生命科学生物技术大实验指导

实验一应用TRIzol提取病毒RNA一、实验目的1.了解Trizol法分离总RNA的原理和方法。2.掌握提取、分离总RNA的方法。二、实验原理TRIzol（Guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction）是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂。异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物。在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。     TRIzol试剂可用于小量样品（50－100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northernblot、RT-PCR、Dotblot、RNase保护分析等。本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的稳定性。三、实验仪器和试剂1.仪器高速低温高心机，Eppendorf离心管。2.试剂TRIzol试剂、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC配制）、1% DEPC、异丙醇四、操作步骤所提取物为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞中的病毒。所用一切物品无RNA酶。1.在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ml，再加入TRIzol溶液500ml，充分混匀，室温放置10min。2.加入200ml的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。3.离心4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。4.加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。5.离心4℃、13000r/min、15min，小心吸去所有上清。底部有RNA，操作需小心。1ml75%乙醇洗一遍，离心4℃、8000r/min、10min。小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。6.加入适量DEPC处理水(建议立即做RT-PCR。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。)。五、注意事项1.操作时必须戴手套。2.所用的器皿和试剂均须经DEPC水处理或250－300℃干烤4h。3.Trizolreagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。实验二逆转录反应一、实验目的掌握RNA逆转录扩增cDNA的方法和原理二、实验原理RT-PCR是指将逆转录(ReverseTranscription；RT)反应和PCR(PolymeraseChainReaction)反应组合在一起的方法。 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，它是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他RNA分析技术更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。三、实验仪器和试剂1.仪器PCR仪、离心机、灭菌的PCR管、移液器等2.试剂实验一中提取的总RNA；随机引物及Oligo（dT）；逆转录酶；dNTP；RNA酶抑制剂四、实验步骤1.在冰浴离心管里面加入模板RNA4mL，引物2mL，去离子水5mL，混匀，离心3-5秒；2.70℃水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；3.加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1mL，dNTP2mL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；4.37℃水浴5分钟，加入1mLAMV-RT反转录酶，混匀；5.37℃水浴1小时（此步是反转录过程）；6.70℃10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70℃保存。五、注意事项1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2.操作人员在实验过程中手套要勤换。3.加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。实验三聚合酶链式反应一、实验目的1.了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素，2.掌握PCR的基本操作过程。二、实验原理聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）即PCR技术，是一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。双链DNA分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链DNA分子（变性），与待扩增片段两端互补的寡核苷酸（引物）分别与两条单链DNA分子两侧的序列特异性结合（退火、复性），在适宜的条件下，DNA聚合酶利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按5’至3’的方向合成互补链，即引物的延伸。