细胞生物学实验指导

《细胞生物学实验》生命科学学院生物技术系二O一0年47 前言生命科学是一门实验科学，实验教学是培养学生创新能力的重要途径。细胞生物学实验主要为验证性实验，其主要目的是使学生加深理解细胞的形态结构及其生理功能等各方面的知识，掌握细胞生物学实验技术的基本操作和技能，并培养学生分析问题和解决问题的能力以及严谨、求实的科学态度。本着这样的目的，结合我们实验中心的实验条件，我们共设置12个实验，其中开设9个实验。希望通过本实验的学习，在加深对细胞生物学理论知识的了解和掌握的同时，真正提高学生的动手能力。动手能力实际是一种有更高要求的动脑能力。实验指导由王秀玲(4,7,8,10,11,12)、聂永心(1,2,9)、周淑梅(3,5,6)三位老师编写。刘鹰高、朱常香、彭清才等老师对本实验指导提出了意见和建议。2010.647 目录实验一：特殊显微镜的原理及其使用4实验二：电子显微镜的原理及使用8实验三：细胞膜的渗透性18实验四：细胞的凝集反应20实验五：诱导细胞融合—聚乙二醇法23实验六：线粒体和液泡系的超活染色26实验七：叶绿体和细胞核的荧光观察29实验八：细胞骨架的观察31实验九：细胞中DNA、RNA的显示33实验十：细胞培养的准备工作37实验十一：细胞的原代培养42实验十二：细胞的传代培养4547 实验一特殊显微镜的原理及其使用I.暗视野显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。二、原理和结构特点在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像．并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1/2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2μm)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。三、仪器、材料与试剂（一）仪器具有暗视野聚光器的显微镜（二）材料牙垢微生物，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。（三）试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上一片无划痕、清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。47 2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。3.将标本置于载物台上，插入10x物镜，用调焦螺旋聚焦样品。4.调节暗视野聚光器位置：这一步是调节暗视野像的关键，包括调节暗视野聚光器的高低位置和中间位置。可反复、缓慢地由低到高或由高到低调节暗视野聚光器的高低位置，聚光器偏高或偏低都将在视野中出现质量不好的影像，只有在合适的位置时，才可出现背景暗、影像亮的暗视野效果；调好聚光器的高低位置后，再通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，使得到最好的暗视野像效果。5.换用高倍物镜观察时，要换用高倍物镜相匹配的暗视野聚光器，依据上述步骤进行调节。五、作业1.绘制暗视野内牙垢微生物、洋葱内表皮细胞图（3－5个细胞）2.明视野和暗视野像的主要区别是什么？暗视野显微镜的特殊组件是什么？II.相差显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解相差显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解相差显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节相差显微镜的基本步骤。二、原理和结构特点光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。47 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环f状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。