钴60辐照灭菌生物指标菌(生孢梭菌)使用sop

广西北斗星动物保健品有限公司操　作　标　准页码：4/4文件编码：SOP-81021版本号：01　　题目：钴60辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用SOP1．目的：建立钴60辐照灭菌生物指标菌——生孢梭菌CMCC（B）64941的使用规程，保证正确使用，对钴60辐照灭菌效果进行验证。2．适用范围：适用于用钴60辐照灭菌生物指标菌——生孢梭菌CMCC（B）64941对钴60辐照灭菌效果进行的监测。3．职责：钴60辐照灭菌操作人员、QA人员、QC微生物检验员对本标准的实施负责。4．方法：4.1生孢梭菌作为供试品无菌检查的厌氧对照菌。4.2培养基的制备4.2.1营养肉汤培养基胨10.0g，氯化钠5.0g，牛肉浸出粉3.0g，水1000mL。取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装，灭菌。4.2.2营养琼脂培养基按上述4.2.1营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH使灭菌后为7.2±0.2,分装，灭菌。4.2.3硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）酪胨（胰酶水解）15.0g，氯化钠2.5g，葡萄糖5.0g，新配制的0.1%刃天青溶液1.0mL,硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.3mL）0.5g，L-胱氨酸0.5g，琼脂0.75g，酵母浸出粉5.0g,水1000mL。 广西北斗星动物保健品有限公司操　作　标　准页码：4/4文件编码：SOP-81021版本号：01　　题目：钴60辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用SOP除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。4.2.3改良马丁培养基（用于培养真菌）胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，酵母浸出粉身碎骨2.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖20.0g，水1000mL。除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。改良马丁培养基置23～28℃培养。4.3菌液的制备接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～25小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌混悬液。4.4稀释液、冲洗液及其制备方法4.4.10.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g,加水1000mL,微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2,分装，灭菌。4.4.2pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g、加水1000mL,微温溶解，滤清，分装，灭菌。4.6供试品的无菌检查取本品4瓶，每瓶取10mL,混匀，取25mL转移至250ml含1%聚山梨酯-80的0.1%无菌蛋白胨溶液中，充分振摇使其分散，加入β-内酰胺酶溶液（每1 广西北斗星动物保健品有限公司操　作　标　准页码：4/4文件编码：SOP-81021版本号：01　　题目：钴60辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用SOPmg盐酸头孢噻呋加头孢菌素酶不得少于1000单位），充分振摇，置37℃水浴中加热1小时后，取出，按如下方法进行检查。取上述处理过的样品10mL接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15mL,改良马丁培养基每管装量不少于10mL。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。4.5培养及观察上述含培养基的容器按规定的温度培养14日，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后，或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14日后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2日，真菌培养3日，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。1．结果判断若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判断试验结果无效：⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；⑶阴性对照管有菌生长；⑷供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。6．注意事项：6.1试验所用的设备及环境的微生物监控结果应符合无菌检查法的要求； 广西北斗星动物保健品有限公司操　作　标　准页码：4/4文件编码：SOP-81021版本号：01　　题目：钴60辐照灭菌生物指标菌（生孢梭菌）使用SOP6.2供试品辐照灭菌的最终辐照剂量应经不同辐照剂量的筛选试验后确定。经筛选试验，选择符合无菌要求的最小辐照剂量做为灭菌剂量。