这种热变性、复性、延伸的过程就是一个PCR循环。随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量按2n方式增长。从理论上讲，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。影响PCR反应结果的因素较多，主要包括：（1）模板的质量：在制备模板DNA时通常需要使用蛋白变性剂及乙醇等有机溶剂，这些物质可直接影响PCR反应；另外当模板DNA分子量很高时，解 链不易，可用限制酶消化以改善扩增效果；从理论上说，一个模板DNA分子即可获得扩增产物，模板浓度过高，PCR反应的特异性下降，实际操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng递减的方式设置模板浓度对照。（2）引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：①引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。②引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。③人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。④引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pmoL/μL较好。（3）Mg2+浓度：PCR反应体系中Mg2+浓度对扩增结果影响较大，通常是1.5-4mmoL/L，必要时可调整Mg2+浓度。（4）dNTP浓度：1.25mmol/L，dNTP浓度过高，反应的特异性下降。（5）反应条件：PCR反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶DNA序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但扩增效果不佳。一些生物技术公司在合成引物时注明了Tm值，以此为依据，退火温度比Tm值低3-5℃比较适宜。当然，在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。三、实验仪器和试剂1.仪器PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪2.试剂引物：用去离子水配成10μmol/μl；Taq聚合酶；10×PCR反应缓冲液（加镁离子）；dNTPs：四种核苷酸混合物（浓度为10mM）；模板：反转的病毒cDNA；1%琼脂糖凝胶；50×TAE电泳缓冲液(1000mL)：Tris242g、Na2EDTA·2H2O37.2g，溶于600ml去离子水中，加冰乙酸57.1ml，最后用去离子水定容至1000mL；6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4℃保存。四、实验步骤1.反应混合液的配制：在一个0.5mlPCR管中加入下列成分。充分混匀，离心片刻，确保管壁上液体沉入底部。两种引物（各）1μl10×PCR缓冲液5μldNTPs（10mMeach）1μl模板1μlTaq酶1μl去离子水补至50μl2.PCR反应条件循环1：94℃，3分钟；循环2-31：94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min；共30个循环；最后72℃延伸10分钟。3.反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。 1）用1´TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶：在电子天平上准确称取琼脂糖0.2g，倒入100ml三角瓶，加入20mL缓冲液。2）微波炉上加热40s。3）待冷却至60℃左右时，加入1μLgoldenview，摇匀。4）将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，插入梳子，待冷却。5）将PCR产物在１％琼脂糖胶上电泳：80V，20min。6）取出凝胶，在紫外灯下观察，记录观察结果。7）用手术刀切取大小正确的PCR产物，放入1.5mL的EP管中。4.PCR产物的纯化1）加入胶重量3倍体积的溶液A，42℃下溶解胶，期间颠倒几次促进其溶解。2）加入1倍溶液A体积的异丙醇，混匀后移入PCR产物回收柱，6000rpm离心30秒，将滤过液再次加入回收柱，6000rpm离心30秒。3）加入洗涤液500ml，12000rpm离心30秒，弃去洗涤液。4）重复步骤3一次。5）换1.5mlEP管，12000rpm下离心10min。6）换1.5mlEP管，在回收柱中膜的中央加入50ul去离子水，12000rpm下离心1min，获得纯化的PCR产物待用。五、注意事项由于PCR灵敏度非常高，所以特别需要防止反应混合物受到DNA的污染，因此在实验中应注意下列事项：1.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验专用，不得挪作它用。2.操作中使用的PCR管、离心管、吸头等，只能一次性使用。3.特别注意防止引物受到用同一引物扩增的DNA的污染。所有试剂，包括引物，应从母液中取一部分稀释成工作液以供平常使用，避免污染母液。实验四质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定一、实验目的1.