Inthisreviemarizethecurrentprogressesonplasmidbiologyintherareactinomycetes.KEY.avium、M.intracellulare和M.scrofulaceum及快速生长菌M.fortuitum、M.peregrinum、M.abscessus和M.chelonae中报道了许多从13kb到150kb大小不等的质粒［6，7］，如从M.avium中分离得到15.3kb的质粒pRL7［8］，从M.fortuitum中分离到pAL5000［9］和单拷贝的pMF1［10］，从M.scrofulaceum中得到了pMSC262［11］。M.scrofulaceum和M.avium对水银及铜的耐受性，以及质粒介导的限制性修饰均与质粒的存在有关［12，13］。Beggs等发现pRL7的序列与pMSC262具有高度同源，它们可能属于同一不相容群［8］，而pMSC262与pAL5000具有相容性［11］。几个分枝杆菌的环型质粒的复制起始区被确定，并用来构建能在大肠埃希菌和分枝杆菌中穿梭的载体［8，9，11］。然而这些载体的功能仍然有其局限性，比如它不能在快速生长的常用宿主菌M.smegmatismc#155中复制［14］。只有pAL5000衍生的质粒在快速生长与慢速生长的分枝杆菌菌株中都具有复制活性。除环型质粒外，Picardeau等报道了在M.xenopi、M.branderi、M.celatumtype2和M.celatumtype3等菌株中发现14个线型质粒，大小从20kb到320kb，通过Southern blotting分析可以将它们分为不同的类群，同类群的质粒是不相容的［15］。Picardeau等对M.celatum来源的25kb线型质粒pCLP进行了分析，发现它具有与其它放线菌线型质粒相同的端粒结构［16］。同时它们对质粒pCLP的复制区功能进行了测定，复制区有两个ORF，分别编码复制和分配蛋白，其间有一小段与分枝杆菌环型质粒复制起始区相似的序列，推测其为线型质粒的复制起始区。用该复制区构建的载体pCL4D与M.fortuitum来源的环型质粒pAL5000和pJAZ38具有相容性。1.2棒状杆菌质粒棒状杆菌由非致病的土壤类群(Corynebacteriumglutamicum，C.callunae，Brevibacteriumlactofermentum)、动物致病类群(C.diphtheriae，C.xerosis)和植物致病类群(C.nebraskense，C.michiganense)组成。非致病的土壤棒状杆菌在工业上主要用于生产氨基酸，另外的用途包括降解石腊(paraffin)生产去污剂及固醇转化等。从20世纪70年代末期开始，许多实验室进行了大量的筛选工作找到了许多大小分布在1.4kb到69kb之间的质粒［17～20］。通常这些菌株的大质粒上携带有抗生素耐受性基因(表1)。Tauch等从氨基酸产生菌C.glutamicum中分离到24个2.4～95kb大小不等的质粒，根据质粒的复制起始方式与复制起始蛋白的序列同源性可以将这些质粒划分为4个类群［21］。最近几年来，对质粒的研究工表1棒状杆菌中携有耐受的质粒作主要集中在对pBL1、pSR1、pGA1和pCG100等质粒的最小复制子及复制机制的研究［22］。通过对这些质粒的复制区结构的解析，了解它们不同的复制方式，如pBL1和pSR1采用滚环复制方式，而pRBL1则采用theta方式复制(表2)。Katsumata［23］和Martin［24］分别用不同的质粒发展了棒状杆菌的克隆载体及转化系统。主要的克隆载体是由pBL1和pSR1复制子构建而来［24，25］。大肠埃希菌中的启动子序列与棒状杆菌的具有同源性，因此，大肠埃希菌中的lac，trp、PL操纵子和PR阻遏子可以在棒状杆菌中表达，这就为构建棒状杆菌的表达载体提供了便利［26，27］。1.3诺卡菌质粒诺卡菌作为好气的放线菌是引起人体感染的病原菌。但是对它的质粒生物学性质研究并不多。