绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析论文

　　绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析论文陈波曼余加林刘官信胡琳燕李芳杨华【摘要】目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm，BF)形成发展过程中空间立体结构变化，以及BF形成过程中与其生物学行为之间的相互联系。方法体外建立6h和1、3及6d等4个时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型，通过绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)标记，结合激光共聚焦显微镜(confocallaserscanningmicroscopy，CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆，经图像结构分析软件(imagestructureanalyer.freel)明显大于后3d(6.1μm)，区域孔率(arealporosity，AP)、平均扩散距离(averagediffusiondistance，ADD)和结构熵(texturalentropy，TE)在BF形成的6h和6d分别为：0.98±0.01和0.92±0.02，呈现下降趋势；1.00±0.009和1.06±0.027，虽变化幅度不大，但亦呈现逐渐增加趋势；0.7±0.08和4.3±0.09，呈明显上升趋势。结论ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征，对细菌BF结构的定量化分析也有助于探索BF形成过程与其生物学行为之间的相互联系。【关键词】生物膜；铜绿假单胞菌；定量分析；结构ABSTRACTObjectiveToquantifythesequentialdevelopmentofbiofilmspatialstructureinbiofilmprocessageStructureAnalyer(ISA)soft.MethodsP.aeruginosaPAO1biofilmmodelinvitrodevelopmentonitoredindifferenttimeintervals(6hours,1day,3daysand6days).Thefluorescenceimagesstackofdifferentlayerinbiofilmmodelicroscopy(CLSM),basedonfluorophoresfromPAO1etersdescribingbiofilmspatialstructurecouldbeacquiredaftertheimageinformationprocessISAsoftaccumulatedduringbiofilmgrooreobviousduringthefirst3daysthanthelatter3days(19.6μmvs.6.1μm);mean0.98±0.01at6hto0.92±0.02at6d,theaveragediffusiondistance(ADD)increasedslightlyfrom1.00±0.009at6hto1.06±0.027at6d;thetexturalentropy(TE)increasedfrom0.7±0.08at6hto4.3±0.09at6d.ConclusionsTheISAsoftationofbacterialbiofilmspatialstructureinPAO1biofilmprocess.Quantifyingbacterialbiofilmstructurepermitsedcorrelatingbiofilmdevelopmentperformance.KEY)摄取BF发展成熟各阶段不同层面的图像，所获图片堆经图象结构分析(imagestructureanalyer，ISA)软件分析，获得PAO1菌株BF发展过程相关空间结构变化的数据，以期实现对细菌BF的无损伤观察，并对BF空间结构的定量化分析进行了初步探索。1材料和方法 1.1试剂和菌株铜绿假单胞菌PAO1菌株(本实验室保存)，pGFPuv质粒(Clontech公司)，质粒DNA小量提取试剂盒(日本BioFlux公司)，限制型内切酶EcoRI和HindIII(宝生物公司)，ISA软件(美国Montana州立大学HalukBeyenal教授提供)。