学习和掌握限制性内切酶的特性2.掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3.掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4.学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5.学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法二、实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。限制性核酸内切酶酶切分离法适用于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。DNA连接酶催化双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最常用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的DNA片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：1.具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，会产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。2.平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/10~1/100。为了提高其反应活性，一般选择16℃较为合适。外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。所谓受体细胞（receptorcell）又称为宿主细胞或寄主细胞（hostcell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选择应符合以下基本原则：（1）便于重组DNA分子的导入；（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；（3）便于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。原核生物细胞:是较为理想的受体细胞类型，其原因是：①大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；③基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；④原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。体外连接的DNA重组 分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。转化方法：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：（1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单链DNA转化因子的整合；（5）转化子的形成。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是Ca2诱导的大肠杆菌转化法。Ca2+诱导的转化：细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。其原理是将处于对数生长期的细菌置于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNAase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105～106个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。转化子的筛选以及鉴定：在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此，如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来，然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等，相应的筛选（选择）方法包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选等。三、实验仪器和试剂1.仪器恒温振荡培养箱、高速离心机、旋涡振荡器、水浴锅、酒精灯、微波炉、天平、电泳仪、制胶槽、电泳槽、梳子、锥形瓶、量筒、移液枪、微量移液器 2．试剂pCold-I的质粒、质粒提取试剂盒、LB培养基、抗生素氨苄青霉素(50ug/L)、TAE电泳缓冲液(10×)、琼脂糖、50×TAE缓冲液、溴化乙锭(EB)、DNAmarker、冰盒、枪尖、Eppendorf管、塑料薄膜、手套、记号笔。四、实验步骤1.准备阶段1)LB培养基的制备配置1L液体LB培养基：称取10g蛋白胨，5g酵母浸膏及10gNaCl,加1L去离子水。高压灭菌。2)配置500ml固体LB培养基（氨苄抗性）：称取5g蛋白胨、2.5g酵母浸膏、5gNaCl及15g琼脂，加入500ml去离子水，高压灭菌。在大约培养基的温度与手背的温度差不多时，加入500ml的氨苄青霉素（先预热再将氨苄青霉素打入培养基中）；倒平板，大约每个平板20ml；3)枪尖及EP管的准备1000ml、200ml、20ml的枪尖在枪尖盒内装好，EP管放置饭盒内贴上标签，灭菌，备用。2.