微生物菌(毒)种保藏及管理

微生物菌(毒)种保藏及管理文章编号：1004-9231(2007)02-0087-02在微生物检验及研究工作中经常使用菌（毒）种。菌（毒）种是一种重要的生物资源。菌（毒）种保藏不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌（毒）种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础。保藏的菌（毒）种有的是开发利用的对象，有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经生物技术修饰改造获得的，都是有着极大的研究价值和开发利用的潜力［1］。因此，菌（毒）种的保藏工作至关重要。菌（毒）种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌（毒）种在保藏和管理过程中不死亡，不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期使用。1菌（毒）种保藏［2］8 菌（毒）种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏。保藏方法有20多种，从总体上可分为4大类：传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法［1］。无论哪种方法，其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境，如低温，干燥，缺氧，营养缺乏等。简易的方法有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。不同类型或不同种属的菌（毒）种可根据生理特性选用不同的保藏方法。如产芽孢或孢子的菌种适用于干燥法，无抗逆性结构的细胞如酵母菌或某些种属的细菌可用定期移植法和液体保藏等方法。目前公认的长期保存微生物菌（毒）种的较安全、可靠的方法是冷冻法和冷冻干燥法，而其中制备和保存生物材料的最佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌（毒）种的保藏，因为它适用于大多数细胞结构的特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。其基本原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低细菌（或病毒）新陈代谢的速度，使细菌（或病毒）的生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的［3］。另外，保藏效果良好的还有液氮保藏法等。2保藏方法菌（毒）种的保藏是微生物检验、教学科研和有关生产单位的一项重要工作［4］。在实际工作中应根据菌（毒）种的种类和需要选用不同的保藏方法［5］。通常通冻干燥真空法最佳，但在一般条件下，限于设备等诸多情况，常采用其它保藏方法。如定期移植法，此法简单易行，不需要特殊设备，能随时观察所保藏的菌株是否死亡、变异或污染杂菌，缺点是经常移植易发生变异或污染空气中的杂菌。用此法保藏菌（毒）种常用的有：琼脂斜面、半固体穿刺、鸡蛋斜面、血斜面或血高层保存、沙土保存等［6］。8 2.1传代法分传代培养保藏法和液体石蜡覆盖保藏法，前者有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养（培养厌氧细菌用）等，培养后于4―6℃冰箱内保存。2.2干燥法也称载体保藏法（滤纸、沙土），是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏方法，沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。2.3冷冻法分低温冰箱保存（-20―-30℃，-50―-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮冻结（-196℃）等保藏法。2.4冷冻干燥法先使微生物在极低温度（约-70℃）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护剂溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、糖类、甘油、二甲亚砜等。3常用标准菌种保藏法8 在微生物实验室中，常需保藏一些实验中常用的标准菌种及菌株，如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、几种常见的沙门菌、志贺菌等。因此对这些菌种的妥善保藏是良好的实验室管理和实验质量的重要保证［7］。标准菌种保藏的核心是必须确保标准菌种与检测有关的关键的形态学、生物化学或遗传学特性。菌种的保藏方法必须根据各类微生物的特点采用合适的方法保藏。长期、稳定保藏的菌种采用冷冻干燥法保藏保留菌种；日常检测工作需要经常移种或传代用工作菌种。