第十章 动物细胞工程与生物制药

第十章动物细胞工程与生物制药百泰生物药业有限公司和同仁堂为代表的开发区生物医药产业持续快速增长---2009-05 主要内容10.1动物细胞技术用于生物制药的历史10.3动物细胞工程与生物制药的未来发展10.2应用于生物制药与临床医学--开始用于制药的动物细胞技术--促进动物细胞技术应用的新技术--选择动物细胞生产生物制品--临床应用--减少实验动物用量--医学治疗的基础--疫苗--毒理试验的体外模型 动物细胞技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子乃至人造组织等产品提供了强有力的工具。 10.1动物细胞技术用于生物制药的历史早期疫苗产业:往往利用动物来生产疫苗，譬如用奶牛来生产天花疫苗。天花是继瘟疫之后世界上传播最广、最可怕的疾病。1555年，墨西哥天花大流行，全国1500万人口中，死了200万人。16-18世纪，欧洲每年死于天花病的人数为50万，亚洲达80万人。有人估计，18世纪内有1.5亿人死于天花。18世纪后期，一位英国乡村医生E.Jenner发现，一种挤奶女工容易得的、比较温和的疾病的人，对天花也有免疫力。在1798年发表自己的发现.到1975年，天花全世界范围内初步消灭了。用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗；譬如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗。10.1.1开始用于制药的动物细胞技术Fig.10-1这是一只患有牛痘溃疡的手。这种溃疡同爱德华·詹纳用来做天花疫苗的溃疡是一样的Fig.10-2天花疫苗—爱德华·詹纳英国1798年 1920～1950，开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗等。1950～1985期间，细胞工程及其他技术的进步，利用细胞培养技术，生产多种人用疫苗：预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等，并用于生产多种兽用疫苗。用类似的细胞培养技术还可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品。而先决条件是能够获得可分泌目的蛋白的细胞系。但这在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，成本高。 10.1.2促进动物细胞技术应用的新技术上世纪70年代的基因重组技术、杂交瘤技术（两大划时代的生物技术）大大促进了动物细胞技术的进步及应用。现在，用于生化检测的单抗有几千种。而用于人体疾病治疗的单抗则是近几年来生物制药的一个重要领域，已有几十种单抗药物正处于临床试验中。自从1986年FDA（FoodandDrugAdministration）批准第一种单抗治疗药物—用于器官移植治疗、可以抑制排斥反应的抗CD3单克隆抗体OK—T3以来，已有9种治疗用单抗药物获得FDA批准。 10.1.3选择动物细胞生产生物制品有多种宿主系统可供DNA重组技术选择来表达目的蛋白。常见的宿主系统：细菌、酵母、霉菌、丝状真菌、植物细胞、哺乳动物细胞等。各种表达系统各有利弊。总体上分两类：原核表达系统和真核表达系统。用于表达目的蛋白的多种宿主系统 （1）细菌等原核表达系统特点：繁殖快、易于培养，问题：第一，表达的蛋白质缺乏转录后的修饰，如缺乏蛋白质限制性酶切位点、二硫键、特殊的糖基化、磷酸化、酰胺化作用及形成天然蛋白质精确的三维结构环境等，而许多蛋白的生物活性与转录后的修饰有关；第二，原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞才能提取产物，给产物的分离纯化带来困难；第三，同时还易受外源毒素的污染。 （2）真核表达系统特点：第一，表达的蛋白具有转录后的修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白无论在结构和功能上都非常近似。且几乎所有用原核细胞表达的蛋白均可采用真核表达系统生产，反之则不尽然。第二，用动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单。但是，由于动物细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段。因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。 选择合适的表达系统原核表达系统一般用于“小分子、结构简单”的蛋白生产，且蛋白转录后无需修饰，如胰岛素；而真核表达系统主要用于“生产大分子、结构复杂的蛋白”，并且转录后的修饰对蛋白的生物活性具有重要影响，如组织型纤溶酶原激活剂(tPA）、促红细胞生成素等（EPO）等。某些蛋白如α-干扰素、人生长激素等既可用原核表达系统，也可用真核表达系统来生产，它们不需要转录后的修饰便具有生物活性。在这种情况下，应综合考察生产的经济成本和技术难易等因素来选择表达系统。 Fig.3基因工程药物生产示意图Fig.4口蹄疫疫苗生产示意图口蹄疫又称5号病，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。 10.2动物细胞工程技术在生物制药与临床医学的应用当今，由动物细胞大规模培养技术生产的产品在生物高技术产品中的销售额在1990年便已超过50%。更重要的是这些产品在以前数量不足以用于治疗，且生产成本极其昂贵。动物细胞大规模培养技术生产生物药品的一些特点： 过去使用动物生产的生物制品，经常发生过敏反应或病原体传染事件。如脊髓灰质炎疫苗可能被猿猴肾病毒污染；用人血制备的某些生物制品可能被肝炎或艾滋病病毒污染。采用细胞工程生产的产品能将致病因素降到最小：因为动物细胞培养所用的细胞背景明确，经过严格的安全检测，消除了污染病原体的危险。10.2.1临床应用（1）对病人更安全 （2）蛋白产品的产量和质量较高蛋白产品不能全由自然界提取，即使提取的许多生物蛋白制品也不可能用于疾病的治疗。现在，通过基因重组与表达系统，几乎可以大量生产任何氨基酸序列已知的生物蛋白。如果已经获得编码某一目的蛋白的基因，只需将其转染至宿主细胞中，获得可表达目的蛋白的基因工程细胞株，经动物细胞大规模培养便能获得大量的可供临床使用的生物制品。 实例：①人生长激素的生产：过去需要从成千上万个人脑垂体中提取，生产的生长激素极其有限。此外这种生产工艺具有传染克雅氏疾病的危险。而用表达人生长激素的基因工程细胞生产，可以获得大量的产品以满足临床的需要，而且不会传染疾病，使用产品更加安全。②EPO的生产：以前需要从2500L再生障碍性贫血病人的尿液中才能提取极微量的EPO用于实验室分析。现在，通过大规模培养基因工程细胞生产的EPO，已经治疗了成千上万的肾性贫血的病人。生产EPC设备 用于治疗心肌梗塞和肺部栓塞的溶栓药组织型纤溶酶原激活剂（t--PA），只有利用大规模培养重组基因工程细胞，才能获得足够量的产品用于临床；且临床实验表明，重组t--PA溶栓效果好、副作用小。③溶栓药物的生产④凝血因子的另一种生产方法治疗血友病患者都用凝血因子8或凝血因子9，这些因子原来都是从血浆中提取，生产方法烦琐，产量受限制，且存在传染乙肝、丙肝、艾滋病等疾病的危险。必须对血浆做严格的检验。而采用动物细胞技术生产凝血因子可以确保无病毒污染的高质量的产品。 ⑤干扰素干扰素（Interferon，IFN）是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，这些因子主要用来调节正常的细胞代谢、增殖和分化，但含量极低。淋巴因子具有种属特异性，只有人的淋巴因子在人体中有活性，因此不可能从动物体内提取淋巴因子用于人的治疗。并且，从人体组织中分离淋巴因子用于治疗也不现实，因为即便是治疗一个病人，也需要从很多的人体组织中提取。