实验阶段2.1酶切1)pCold-I的质粒DNA酶切体系：22mlddH2O、20mlpCold-I质粒DNA、5ml10×Fastdigest缓冲液、NdeI和HindⅢ限制性内切酶各1.5ml。2)按上述的顺序将酶切体系加好，混匀，置于37℃的水浴锅内孵育2h。3)酶切反应混合物琼脂糖电泳，回收相应条带。4)取回收产物40ml，加入5ml10´碱性磷酸酶缓冲液，4ml去离子水，1ml碱性磷酸酶对载体进行去磷酸化处理1.5h，除去其5’末端的磷酸基，防止环化。连接反应后的缺口可在转化细胞后得以修复。5)用PCR产物纯化试剂盒回收上述反应体系中的载体。a.加入5倍体积结合液及1倍体积异丙醇混匀后加入离心柱。b.6000rpm离心1min，将滤过液重新倒入离心柱，6000rpm离心1min。弃去滤过液。c.加入500ml洗涤液，12000rpm离心30s，弃去滤过液。重复一次。d.将离心柱取出置于1.5ml的EP管中，12000rpm下离心10min；e.将离心柱取出置于1.5ml的EP管中，加入40ml洗脱液或去离子水，将液体加在离心柱的孔中，静置2min之后于12000rpm下离心1min;f.将离心柱取出，将EP管中的质粒DNA做好标记，备用。2.2连接1)连接体系：9ml的去离子水、3ml酶切的pCold-I载体、2ml的10×Buffer、1ml的T4连接酶。2)按照上述顺序依次加入，混匀，离心，4℃下连接过夜。2.3制备感受态细胞（无菌条件）1)将事先已经培养好的OD600值为0.5左右的大肠杆菌的菌悬液置于冰上，备用；2)取出三个EP管，在酒精灯上将菌悬液加到三个管中，每管1.5ml；3)之后在5000rpm下离心5min,离心之后将上清液倒掉（在酒精灯下）4)之后再在每管中加入1.5ml的菌悬液，离心，倒掉上清液；5)加入800ml的CaCl2混匀，之后冰浴5min；6)5000rpm离心5min，倒掉上清；7)加入100ml的CaCl2，混匀即可，之后放置在-4℃冰箱中备用，或者在冰盒中。 2.4转化1)在感受态细胞中分别加入连接产物，冰浴30min。2)混合均匀，42℃热击90s（时间要准确计时）；3)之后置于冰上，再在每管中加入200ml的新鲜的LB培养基；4)摇床振荡培养3-4h。2.5涂布及培养1)涂平板（无菌条件）2)在平板上做好标记，之后在37℃下培养12-16小时。3)涂布观察：在含有Amp的平板上涂有连接液的平板上可以看到白色的菌落，这就是我们所需要的连接上的重组子形成的菌落。2.6质粒的提取1)用接种环挑取平板上单独的大的白色菌落在液体培养基中；2)挑取两管菌液，做好标记，37℃振荡培养过夜；3)用试剂盒提取质粒：a.在两个EP管中各加1.5ml的菌液，10000rpm×1min，之后倒去上清，在各加1.5ml菌液离心（两管菌液不要混用，可以看做两种质粒）；b.吸取上清后，加入250ml溶液Ⅰ，充分振荡混匀，使细胞悬浮；c.加入250ml溶液Ⅱ，请求那个翻转倒置数次，直到获得透明的裂解液；d.加入350ml溶液Ⅲ，立即翻转倒置数次至有絮状沉生成；e.之后离心，10000rpm×10min，吸取上清于离心柱中，离心10000rpm×1min，弃收集管中的液体；f.在离心柱中加500mlBufferHB，离心10000rpm×1min，弃收集管中的收集液；g.在离心柱中加入700mlWashBuffer，离心10000rpm×1min，弃收集管中的收集液；h.空离心柱再离心13000rpm×2min；i.将离心柱取出置于1.5ml的EP管中，加入40ml洗脱液或水,将液体加在离心柱的孔中，静置2min,之后离心13000rpm×1min;j.将离心柱取出，将EP管中的质粒DNA放好，做好标记。2.7重组质粒DNA的酶切验证1)重组质粒DNA的酶切体系：14ml的ddH2O，10ml的重组质粒DNA，5ml的10´Buffer，0.5ml的NdeI和XbaI内切酶；2)按照上述的顺序，一次加入，混合均匀，置于37℃的水浴锅内孵育1h；2.8电泳1)在所得的酶切液中加入3微升的10´样品缓冲液,混合均匀点在胶孔中，点上相应的核酸marker。电泳完毕后在紫外灯下分析条带；2)实验结果分析：pCold-I载体为4.5kb，而PRRSV的nsp7A基因大小520bp。因此在重组质粒酶切的泳道上如果存在这两个大小的条带表明已经成功构建pCold-I-prrsv-nsp7A表达载体。五、注意事项1.限制性核酸内切酶的酶切反应属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都很少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系。2.注意酶切加样的次序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶。前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃ 冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下，并充分混匀。酶液使用完毕后立即放回冰箱，防止酶的失活。3.注意盖紧Eppendorf管的盖子，防止水浴加热的过程中水汽进入管内，并注意做好标标记以防样品混淆。4.为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题，5.勿将含有DNA的凝胶长时间暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。要回收DNA时，尽可能采用长波长的紫外灯(300～360rim)。切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。6.