三、仪器、材料与试剂（一）仪器相差显微镜（二）材料口腔上皮细胞，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。（三）试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张清洁无痕的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片周围多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。2.将10x相差物镜旋入光路。3.将相应于10x相差物镜的相差聚光器的环状光阑移入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。4.将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。5.用柯勒照明法调节聚光器：①将视场光阑关到最小；②用聚光器升降调节螺旋，调节聚光器的上下位置，直至在目镜中观察到视场光阑像的边缘清楚；③调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑的像移至视场中央（调中聚光器）；④打开视场光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。柯勒照明是调好相差像的关键之一。47 6.观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的像和相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好相差最重要的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插入一个聚焦望远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰的环状光阑（在聚光器中）和相板（在相差物镜中）的像。如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，取出聚焦望远镜，插入目镜，就可在目镜中观察到一个清晰的口腔上皮细胞的相差像。7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差物镜的聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。五、思考题1.绘制口腔粘膜上皮细胞、洋葱内表皮细胞图（3－5个细胞），并比较暗视野和相差显微镜下洋葱内表皮细胞的差别？2.明视野和相差显微镜成像原理有哪些区别？相差显微镜的特殊组件是什么？六、注意事项1.调节电源使光源强度较大；2.一定要完全将两环合轴。III.荧光显微镜的原理及使用（见实验七:叶绿体和细胞核的荧光观察）47 实验二电子显微镜的原理及使用I.透射电子显微镜的使用一、实验目的1.了解常规超薄切片技术的基本过程及原理；2.了解透射电子显微镜的操作技术。二、实验原理透射电子显微镜是发展最早、应用最广泛的电子显微镜。在细胞生物学上，可用于观察和研究细胞内部的亚显微镜结构、蛋白质、核酸等生物大分子的形态结构及病毒的形态结构。透射电子显微镜以电子枪作为照明光源，从电子枪灯丝发射的电子束经聚光镜会聚照射到样品上。带有样品结构信息的透射电子（transmissionelectrons，TE）进入成像系统，被各级成像透镜聚焦、放大后，投射在观察荧光屏上，形成透射电子显微镜像。超薄切片技术是透射电镜样品制备最基本最常用的技术。生物样品的超薄切片过程是将含水的生物材料经过一系列的化学处理，使其被包埋在坚硬的树脂材料中，并且必须使其超微结构保存良好。这样在坚硬树脂材料中的生物样品就可以用超薄切片机切成厚度为50nm左右的超薄切片，以满足透射电镜对观察样品的要求。超薄切片制样过程较为复杂，包括取材、固定、脱水、包埋、切片、染色等基本步骤。每一步骤对于制片的成败都很关键，实验操作者必须认真严格地按照要求操作每一步骤，才能得到较好的观察效果。三、仪器、材料与试剂（一）仪器、用具透射电子显微镜、超薄切片机、制刀机、玻璃条、恒温箱、控温烤箱、冰箱、光学显微镜、磁力搅拌器、手术剪刀、眼科镊子、铜网镊子、量杯、量筒、烧杯、培养皿、注射器、吸管、青霉素小瓶、玻璃缸、载玻片、酒精灯、铜网、滤纸、牙签、睫毛笔、样品盒、包埋模具、医用胶布。