Kirby等［28］于1985年第一次从诺卡菌Nocardiacorallina中分离到2.7kb的环型质粒pKU100。之后，诺卡菌质粒的工作停滞不前，许多诺卡菌的基因都可在链霉菌中进行表达［29］。Madon等利用地中海拟无枝菌酸菌(Amcolatopsismediterranei)质粒pMAE100发展出能在诺卡菌中复制的载体pMAE123［30］。最近Liu等［31］在N.italica中发现环型质粒pNI100，并克隆了该质粒的复制起始区，该区域包含一个编码396个氨基酸表2棒状杆菌环型质粒复制模式类群质粒复制方式与Rep蛋白同源的质粒ⅠpBL1滚环复制pIJ101(Streptomyceslividans)pSB24(S.cyanogenus)pJV1(S.phaerochromogenes)ⅡpSR1,pNG2滚环复制pGA1Ⅲ pRBL1Theta复制pAL5000(Mycobacteriumfortuitum)pCo1E5099(Shigellason)pJD1(Neisseriagonorrhoene)的蛋白，与链霉菌质粒pSG5的Rep蛋白有3段同源区域，推测它可能具有与pSG5相似的滚环复制机制。该质粒可以通过转化变铅青链霉菌(S.lividans)ZX7而产生麻点(pock)现象。根据pNI100复制子发展了能在大肠埃希菌与诺卡菌穿梭的质粒pNI105，这为诺卡菌的遗传操作提供了便利。Kalkus等［32］在氢自养型N.opaca中发现了多个线型和环型质粒，如菌株MR11含有环型质粒pHG31a和pHG31b及线型质粒pHG201(270kb)、pHG202(400kb)、pHG203(420kb)，菌株MR22中环型质粒pHG33和pHG204(180kb)、pHG205(280kb)和pHG206(510kb)。用氢化酶与二磷酸核酮糖羧化酶基因作为探针进行交分析，在接合转移质粒pHG201与pHG205中均发现阳性信号，证实它们与氢的代谢有关。1.4红球菌质粒在过去20年里，红球菌作为与环境相关的微生物受到越来越多的关注。它们可以降解许多环境污染物，如酚类物质、杀虫剂、除草剂、丙稀酰胺、苯胺、卤化烷烃等有害物质［33～37］。目前从红球菌中分离到许多环型质粒，这些质粒按复制子的类型可分为两种，其一，以theta方式复制的质粒，如pRE2895。该质粒编码RepA和RepB与ColE2型质粒的复制蛋白具有相同的特点，故推测其具有theta方式的复制机制。目前利用pRE2895的repAB构建了表达质粒pTip［38］。其二，以滚环方式复制的质粒，如R.erythropolisDSM8424的pRE8424。它有一个单链起始区和一个双链起始区，这是典型的滚环复制单元。对单链起始区的突变分析发现单链中间体在体内积累，这是因为单链不能及时转化成双链引起的。以pRE8424复制区构建的表达质粒能与以pRE2895为基础的质粒同时存在细菌体内，表明它们属于不同的不相容群［39］。对于R.aetherovoransI24(7Mb)和R.erythropolisPR4(7Mb)的基因组研究表明红球菌体内存在许多大的线型质粒，许多与环境污染物降解有关的基因就位于线型质粒上［40］。如多氯联苯(PCB)的降解菌R.erythropolisRHA1包含三个线型质粒：pRHL1(1100kb)、pRHL2(450kb)和pRHL3(330kb)，PCB的降解基因bph分散在染色体与质粒pRHL1和pRHL2上［41］。在R.erythropolis BD2线型质粒pBD2(210kb)上还发现异丙基苯的降解基因ipb和具有降解联苯降解功能的etbD1类似基因［42］。此外，催化有机硫化物脱硫的催化途径位于红球菌IGTS8的150kb的线型质粒上［43］，红球菌DK17具有两个线型质粒pDK1(380kb)和pDK2(330kb)，后者含有烷基苯代谢的单加氧酶与meta环裂解的双加氧酶基因［44］。1.5弗兰克菌质粒在弗兰克菌中已发现多个环型质粒，大小从7kb到190kb［45～47］。