涂布时先将涂布棒蘸取酒精，再在酒精灯火焰上烧三遍，烧时酒精会引燃，注意安全。7.酶切、连接及转化等涉及微生物部分的实验要注意无菌操作，涉及分子实验的部分虽然不用无菌，但要注意不要污染杂质。六、实验小结质粒的酶切、连接、转化、重组子的筛选及质粒的提取等操作通过一系列实验有了进一步的了解。学会了分析琼脂糖凝胶电泳所反应出来的信息，如看片段大小、连接结果的分析等。通过这次一系列的实验，熟悉分子实验的基本操作技术，在平时的学习中学到的很多分子生物学和基因工程的知识都得到了应用，这些操作中的注意事项都有了了解。现在，经过学习，最有收获的就是相信等做完了后面的实验，自己就可以进行一系列简单的分子实验了。实验五目的蛋白原核表达与纯化一、实验目的1.掌握目的基因原核诱导表达的原理和方法2.了解目的蛋白“标签”纯化的基本原理和方法3.掌握PAGE变性凝胶电泳的原理和方法4.掌握考马斯亮蓝染色的方法二、基本原理1.目的蛋白的表达E.coli的乳糖操纵子编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P的上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点三者共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象发生变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢且十分稳定，因此被实验室广泛应用。带有T7lac启动子的载体—这些质粒在紧邻T7启动子的下游有一个lac操纵子序列。它们同样带有常规启动子以及编码lacI阻遏蛋白的序列，T7lac和lacI启动子位置交错。采用这种载体和DE3溶原菌，lac阻遏蛋白既可以作用于宿主染色体lacUV5启动子，抑制宿主聚合酶转录T7RNA聚合酶，也可以作用于载体T7lac启动子，从而阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。普通T7启动子和T7lac启动子的区别在于蛋白表达的严紧性不同。T7lac启动子在启动子区下游17bp处含有一个25bp的lac 操纵序列，属于高严紧性的启动子。该位点结合lac阻遏蛋白能够有效降低T7RNA聚合酶的转录。而普通的T7启动子表达量更高些。如果这还不够，更为严谨的调控手段还有在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7RNA聚合酶的基因—T7溶菌酶，降低本底表达。常用的带溶菌酶质粒的表达菌有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。蛋白表达系统有原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。原核细胞表达系统常用大肠杆菌表达系统，实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备但不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体；真核细胞表达系统分酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统，表达的蛋白具有正常的活性、构象技术难度较大、耗时、耗资。原核细胞表达系统菌株因菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。2.目的蛋白质的纯化用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag）。标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。目前常用的标签有组氨酸标签（His-Tag），谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase）标签（GST-Tag），硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）标签，麦芽糖结合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP），白质A（proteinA），纤维素结合位点（cellulosebindingdomain）标签等。一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的影响。GST可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST对谷胱甘肽的亲和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白进行纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液,洗脱结合的GST融合蛋白。PolyHis多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合，因此带HIS-6的蛋白能结合与固化的Ni2+树脂，用适当的缓冲液（PBS）洗冲洗去除其他杂蛋白后，再用可溶的竞争性鳌合剂（咪唑）洗脱可以回收靶蛋白。3.目的蛋白质的检测十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂例如β巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。三、实验仪器与试剂1.仪器低温摇床、电泳仪、染色盘、脱色盘2.