（二）材料鼠肝或其他生物组织。（三）试剂0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）、2.5％戊二醛、1％锇酸、50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇、环氧丙烷、环氧树脂包埋剂一套（包括环氧树脂Epon812）、十二烷基琥珀酸酐（DDSA）、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐（MNA）、2,4,6-三47 （二甲氨基甲基）苯酚（DMP—30）、醋酸铀染液、柠檬酸铅染液。四、实验方法与步骤（一）试剂配置1.0.2mol／L磷酸盐缓冲溶液（PBS）A液：磷酸氢二钠·12H2O，71.64g，加双蒸水溶解至1000ml。B液：磷酸二氢钠·2H2O，31.21g，加双蒸水溶解至1000ml。根据不同要求，按不同配比，可得不同pH值的0.2mol／L的磷酸盐缓冲溶液，见下表：表2-1不同配比的磷酸盐缓冲溶液的pH值pH（25℃）7.07.27.47.6A液（ml）B液（ml）30.519.536.014.040.59.543.56.52.2.5％戊二醛固定液25％戊二醛10ml，0.2mol/LPBS50ml，加双蒸水至100ml即可。3.1％锇酸固定液（1）配置2％锇酸贮存液：取1g安瓿四氧化锇泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻划1～2道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静置48h四氧化锇溶解后备用。4℃避光保存。（2）配置1％锇酸使用液（现用现配）：取2％四氧化锇贮存液10ml，加0.2mol/LPBSl0ml混合。4.不同浓度的乙醇溶液用无水乙醇稀释成90％、80％、70％、60％、50％的乙醇。5.环氧丙烷（必须无水）。6.环氧树脂Epon812包埋剂（Luft配方）Epon812，90ml；DDSA（十二烷基琥珀酸酐，软化剂），6ml；MNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐，硬化剂），5ml；DMP-30[2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚]，按2%加入。使用时根据不同硬度要求按一定比例增减DDSA和MNA。DDSA液增多，则软；MNA液增多则硬。三种液体逐次加入混合均匀后，逐滴加入DMP-30，其浓度控制在2％。边加边搅，充分搅拌30min左右。7.醋酸铀染液称取醋酸双氧铀1.g,溶于50ml50％～70％乙醇溶液中，静置1～247 天，使未溶的部分沉淀，取上部黄色透明溶液用，4℃冰箱避光保存。8.柠檬酸铅溶液A液：硝酸铅（必须为新近产品）1.33g，柠檬酸钠1.76g，双蒸水（用前加沸冷却）30ml，充分摇匀，混悬液为乳白色柠檬酸铅铬合物。B液：氢氧化钠（NaOH）lmol／L。使用液：A液配制完毕30min后，加B液8ml，加双蒸水至50ml混匀，溶液清亮（pH值为10-12）。如有沉淀，不能再用。（二）超薄切片的制备超薄切片技术是指不需要特殊冷冻条件的常规包埋技术。包括取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色等步骤（图2-1）。1.取材将动物处死后，要快速取出组织，以免细胞内部细微结构发生改变。取材过程要注意以下几点：①取材部位要准确；②无人工损伤，不要牵拉、挤压，⑧样品块要小，一般切成lmm3的小块，起码在某一个方向上的厚度要小于lmm，④组织离开活体后尽快（1min之内）进入预冷的戊二醛固定液中（4℃）保存。2.固定固定是电镜样品制备中最重要的一环，其目的是使细胞生命过程立即终止，使细胞结构和化学成分保持生前状态。电镜材料固定一般采用双重固定法，即先用戊二醛进行前固定，然后再用锇酸进行后固定。两次固定之间要进行漂洗。（1）前固定：将取的材料立即投入预冷的2.5％戊二醛溶液中，4℃条件下固定3h。若不马上进行后面的制备程序，可保存在0.2mol/L的PBS中或2.5％戊二醛溶液固定液中（4℃）。