现在，可由培养能自然表达干扰素的细胞来生产，也可通过培养DNA重组细胞来生产，一般采用真核表达系统。 （3）人源化产品过去从猪胰中提取的治疗糖尿病的胰岛素，在某些患者体内会引起抗原-抗体反应。而基因工程有助于克服免疫反应的缺点。如果将表达人体蛋白的一段基因转染至动物细胞中，或者用一段人体基因序列替换动物基因（如人源化鼠抗体），就可以从中获得与人体蛋白一致的蛋白或人源化的抗体。用这种技术生产的生物制品无抗原性，可以反复使用而不引起过敏反应。 （4）新产品第一，用于检验的单抗：由于单抗具有特异性，在实验室中可以用于检测蛋白，在临床中则用于疾病诊断。事实上，单克隆抗体作为诊断试剂是最先上市的“新生物技术”产品，目前，已有几千种单抗产品面市，其应用范围从早孕检测到激素缺陷性疾病的检测。第二，用于治疗的单抗：单抗用于用于治疗才刚刚开始。已有近70种用于治疗肿瘤、艾滋病和其他疾病的单抗处于临床试验阶段。①McAb ②融合蛋白融合蛋白是将不同性质的生物蛋白通过基因工程的方法结合为一种功能改进的蛋白。例如将编码可以增强人体免疫反应的细胞因子的基因与编码肿瘤细胞特异抗原的抗体的基因联接成一段新基因转染到动物细胞内。这种基因工程细胞可以表达含有抗体和细胞因子的融合蛋白，用来激发人体对肿瘤细胞特异性排斥的免疫反应。 动物细胞技术生产生物制品的其他特点：第一，生产清洁。整个生产过程不会对环境造成污染，用于培养细胞的原料一般是含有各种氨基酸、糖、维生素等天然营养物质的培养基，而纯化过程也只需某些盐配成的缓冲液，不含任何对环境造成危害的有毒物质；第二，规模较小。与传统的制药工业相比，动物细胞培养的规模均较小，因为用于诊断和治疗的药物只需很小剂量，一般在微克级/人（如EPO、白介素、干扰素等），用于治疗心梗的溶栓药物的剂量较大，一般为几十毫克A人左右；第三，易于纯化。由于是胞外分泌的产物，表达的蛋白含量较高，而且培养基成分较单一，尤其是使用无血清培养基；第四，产品安全。使用基因工程细胞生产生物制品，克服了从动物脏器或组织中提取药物可能导致病原体传染的弊病，产品质量易于控制。20多年的生产表明，用动物细胞大规模培养获得的产品非常安全。 10.2.2减少实验动物用量，开发新药物传统方法生产抗体过程是将抗原物质注射到动物体内，待体内产生抗体后，从其血液中纯化这些抗体。缺陷：除可能引发动物保护组织的抗体外，该方法还有以下缺点：第一，不同动物个体产生的抗体可能会有区别，难于保证产品的均一性；第二，存在污染未知病原体的可能；第三，难于扩大生产规模。如果需要公斤级的产品才能满足临床需要，那么则需要捕杀大量动物来生产，费时费力费钱。采用动物细胞培养来生产单克隆抗体，则可以克服以上缺点。例如，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞后，只需在反应器中大规模培养杂交瘤细胞，便可以随时获取大量单抗，而不用牺牲大量动物。（1）提高生物制剂的数量和质量** （2）新药物开发早期的药物筛选一般用活体动物实验来评价新药的安全性和有效性，如果用动物细胞培养模型则能减少实验动物的用量。在临床使用前可初步了解药物与疾病之间的相互作用。不过，细胞培养实验不能完全代替动物实验，因为新药的药代、药效及毒理实验需要通过与完整的器官乃至动物个体相互作用才能比较充分表现其在内的作用特点。 10.3动物细胞工程与生物制药的未来发展预计动物细胞技术将继续在新疫苗、诊断和治疗生物制品的生产，以及生物学研究领域发挥重要作用，而且将在药物定向释放系统、基因治疗、细胞治疗以及组织工程等极富希望的新的治疗方法中起到重要作用。从目前正处于临床实验的近400种生物医药产品看，除许多基因重组蛋白药物的生产需要动物细胞大规模培养技术外，细胞治疗、基因治疗、单抗生产和疫苗生产等四大类生物治疗药物和方法，要进入实质性医疗应用，其核心都要依靠动物细胞技术。10.3.1医学治疗的基础 (1)药物定向释放系统药物定向释放系统是将药物在适当的位置、适当的时间、以适当的方式释放至病灶部位，释放的药物只作用于患病组织，而对周围正常组织没有影响，以提高药效，降低药物的副作用。