试剂1)LB培养基（1L：5酵母膏，10g氯化钠，10g蛋白胨）；2)IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，－20℃保存。3）染色液：考马斯亮蓝R-2501g、甲醇500ml、蒸馏水450ml、冰醋酸50ml4）脱色液：甲醇500ml、蒸馏水450ml、冰醋酸50ml5）蛋白电泳相关溶液的配制 30%丙稀酰胺混合液:29g丙稀酰胺1gN,N’-亚甲基双丙稀酰胺加ddH2O100mL,加热助溶,4℃避光保存。10mL12%分离胶:3.3mLddH2O4.0mL30%丙稀酰胺混合液2.5mL1.5MTris-HCl(pH8.0)0.1mL10%SDS50μL10%过硫酸铵10μLTEMED4mL5%浓缩胶：2.46mLddH2O0.66mL30%丙稀酰胺混合液1.04mL1.0MTris-HCl(pH6.8)0.04mL10%SDS13.3μL10%过硫酸铵4μLTEMED5×Tris-GlycineBuffer：0.125MTris1.25MGlycine0.5%(W/V)SDS5×SDS-PAGELoadingBuffer：2.5MTris-HCl(pH6.8)10%(W/V)SDS0.5%(W/V)溴酚蓝50%(W/V)甘油5%(W/V)β-巯基乙醇6）蛋白纯化所用溶液：缓冲液A：20mMTris-HCL(pH8.0)、100mMNaCL、0.1mMPMSF缓冲液B：20mMTris-HCL(pH8.0)、100mMNaCl、250mM咪唑、0.1mMPMSF四、实验步骤1.外源基因的诱导表达与检测1）将鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta2感受态细胞中。2）挑取生长状态良好的菌落，接种于5mL含氨苄抗性的LB培养基中。37℃，200rpm下振荡培养到对数生长中期时（OD600＝0.6～1.0），取1mL菌液于无菌EP管中作为阴性对照，其余加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，21℃，200rpm振荡培养12-16h。3）收菌，将未诱导和诱导的菌体12,000rpm离心1min。用1mLBufferA重悬菌体，超声波5min；4）经破碎的菌体在12,000rpm离心1min后，分离沉淀和上清，沉淀用100μL缓冲液A重悬，分别取40μL对照、沉淀悬浮液和上清，各加入10μL5×凝胶上样缓冲液，煮沸5min。5）制备12%SDS-PAGE凝胶。①0.75mm的玻璃板用去离子水冲洗干净后固定在支架上；②配制15%的分离胶分离胶配好混合均匀后迅速倒入两玻璃板之间，液面上沿具玻璃板顶端约2cm，小心地在分离胶顶层覆盖一层双蒸水，放置于室温下待其自然凝固后，倒出覆盖层的水，然后用吸水纸吸尽残留的液体。 ③配制5％的浓缩胶将配好的浓缩胶溶液混合均匀后灌注于分离胶上，并立即在浓缩胶中插上梳子，用吸水纸拭净溢出的液体待其凝固。然后进行SDS-PAGE电泳：待浓缩胶凝固后，移去梳子，在电泳装置内、外槽倒入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，微量加样器每个孔上样10μL，先用80V电压待溴酚蓝刚刚进入分离胶后将电压调至120V继续电泳，直到溴酚蓝达到分离胶底部时，关闭电源将凝胶取出并缓慢剥离，浸泡在R-250考马斯亮蓝染色液中，放置于水平摇床上染色，待至第2天将凝胶浸泡在脱色液中，摇床上进行脱色至蓝色背景基本没有为止，用凝胶成像系统拍照。PRRSV的nsp7A的蛋白分子量约17kD，因此在SDS-PAGE胶上，未加入IPTG的对照泳道上17kD附近无明显蛋白条带，而加了IPTG的样品的沉淀和上清中应有明显的蛋白条带。证明nsp7A能够诱导可溶表达。2.pColdI-prrsv-nsp7A蛋白大量表达1）取2L锥形瓶2个，各加入1LLB，1mLAmp(100mg/ml,终浓度0.1mg/mL)。1:100加入含pColdI-prrsv-nsp7A的Rosetta2过夜培养菌。2）37℃，200rpm振荡培养到对数生长中期时（OD600＝0.6～1.0），加入IPTG至终浓度0.lmM，22℃低温过夜诱导pColdI-prrsv-nsp7A蛋白的大量表达。3）收菌，将过夜培养的菌体转入250mL离心瓶内，6,000rpm离心半小时，去上清。用100mL预冷的BufferA悬浮沉淀，向其中加入0.1mMPMSF100μL。超声波破碎菌体。12,000rpm离心1h，将上清用0.22μm滤器过滤。3.重组蛋白的亲和层析重组蛋白pcoldI-nsp7A的N-端有6×HIS标签，利用树脂与6×HIS的亲和性将融合蛋白结合在树脂上，再通过高浓度咪唑将目标蛋白洗脱下来。亲和层析纯化重组蛋白：1）先用5倍于柱体积的平衡缓冲液BufferA平衡镍离子亲和层析柱。2）将过滤好的细胞裂解液上清缓慢上柱，缓慢操作是为了使融合蛋白与层析柱充分接触，以便于融合蛋白与层析柱的结合。3）上样完成后，用10倍于柱体积的BufferA冲洗层析柱。4）然后用洗脱缓冲液BufferC洗脱蛋白。SDS-PAGE分析洗脱蛋白的成分。5）用10倍于柱体积的蒸馏水洗涤层析柱，去除多余的咪唑缓冲液。6）用20%乙醇洗涤层析柱，4℃保存层析柱。五、注意事项1．选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2.融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。3.过柱前的注意事项：样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；确保样品及BindingBuffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争。