戊二醛的两个醛基与蛋白质、核酸等的氨基发生交链作用，可以较好地固定蛋白质、核酸和多糖等，能保存微管、糖原、核蛋白和细胞基质等，不易使酶失活，可以用于细胞化学研究，但不能固定脂类，对脂质颗粒、膜结构等保存不好。如果对保存超微结构（尤其膜系统）有较高的观察要求，经戊二醛溶液单固定的样品不宜保存过长时间，在1周内进入常规制备程序为好。2.5％的戊二醛固定液对组织的平均渗透深度为0.6mm，这是取材要小的原因之一。（2）锇酸后固定：进行后固定以前，材料要用0.1mol／LPBS漂洗6次，每次l0min。避免戊二醛与四氧化锇发生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。漂洗后取出，转入1％四氧化锇固定液中，4℃条件下固定1～2h47 。四氧化锇对氮有较强的亲和力，能与蛋白质氨基迅速结合形成交链化合物，对含蛋白质的各种结构成分均能固定。能与不饱和脂肪酸反应，生成四氧化锇二酯化合物，使含有脂类的结构固定。因为锇是一种高原子序数元素，在用四氧化锇固定样品的同时，还起到一种电子染色作用。但是，四氧化锇4不能固定核酸，对糖原、微管等保存不好。同时，四氧化锇又是酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究。四氧化锇固定时间太长，不仅易丢失成分，而且会使组织变脆，难切片。四氧化锇具有极强的挥发性和毒性，在任何污染和光照条件下，都可能还原成水和二氧化物而减弱固定效果，故不易长期保存。图2-1常规超薄切片标本的制备过程（参考HallJL，1978）1-取材；2-醛类固定；3-缓冲液清洗；4-饿酸固定；5-缓冲液清洗；6~9-脱水；10-环氧丙烷浸透；11-包埋剂浸透；12-包埋；13-聚合；14-修块；15-超薄切片；16-染色3.漂洗与脱水（147 ）将四氧化锇固定后的材料取出，在脱水以前要进行漂洗。先用吸水纸吸干净四氧化锇4固定液之后，用0.1mol／L的PBS漂洗6次，每次10min。以避免在脱水时四氧化锇4与乙醇产生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。（2）将漂洗后的材料依次放入50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇与环氧丙烷，每级15～20min，使组织中的水分充分除去。脱水剂一般用乙醇、丙酮和环氧丙烷等，利用它们具有能与水也能与包埋剂混溶的特点，以取代样品中的水分，使水分充分除去。浓度梯度脱水是为了减少样品收缩。4.浸透经脱水后的材料在包埋以前要经过浸透处理，即用包埋剂与脱水剂按浓度梯度分级换液，使包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织中去，最终使组织细胞内所有空隙均充满包埋剂。具体操作方法：在室温下或37℃条件下将样品置入3:1的环氧丙烷与包埋剂的混合液，10～30min；1:1的环氧丙烷与包埋剂混合液，30～60min；1:3的环氧丙烷与包埋剂混合液，1～2h或过夜；纯包埋剂，2～5h或过夜。5.包埋包埋的目的是让样品材料获得一定的硬度、弹性和韧性，以便制成超薄切片。操作过程如下：在包埋模具内滴一滴包埋剂，把样品置入并使之定位于合适位置（依模具而异），缓缓注入包埋剂，然后放入烤箱中进行聚合（使包埋剂固化）。控温及时间依次为：37℃，12h；45℃，12h；60℃，36h。在包埋过程中，充分浸透的样品包埋在包埋剂中，加温使包埋剂逐渐由单体聚合成高分子，样品及包埋介质获得高度的稳定性、均匀性、合适的硬度和弹性。Epon812是一种优良的包埋剂，为进口环氧树脂（epoxyresin），DDSA（dodecenylsuccinicanhydride）为十二烷基琥珀酸酐，是一种软化包埋块的长链脂肪族分子；MNA（methylnadicanhydride）为甲基内次甲基邻苯二甲酸酐，可以硬化包埋块；DMP-30为2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚，可以加速固化。6.制备超薄切片制备超薄切片的主要步骤有：修块（包埋块粗修）、制备玻璃刀、制备支持膜、半薄切片、修块（包埋块细修）、制备超薄切片。（1）包埋块粗修：在对包埋样品进行超薄切片之前，先要粗修包埋块，机修、手修均可。