微生物限度检查法2

微生物限度检查法2007-9-19来源：中国兽药114网编辑：信风浏览:102  本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。供试用家兔供试用的家兔应健康无伤，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养,在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未经使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6℃的家兔；或供试品判定为不符合规定,但其组内家兔平均升温未达0.8℃，且已休息两周以上的家兔；或三周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前3～7日内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔1小时测量体温1次，共测4次，4次体温均在38.0～39.6℃的范围内,且最高最低体温的差数不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息2日方可供第2次检查用。如供试品判定为不符合规定,且其组内家兔平均升温达0.8℃或更高时，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。试验前的准备在作热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～28℃,在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，应避免噪音干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。家兔体温应使用精密度为±0.1℃的肛温计，或其他同样精确的测温装置。肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分半钟，每隔30～60分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1℃。试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的器皿,应置烘箱中用250℃加热30分钟或用180℃加热2小时，也可用其他适宜的方法除去热原。检查法取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔1小时按前法测量其体温1次,共测3次,以3次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上,或3只家兔体温升高均低于0.6℃,但升高的总数达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。结果判断在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总数低于1.4℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的兔数仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总数为3.5℃或3.5℃以下,均认为供试品的热原检查符合规定。在初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的兔数超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的兔数超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总数超过3.5℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。 微生物限度检查法微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。包括染菌量及控制菌的检查。供试品应随机抽样。如遇有异常或可疑的样品，须选取有疑义的样品。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。供试品在检验前不得开启，在检查前及检查中应防止供试品污染菌受损、致死或繁殖。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检查。检查的全部过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25℃～28℃，控制菌培养温度为36±1℃。细菌、霉菌（酵母菌）计数和控制菌检查，均应作对照试验。检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。培养基及其制备方法：1、营养琼脂培养基与营养肉汤培养基见无菌检查法（附录ⅩⅢＢ）2、虎红琼脂培养基胨5g虎红（四氯四碘荧光素）0.0133g葡萄糖10g（或0.133％虎红溶液10ml）磷酸二氢钾(KH2PO4)1g琼脂15～20g硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g水1000ml除葡萄糖、虎红外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、虎红，分装，115℃灭菌30分钟。3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)胨10g琼脂15～20g酵母浸出粉5g水1000ml葡萄糖20g除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热融化后，滤过，加入葡萄糖，分装，115℃灭菌15分钟。4、胆盐乳糖培养基(BL)胨20g牛胆盐1.3g乳糖5g（或去氧胆酸钠0.25g）氯化钠5g水100ml磷酸氢二钾(K2HPO4)4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)1.3g除乳糖、牛胆盐外，取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，115℃灭菌30分钟。5、曙红美亚甲蓝琼脂培养基(EMB)营养琼脂培养基100ml2％曙红溶液2ml20％乳糖溶液5ml0.5％亚甲蓝溶液1.3～1.6ml取营养琼脂培养基，加热融化后，冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液,摇匀，倾注平皿。6、麦康凯琼脂培养基(MaCC)胨20g1％中性红溶液2.5ml乳糖10g琼脂15～20g牛胆盐5g水1000ml氯化钠5g除乳糖、1％中性红溶液、牛胆盐及琼脂外、取上述成分,混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热融化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，115℃灭菌30分钟，冷至约60℃，倾注平皿。 7、三糖铁琼脂培养基(TSI)胨20g硫酸亚铁0.2g牛肉浸出粉5g硫代硫酸钠0.2g乳糖10g0.2％酚红溶液12.5ml蔗糖10g琼脂12～15g葡萄糖1g水1000ml氯化钠5g除三糖、0.2％酚红溶液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入琼脂，加热融化后，滤过，再加入其余成分，摇匀，分装,115℃灭菌30分钟，制成高底层(2～3cm)短斜面。8、四硫磺酸钠亮绿增菌液(TTB)胨5g硫代硫酸钠30g牛胆盐1g水1000ml碳酸钙10g取上述成分，混合，微温使溶解，121℃灭菌20分钟。临用前，取上述培养基，每10ml中加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中)0.2ml和0.1％亮绿溶液0.1ml，混匀。