(1)PAO1菌株电感受态制备参考单志英等［2］实验方法，将过夜增菌的PAO1菌株转接于50mlSOB培养基中，37℃，200r/min振荡培养；A600值为0.7左右时中止培养；2℃，6000r/min离心15min；菌体沉淀依次用等体积、1/2体积、1/5体积的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新悬浮，洗涤菌体；2℃，6000r/min离心15min，最后根据菌体多少加入不同体积的0.3mol/L蔗糖溶液将菌体混匀；分装成每管100μl，直接用于电转化。(2)pGFPuv质粒转化和转化菌株筛选感受态细胞100μl，质粒约50ng，加入预冷的0.1cm电转化杯中；在BioRad电转化仪上(设置电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω)进行电击5ms；将转化体系加入37℃温浴的800μlSOC培养基中，37℃，100r/min振荡复苏1h；取100μl菌液涂布筛选培养基，37℃，16h～18h；在筛选培养基上生长，且紫外灯下有绿色荧光的菌落即为实验需要的转化菌株。(3)转化菌株中质粒提取和酶切电泳鉴定挑取表达强绿色荧光的转化菌株单菌落，接种LBroth培养液，37℃振荡培养过夜；按照BioFlux公司质粒提取试剂盒产品说明进行质粒的小量提取；0.8%琼脂糖凝胶电泳；对照pGFPuv质粒图谱进行鉴定。用EcoRI和HindIII行双酶切，反应温度为37℃；反应体系为HindIII1μl，EcoRI1μl，10×M缓冲液2μl，提取质粒17μl，作用12h；0.8%琼脂糖凝胶电泳。(4)pGFPuv转化菌株建立BF模型挑取GFP转化PAO1菌株单菌落接种LBroth培养液，37℃，180r/min振荡培养过夜；调整A600值至0.5；接种PAO1菌液于预先放置灭菌盖玻片(8mm×8mm，作为黏附载体)的24孔细胞培养板中，每孔1ml；37℃，分4个不同时间段6h、1d、3d、6d孵育，隔日换液，每个时间段重复5次。1.2激光共聚焦显微镜观察氩激光(488nm)激发，物镜×20，每个模型由外(BF游离的一面)向内(BF和玻片相贴的一面)逐层扫描(沿Z轴扫描)，每个标本扫描8～16张。1.3运用ISA软件对PAO1菌株BF结构定量化分析 将上述获得的各时间组模型图片堆调入ISA3D软件，确认图片的完整性及顺序后运行ISA及ISA3D命令，运行结果包括：①结构参数：如结构熵(texturalentropy，TE)、结构能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平面参数：区域孔率(arealporosity，AP)、平均扩散距离(averagediffusiondistance，ADD)、最大扩散距离(maximumdiffusiondistance，MDD)等指标；③其它参数：如生物量(biovolume，BV)、比表面积(surfaceareabetassandvoid，SA)、单位面积生物膜体积(biomassvolumetosurfacearearatio，V2SA)等［3］。输出数据以EXCEL格式保存。2结果2.1GFP标记的PAO1菌株构建与发光表型观察通过电转化方法对PAO1菌株进行了pGFPuv标记。转化菌株自然光下即可见绿色荧光，在紫外灯下发出强绿色荧光；荧光显微镜下，转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光，细菌形态呈短棒状，提示pGFPuv已经成功转入了PAO1菌株中，该转化菌株可以作为BF空间结构定量化分析研究的模式菌。2.2转化菌株质粒提取鉴定及双酶切鉴定转化菌株抽提质粒后，电泳结果显示在2000和3500bp之间有一条约3300bp带，条带与质粒大小吻合。提取的质粒进行EcoRI和HindIII双酶切，电泳显示在2000和3500bp之间有一条约2500bp带，在500和1000bp之间有一条约800bp带，与预期结果吻合，提示pGFPuv已成功转入PAO1菌株，并以游离质粒形式表达。2.3CLSM观察GFP标记BF模型6h左右，PAO1已经在玻片上黏附聚集，发出绿色荧光；1d组模型多为绿色荧光，细菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；随着时间延长，BF变厚，3d组及6d组模型肉眼可见一层灰白色膜状物平铺于玻片上，镜下可见大片状BF，细菌密集，层叠如积云状，棉絮样，具备复杂空间结构，细菌之间有许多非绿色的黑色区域，呈管道或泡状。