一般可在解剖镜下先小心地把块顶端的包埋介质修去，暴露出组织，再把样品四周修成锥体形，顶面修成梯形。（2）玻璃刀的制备：超薄切片常用玻璃刀或钻石刀。玻璃刀要用含72％～7547 ％二氧化硅、5～8mm厚的硬质玻璃，并在专门的制刀机上制备。制备好的玻璃刀还要在刀刃背部用胶布或银胶带围成一个水槽（钻石刀水槽是固定的），用石蜡封固，以方便切片的收集。（3）支持膜的制备：通常用铜网做超薄切片的载网，类似光镜下载玻片的作用。电镜细胞化学样品则需要用镍、铂、金、不锈钢或尼龙网等。载网直径一般为3mm，厚20～50pm，网孔数量1～400目不等，形状多种多样。网上一般要覆盖一层支持膜，膜的厚度约10～20nm，以防止漏片、卷片，加强切片的稳定性（较大的切片最好不用支持膜）。常用支持膜为Formvar膜（聚乙烯醇缩甲醛膜）或者火棉胶膜，也可用碳膜等，（4）切片：切片可分两步进行。半薄切片：先将粗修好的包埋块在超薄切片机上切成厚0.5～2μm的半薄切片，用甲苯胺蓝染色或亚甲蓝、天青Ⅱ—碱性品红染色后，在光镜下观察。其目的是：①可以根据半薄切片精确定位，准确保留超薄切片位置，避免丢失有价值的结构；②了解样品包埋质量，以确定是否继续做超薄切片；③半薄切片可以得到比一般石蜡切片更清晰的图像，所以便于进行定量形态学分析，而且可与超薄切片对照观察研究。超薄切片：超薄切片用超薄切片机完成。根据推进原理，切片机分为热膨胀式和机械推动式两大类。TEM常规超薄切片厚度最佳值为50～80nm，观察干涉色可以判断漂在刀槽里的切片厚度，以便确定用铜网捞取哪些切片。超薄切片要求在防震、恒温和无较大气流流通的环境下进行，否则会影响切片效果。7.电子染色电镜观察时，切片需具有一定的反差，故常用重金属盐染色，也称电子染色。常用的重金属盐有铀盐和铅盐。（1）醋酸铀可与大多数细胞成分结合，尤其易于与核酸结合，不易出现沉淀。但铀盐见光分解，应避光染色。用醋酸铀染液染10～30min后，先用双蒸水漂洗，再用滤纸吸干。（2）铅盐易与蛋白质、糖类结合。因为铅盐与二氧化碳反应生成碳酸铅沉淀,所以防止铅污染至关重要。用柠檬酸铅染液染1～5min，立即用双蒸水漂洗，用0.2mol/L氢氧化钠分化，再用双蒸水漂洗，自然干燥后观察。五、实验结果及分析（一）透射电镜的操作使用透射电镜观察生物组织切片的一般程序简述如下：1.启动稳压电源，接通冷却循环水。2.启动电镜的真空泵抽真空。47 3.真空度达到要求后，将载有超薄切片的铜网安放在样品杆上并送入样品室。4.启动高压，加热灯丝获得照明。5.先在低倍条件下调节亮度，利用样品移动装置选择观察视场，并聚焦需要观察的标本，再选择适宜的观察区域放大观察。6.调节中间镜电流，控制放大倍数，配合调节聚光镜，选择合适的亮度，精确调焦，消像散。7.将需要的结构图像照相记录。8.电镜使用完毕后，先关掉机器，再关冷却水和总电源。（二）超薄切片的观察在教师的指导下，将超薄切片样品至于透射电子显微镜下，认真仔细观察细胞的超微结构，选择满意的区域，进行拍照。六、注意事项1.取材时动作一定要迅速，所用刀片要洁净锋利，否则会损伤样品结构。2.配置包埋剂的过程中，需要充分搅拌，在搅拌的同时，防止包埋剂产生很多小气泡，如产生需要将包埋剂放入40℃烘箱中，赶走小气泡。否则样品不能充分浸透。包埋过程中所使用的一切器皿和工具，都必须充分干燥。3.锇酸即四氧化锇挥发性强，属强氧化剂，毒性强，因此使用时注意通风，操作时应在通风橱中进行。配置和储存不当会产生锇黑，使其失效，因此需冷冻、密封和遮光保存，临用前需彻底化开，以免浓度欠佳。4.醋酸铀染液有微量放射性，能发荧光，需小心使用、避光保存。七、思考题1.简述透射电镜超薄切片制备的生物样品取材过程中有那些要求，为什么?2.简述超薄切片制备技术中用戊二醛、锇酸进行双固定的意义。II.扫描电子显微镜的使用一、实验目的1.了解解扫描电子显微镜样品制备过程。2.了解扫描电子显微镜的使用技术。二、实验原理47 扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）的分辨本领虽然不如透射电镜（TEM），但却具有很强的立体感，可以在亚细胞水平上生动地显现生物样品的三维结构，适合于观察样品的表面形貌，在生物学上，通常于观察研究组织和细胞表面的三维立体显微及亚显微结构。扫描电镜与透射电镜相同的是都采用电子束作光源，电磁场作透镜。