目前已完成了来自菌株ArI3的质粒pFQ31［48］和菌株CpI1的pFQ11［49］以及pFQ12［50］的测序工作。22.4kb的pFQ12有超过50个开放阅读框(ORF)，9个有转录活性［50］。pFQ31有17个ORF［48］，pFQ11有4个［49］，pFQ11与pFQ31有大约99.7%的同源性。在3个质粒上都发现了质粒分配蛋白基因，如pFQ31的parFA、pFQ11的ORF3编码类似假单胞菌PseudomonasalcaligenesParA的蛋白，pFQ12含有一个蛋白类似芽孢杆菌B.subtilis的SpoJ。这些基因的编码产物使质粒能在子细胞中稳定存在。同时还发现与类似链霉菌(S.ambofaciens)中接合转移与整合性质粒pSAM2KorSA的蛋白。根据ptrFA和repFA之间的DNA结构域推测质粒pFQ31的复制起始区位于其间，该区域序列具有类似重复子(iteron)的序列，这些结构通常在以theta方式复制质粒的复制区中存在，repFA编码复制起始蛋白Rep。pFQ12有两个开放阅读框(ORF3与ORF6)可能与质粒的转移有关。1.6小单孢菌质粒小单孢菌(Micromonospora)是多种重要抗生素的产生菌［51］，其遗传操作主要依赖于噬菌体构建的载体［52］。Parag等［53］首先报道从西索米星(sisomicin)产生菌M.inyioensis分离到环型质粒。随后Oshida［54］报道从M.zionensisNRRL5466(西索米星产生菌)中找到高拷贝质粒pMZ1(9.9kb)，从M.rosariaNRRL3718(罗沙米星产生菌)发现53.5kb质粒pMR1和11.0kb小质粒pMR2。Hasegaycolatopsis)最早被划分为链霉菌属，之后归为诺卡菌属，到20世纪80年代中期，Lechecalier等［57］根据细胞壁组成缺乏以及对诺卡菌和红球菌的噬菌体不敏感等特征将其归为拟无枝菌酸菌属。拟无枝菌酸菌能产生利福霉素、万古霉素和balhimycin等在临床上重要的抗生素。拟无枝菌酸菌的遗传操作系统还不够成熟，造成对其遗传学的研究进展缓慢。许多来源于链霉菌的质粒，如pIJ702和来源于诺卡菌的质粒pCY104都不能在该菌中稳定的复制和表达。Moretti等从A.mediterranei中检测到23.7kb的质粒pMEA100，但由于容易整合到染色体上，不易分离，以及拷贝数太低，很难改造为合适的载体。Oh等［58］从糖肽类抗生素万古霉素的产生菌A.orientalis中分离到33.5kb的质粒，但是该质粒不能稳定地遗传。Lal等［59］从一株拟无枝菌酸菌中分离到一个约29.6kb的质粒pA387。其衍生载体pRL1转化到N.lactamdurans中后，自发地丢失一个片段得到质粒pULVK2。 1.8其它稀有放线菌的质粒马杜拉放线菌产生多种抗生素［60］，但是其遗传操作体系的发展却相对落后，原因在于从马杜拉菌中发现的质粒相对较少。只有Dairi等［61］分离得到4个质粒(pAE042、pTPA0016、pTPA0019和pTPA0123)，并利用pTPA0123的复制区构建了能在Actinomaduraverrucosospora中稳定复制的克隆载体。Fare等［62］从链孢囊菌Streptosporangiumbrasiliense中分离到环型质粒pSgB1，从S.viridognriseum中分离到质粒pSgV1。Polo等［63］从延伸因子Tu抑制剂的产生菌玫瑰游动双孢菌(Planobisporarosea)中分离得到两个线型质粒pPR1(27.5kb)和pPR1(16kb)。两个质粒具有相似的序列，但它们的端粒结构有一定的差异，pPR2端粒区域的650个碱基具有类似于链霉菌端粒的倒转重复序列。2前景展望稀有放线菌产生的抗生素种类占所有放线菌产抗生素的三分之一［62］，随着对稀有放线菌环型与线型质粒被发现，越来越多的克隆或表达载体被构建，可以为深入研究稀有放线菌的遗传特征提供更多的帮助，也为有效利用微生物资源提供了有力的工具。【