2.4ISA软件结构定量化分析对各时间组模型的平均厚度、AP、ADD及TE进行统计，随着培养时间延长，各时间组PAO1菌株BF的平均厚度不断增加，增加程度在前3d比较明显，每个时间组之间增加10μm以上，3d后增加速度减慢，3d组与6d组BF的平均厚度仅增加了6μm(表1)；随着培养时间延长，各时间组模型的AP值呈下降趋势，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值虽然变化幅度不大，但是呈上升趋势(表1)。表1各时间组PAO1菌株BF的平均厚度、AP、ADD及TE值3讨论 细菌BF是一个三维立体空间结构的生态系，是一个具有高度结构性、协调性和功能性的组织群体，BF结构的维持对BF生物学行为具有重要意义。深入认识BF的结构特点，不能停留在某一平面的形态描述，还需要对BF的空间结构展开定量化分析。由于报道基因中常用的绿色荧光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性质稳定、对细胞安全等优点，本实验运用电转化方法，成功地将pGFPuv转入PAO1中，建立体外PAO1菌株BF模型，运用CLSM观察以保证细菌BF结构的完整性，连续检测其在玻片表面定植形成BF的过程，结合计算机图像处理分析系统，对BF结构进行定量化分析。BF形成发展是一个动态过程，生长周期一般分为5个阶段：最初的定植阶段、不可逆黏附阶段、结构分化阶段、发展成熟阶段和解聚再定植阶段［4］。本实验通过CLSM连续动态观察PAO1菌株BF形成，基本反映了这样一个过程：6h左右PAO1菌株开始在玻片表面黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d时BF基本形成，具备三维结构，此后BF逐渐发展达到一个平衡，这与文献报道基本一致［5］。随着培养时间延长，BF厚度逐渐增加，但趋势渐缓，可能与BF营养渗透屏障有关。本实验还采用ISA软件获得了BF空间结构参数的定量化数据，实现了对BF基础结构特征的定量化分析。该软件由美国Montana州立大学的生物膜工程中心2000年开发，采用自动定阈系统［6］，降低了图片处理中主观因素的影响，对BF的二维和三维结构进行更多参数的测定和比较。ISA提供厚度参数显示，GFP标记的BF模型平均厚度在前3d内增长速度明显快于后3d，提示BF生长速度的不均一性。细菌黏附后初期，BF迅速增厚，但随着时间延长，BF厚度增加趋势减慢，其原因除与营养限制有关外，也可能是BF增加到一定厚度后，为保证底层细菌获得一定的营养物质而维持自身结构，对自身发出密度感应(quorumsensing，QS)信号产生反应，达到平衡状态。本实验对BF的观察中还发现BF并非一层单纯的致密膜，其内部存在很多黑色相互交通的间隙及孔道，Stoodley等［7］认为这些大、小不一的间隙和通道是BF结构的重要组成部分，其中充满了胞外多糖和蛋白质等营养物质，与深层BF中的细菌生长关系密切。ontana州立大学生物膜工程中心的研究积累发现，平面参数中以AP、ADD最有实用价值，这两个参数能直观地描述BF的结构特点及营养供应情况；而结构参数中以TE最有实用价值，可用于不同BF的比较分析。ISA还能提供FD、MDD、AVRL、AHRL、E、H等参数，但是它们与BF发展的潜在关系尚不明确，有待于进一步验证［10］。 本实验还利用CLSM的三维重建功能对部分模型进行了三维重建，得到了PAO1菌株BF的三维立体图像，图像反映BF是一个多样，开放、不均一的结构，与ISA软件分析结果一致。需要说明，外源基因表达蛋白质，需消耗宿主细胞的营养物、能量及相关酶等，是宿主细胞的额外负组，可导致重组质粒稳定性降低［11］，而BF中底层细菌营养物质最差，可能影响了GFP的充分表达。Leff等［12］亦报道，在低营养条件下的河水中，GFP质粒可能丢失或不表达。因此，本实验通过体外建立PAO1菌株BF模型，结合CSLM成功实现了对PAO1菌株BF的原位、动态观察，并利用ISA软件对获得的图片堆进行BF空间结构特点的定量分析，比较客观地说明BF形成过程中空间结构变化，为进一步深入认识细菌BF结构及有效控制细菌BF形成提供新的研究思路和技术平台，这对于临床上控制生物材料相关性感染具有重大意义。【