9、沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基(SS)胨5g硫代硫酸钠8.5g牛肉浸出粉5g　1％中性红溶液2.5ml乳糖10g　0.1％亮绿溶液0.33ml牛胆盐8.5g　琼脂20g枸橼酚钠8.5g水1000ml枸橼酸铁铵1g除糖、指示剂、琼脂外，取上述成分混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，滤过，加入琼脂，加热融化后，121℃灭菌20分钟，再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。10、胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)胨20g枸橼酸钠1g牛肉浸出粉3g枸橼酸铁铵1g乳糖10g1％中性红溶液3ml蔗糖10g琼脂18～20g去氧胆酸钠1g水1000ml硫代硫酸钠2.3g除糖、1％中性红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂,加热融化后,再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。11、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基胨10g牛肉浸出粉3g氯化钠5g琼脂15～20g十六烷三甲基溴化铵0.3g水1000ml除琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热熔化后，分装，121℃灭菌20分钟，冷至约60℃，倾注平皿。12、亚碲酸盐肉汤培养基临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1％亚碲酸钠（钾）溶液0.2ml，混匀，即得。13、卵黄高盐琼脂培养基胨6g10％氯化钠卵黄液100ml牛肉浸出粉1.8g琼脂23g氯化钠30g水650ml除10％氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1。121℃灭菌20分钟，待冷至约60℃，以无菌操作加入10％氯化钠卵黄液,充分摇匀,倾注平皿。10％氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋一个，以无菌操作取出卵黄，放入10％灭菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。 14、甘露醇高盐琼脂培养基胨10g1％酚红溶液2.5ml牛肉浸出粉1g琼脂15～20g甘露醇10g水1000ml氯化钠75g除甘露醇、1％酚红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，加入琼脂，加热融化后，滤过，分装，115℃灭菌30分钟，冷至约60℃,倾注平皿。15、蛋白胨水培养基胰蛋白胨10g水1000ml氯化钠5g取上述成分混合，加热融化，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中,121℃灭菌20分钟。16、磷酸盐葡萄糖胨水培养基胨7g葡萄糖5g磷酸氢二钾(K2HPO4)3.8g水1000ml取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中，121℃灭菌15分钟。17、枸橼酸盐培养基氯化钠5g枸橼酸钠（无水）2g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g溴麝香草酚蓝指示液20ml磷酸氢二钾(K2HPO4)0.8g琼脂15～20g磷酸二氢铵(NH4H2PO4)1g水1000ml除溴麝香草酚蓝和琼脂外，取上述成分，混微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热融化，加入指示剂混匀。分装于小试管中，121℃灭菌15分钟，置成斜面。注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。18、糖、醇发酵培养基基础液胨10g0.5％酸性复红指示剂10ml糖、醇0.5％（或溴麝香草酚蓝指示液6ml）氯化钠5g水1000ml取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示剂混匀,分装每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。配制葡萄糖发酵管时，于100ml基础液中加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管(Durham)的小试管中。121℃灭菌15分钟,配制其它糖醇发酵管时,将各种糖醇分别配成10％溶液,与基础液同时于121℃灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖醇溶液加入100ml基础液内,分装于灭菌小试管中。注：糖醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。19、5％乳糖发酵管胨0.2g乳糖5g氯化钠0.3g溴麝香草酚蓝指示液0.6ml磷酸氢二钠(Na2·HPO4·12H2O)0.2g水1000ml除乳糖和指示剂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入乳糖及指示剂，混匀，分装于含杜氏管的灭菌小试管中，115℃灭菌15分钟。20、尿素琼脂培养基胨1g葡萄糖1g氯化钠5g20％尿素溶液1000ml磷酸二氢钾(KH2PO4)2g琼脂20g0.2％酚红溶液6ml水1000ml除尿素和琼脂外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化并分装于锥形瓶，121℃灭菌20分钟。冷至50～55℃,加入经薄膜过滤除菌的尿素溶液，混匀。尿素的最终浓度为2％，分装于灭菌试管中，置成斜面。21、氰化钾培养基胨3g磷酸氢二钠(Na2HPO4)5.64g氯化钠5g氰化钾试液磷酸二氢钾(KH2PO4)0.225g水1000ml除氰化钾试液外，取上述成分，混合,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，121℃ 灭菌20分钟，冷却后，每100ml培养基中加入氰化钾试液1.5ml,分装于12×100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡皮塞塞紧，置4℃保存。同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。22、赖氨酸脱羧酶试验培养基胨5g1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml酵母浸出粉3gL-赖氨酸(DL-赖氨酸)0.5(1g)/100ml葡萄糖1g水1000ml除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后分装，每瓶100ml。加入L-赖氨酸0.5g（DL-赖氨酸1g）调节pH值使灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内，每管1ml并滴加一层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。23、绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基（PDP琼脂）胨20g甘油10ml氯化镁（无水）1.4g琼脂18～20g硫酸钾（无水）10g水1000ml取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使深解。调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶解，121℃灭菌20分钟，置成斜面。24、明胶培养基胨5g明胶120g牛肉浸出粉3g水1000ml取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中，115℃灭菌20分钟。25、硝酸盐胨水培养基胨10g亚硝酸钠0.5g酵母浸出粉3g水1000ml硝酸钾2g取胨及酵母浸出粉加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解，混匀。分装于含杜氏管的小试管中，115℃灭菌20分钟。