目前比较看好的是免疫脂质体药物释放系统。《脂质体》是由磷脂双分子层构成的类似细胞的结构，脂质体的内腔可包含治疗药物，而将抗体如抗肿瘤抗原的抗体结合在脂质体的外表面（相当于细胞的膜蛋白）。--生物导弹。 (2)基因治疗主要包括两方面：其一，利用动物细胞培养生产病毒载体，这些经基因改构的病毒包含了功能缺失的基因或可导致肿瘤细胞凋亡的基因，删除了控制这些病毒在人体内复制的基因，通过这样的病毒，可以将“健康”基因转染至体细胞中。其二，培养基因治疗用的靶细胞，在体外将某种治疗基因转染至细胞内，再体外扩增这些转基因细胞，尔后将这些细胞移植到人体内。治疗的疾病：包括囊性纤维化杜兴肌肉营养失调症以及几种癌症，如黑色素瘤等。 (3)人造器官--另一个应用是组织工程领域，在体外培养具有一定功能的组织或器官。目前已有组织工程皮肤获得批准，用于治疗皮肤烧伤和顽固性溃疡。制备组织工程皮肤的关键是生物相容性材料的开发和动物细胞培养技术的成熟。(4)干细胞治疗胚胎干细胞的研究涉及到社会、伦理、宗教等领域中的许多问题，因此这一研究受到非常严格的限制，但它有可能成为分子生物学、细胞生物学、分子发育学、细胞工程等学科中最具研究价值的领域。 (5)体细胞治疗培养出具有某种特殊功能的人体组织。例如，治疗糖尿病一种可能的方法就是移植经体外扩增的胰岛细胞；通过移植脑细胞治疗帕金森病，移植肾细胞治疗肾衰竭等。在欧美，已有几家医院给病人注射转染细胞，治疗疾病已进入一期临床试验。这些转染的细胞可以分泌抗癌物质或能激发病人免疫反应的因子（如肿瘤坏死因子或干扰素等）。这些体细胞治疗还处于非常初级的阶段，其效果和大规模应用有待深入广泛的研究结果证实。 10.3.2疫苗正如前面所述，大多数病毒疫苗是通过将病毒接种到培养的细胞中，或者通过培养能表达病毒抗原决定簇的基因工程细胞来生产的。(1)一种新疫苗--空病毒粒子作为疫苗这种病毒颗粒包含所有可以激发免疫反应的病毒蛋白，但不含有病毒核酸，因此没有传染性。此外，这种疫苗较之只包含单一病毒蛋白的疫苗具有较好的免疫原性，因为这种疫苗具有完整的病毒抗原决定簇，并且进入血液循环系统后具有更长的半衰期。 (2)多价疫苗疫苗的另一个发展方向是研发多价疫苗，譬如基因工程改构的牛痘病毒，使其表达几种不同病原体的抗原决定簇并分布于病毒表面。用这种病毒经减毒处理制成的疫苗免疫，能使接种疫苗的人获得多种抵抗传染性疾病的能力，如正在开发的Latobacteria，这种疫苗就可以使人体产生抵抗狂犬病、抵抗乙肝和疟疾的抗体。 （3）抗体作为抗原---即使用抗独特型抗体作为抗原。首先制备某种抗原的抗体，再用这种抗体作为抗原制备第二种抗体，这种抗体便称为《抗独特型抗体》。它与第一种抗体匹配，与初始抗原类似，因此抗独特型抗体在功能上可以替代初始抗原而作为抗原，激发相似的特异性免疫反应。抗独特型抗体是蛋白质，不含RNA和DNA，没有传染性，因而使用安全。 10.3.3毒理试验的体外模型动物细胞培养技术在寻找新药和其它产品中作为筛选模型，不仅有利于得到高质量一致的结果，加快药物的筛选进程，还有利于减少药物筛选所用的试验动物。某种药物或产品要在人体使用前，必须比较充分地评估其潜在的毒副作用，而进行毒理试验需要大量地试验动物。但用细胞培养不能完全替代动物试验。因为全身性毒理试验只有在完整动物体内才能获得有意义的试验结果。 跋动物细胞技术已经在疫苗的生产，基因工程和抗体工程和药物筛选、开发生产中发挥了关键作用。目前，动物细胞技术已不只是用于获得研究、诊断或治疗用的蛋白质产品，其应用领域已扩展到细胞治疗、基因治疗和组织工程等新的治疗方法中。可以预见，在二十一世纪的生物学世纪中，无论在生物学基础研究，还是在生物高技术产业化领域中，动物细胞工程技术大有用武之地。 第十章习题1.原核表达系统表达目的蛋白与真核表达系统表达目的蛋白有那些主要特点？2.通常用原核表达系统表达那类蛋白，用真核表达系统表达那类蛋白？3.论述用传统方法生产单克隆抗体过程的缺陷，指出用杂交瘤技术生产单克隆抗体的优势？