工作菌种一般保存于半固体琼脂，上层加封液体石蜡或其他方式，并根据标准菌种种类情况而存放于4℃―8℃、室温或其他合适的温度及其他相应的环境条件［8］。微生物实验室标准菌种的一般保藏方法有以下几种：3.1斜面保藏法3.1.1普通肉汤琼脂斜面肠道杆菌、葡萄球菌等营养要求不高的细菌接种于普通琼脂斜面上，置37℃培养18―24h后，放于4℃冰箱中，可保藏1个月，每经1个月需接种传代1次。3.1.2血琼脂斜面链球菌及肺炎球菌的营养要求较高，在普通培养基上生长不良或不生长，应接种于血琼脂斜面上，37℃培养生长后，放4℃冰箱保存，链球菌需0.5―1个月接种1次，肺炎球菌需4d移种1次。3.1.3鸡蛋斜面含有Vi抗原的沙门菌等，接种于鸡蛋斜面上，37℃培养18―248 h，加无菌液体石蜡至斜面浸没，再超出约1cm，置4℃冰箱，可保存3―6个月。3.2普通半固体穿刺法大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌等可穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18―24h后，加无菌液体石蜡，厚度约1cm，置4℃冰箱，可保存3―6个月。3.3罗氏培养基结核杆菌的营养要求较高，在培养基中需加入复杂的有机物以及无机盐类才能生长。结核杆菌的培养基种类很多，实验室最常用的是罗氏培养基。该菌生长速度很慢，一般分裂1代为18h，37℃培养2―3周，置4℃冰箱，可保存2―3个月。4保藏方法展望目前菌（毒）种的保藏研究分两个方向：一是科研机构寻找保藏期长且稳定的方法，如冷冻干燥法，液氮低温法等及其保藏基础理论的研究；二是基层单位寻找简便实用、经济的方法，如熔封法、胶塞法等，研究应用较多的为食用菌的保藏方面［9］。8 冷冻干燥法是目前保藏技术领域研究最多、应用最为广泛的一种方法，它集冷冻和干燥技术特点为一体，应用于微生物菌（毒）种、菌苗、疫苗、生化产品的长期保存。由于影响其效果的因素有很多，如微生物的生理状态、细胞浓度、pH环境、保护剂类型、保护剂浓度、预冻温度及时间、降温速率、冷冻干燥条件、细胞含水量等［10］。这些因素成为保藏研究者们的研究对象和热点，其目的是力求提高微生物菌（毒）种保存的质量和延长其保存期限，并进而对其质量能加以控制。关于冷冻干燥法研究的问题集中在保护剂的选择和解冻后菌（毒）种生理特性变化这两方面。中国科学院微生物研究所曾对解冻的菌种进行了一些生理特性的检查，胡润茂采用脱脂牛奶组与土壤组为保护介质比较，冷冻保存放线菌270株12年，结果表明土壤介质优于牛奶组，存活率为88.5%，其中对双孢菌属影响最大［12］。冷冻干燥法、液氮冻结法效果虽好，但条件和设备要求高，一般基层单位难以达到，故影响了在基层单位的实际应用。由于菌（毒）种保藏方法多种，又是一项比较烦杂的科研工作，必须从多方面开展研究。日常工作中结合各单位的实际情况，选择和研究一些适宜的简便实用方法进行保藏是今后菌（毒）种保藏研究的目标之一；而研究机构及大专院校则可多做一些保藏基础理论的研究探讨，开展各种保藏条件、介质、方法对菌（毒）种生理生化特性，形态结构等的影响的保藏研究，如苏风岩等［12］对Frankia菌的研究，将是菌（毒）种保藏工作者的努力方向。5菌（毒）种管理8 菌（毒）种的管理包括菌（毒）种的收集、整理、核对、编号、保存、供应以及菌（毒）种资料保存等。要经常收集典型菌（毒）株和对临床诊断有参考价值的菌（毒）株，扩大菌（毒）种数量和种类，凡需要保藏的菌（毒）种应登记造册。菌（毒）种经鉴定、核实后将有价值的菌（毒）株进行编号，由专业管理人员进行移植、活化，并做成冻干菌（毒）种或按其他方法保藏。采用冻干法时，每一批菌（毒）种冻干后要检查外观、真空度，同时要启开一支进行形态生化、血清学等方法核查，符合原种后放4℃―6℃冰箱内保存。置半固体培养基管穿刺或斜面培养的菌种，大多可于室温中保存，在保种过程中，要经常观察它的形态颜色方面的变化，并定期移植。菌（毒）种的交流和供应等管理要严格按照菌（毒）种管理制度规定执行，实验室的安全防护及菌（毒）种的使用销毁处理等方面也是和菌（毒）种管理紧密相关的。菌（毒）种实验室的防火、水电管理、有毒易燃药品的管理措施与一般实验室的要求相同。只有严格按操作规程来办，才能把好菌（毒）种保藏和管理的质量关，更好地为微生物检验和科研工作服务。8 随着菌（毒）种研究开发工作的进展，需要及时准确方便的获得菌（毒）种的资料。实验室质量管理体系的建立完善，使得原来基于文字记录的菌（毒）种管理方式越来越不能适应菌（毒）种的收集、保藏、研究、开发应用的需要。这就要求在菌（毒）种保藏和管理工作中能开发出既能高效的管理保藏菌（毒）种信息，又能方便准确得到所需资料的信息系统，这方面工作国内有的单位已做初步尝试［13］，其方法和经验可为其他菌（毒）种保藏机构借鉴，相信菌（毒）种库信息系统的应用会使菌（毒）种管理工作的效率大大提高。本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。8