所不同的主要是电子束、电子束照射样品的方式和被利用来成像的信号电子不同。扫描电镜主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即是使用逐点成像的方法获得放大像。由于观察目的不同，除了使用相同的固定液之外，SEM生物样品制备与TEM有较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构，在SEM样品制备的全过程中都必须十分小心地保护被观察面。在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀的金属膜。三、实验材料、试剂和仪器（一）仪器、用具扫描电子显微镜、临界点干燥器、离子溅射仪、超声波清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、抛光膏、刀片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、牙签、竹签、培养皿、烧杯、量筒、量杯、注射器、载玻片、脱脂棉、导电胶。（二）材料小鼠小肠（三）试剂2.5％戊二醛溶液、1％锇酸溶液、0.2mol／L磷酸盐缓冲溶液，醋酸异戊酯、液体二氧化碳、双蒸水。四、方法与步骤1.准备样品托用抛光膏擦净样品托，然后用丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。2.取材注意保护好被观察表面，彻底清洗干净，暴露出最佳位置。样品体积应依据观察要求及样品托大小等酌情而定。47 3.固定、漂洗和脱水由于扫描电镜是观察样品某一表面形貌的，所以固定时间可以比透射电镜短。另外，脱水时，到纯乙醇级即可。漂洗可参考透射电镜样品制备。4.用醋酸异戊酯置换乙醇弃去乙醇，用醋酸异戊酯与纯乙醇l:1的混合液浸10～20min。弃去混合液浸入纯醋酸异戊酯，浸10～20min。5.二氧化碳置换醋酸异戊酯及临界点干燥从纯醋酸异戊酯中取出样品，保持湿状态时置入临界点干燥仪（criticalpointdryer）的样品盒并放进样品室（预冷）。盖紧样品室，充入液体二氧化碳，液面高出盒面。缓慢排出气体二氧化碳。直至样品保持湿润、周围有少量液体二氧化碳为止。重复充液排气2～3次。然后，向样品盒内注入液体二氧化碳（高度不超过80％），加热、加压达到临界点进行干燥之后，排气。取出样品放入干燥器内备用。临界点干燥是利用液态二氧化碳的临界状态下表面张力为零的特性，使样品中的液态二氧化碳逸出，避免了表面张力对结构的破坏。6.粘贴样品用少量导电胶涂在样品托上，用镊子轻夹样品侧面，观察面朝上置于样品托上。7.离子溅射镀膜把样品托插入离子溅射仪真空室样品台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10～15nm厚的金属膜。溅射镀膜的基本原理是：高能粒子轰击金属靶（金、铂、钯铱合金等），靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉积在样品表面，形成连续的导电膜。这种金属膜不仅可以导电，受激产生较强的二次电子发射，严格地控制膜的厚度，是获得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。五、实验结果及分析（一）扫描电镜的操作扫描电镜的一般操作步骤如下：1.启动电镜。包括接通电源，开动真空系统进行排气，在真空度达到要求后，接通显示单元电源。2.放入样品，注意调节样品高度。3.设定观察条件。这些条件包括：加速电压、束电流、光栏直径、工作距离、放大倍率以及倾斜角等。注意选择好视野。4.聚焦，消像散。47 5.照相摄影。根据底片特性选择合适的反差、亮度及拍摄时间。6.电镜使用完毕后，先关掉机器，再关掉电源和冷却水。（二）样品标本的观察在教师的指导下，将样品标本至于扫描电子显微镜下，认真仔细观察标本的表面形貌特征，进行拍照。六、注意事项1.戊二醛用时现配，常与锇酸配合使用，其缺点是不能增加样品的二次电子发射率。2.四氧化锇属重金属盐类，具有增加反差作用，因而可提高样品的二次电子发射率，缺点是易氧化。3.进行扫描电镜标本制备时，不同的样品制样方法有所不同，但都应遵循以下原则：①在样品制备过程中，防止标本污染和损伤，尽可能地保持原有结构；②在脱水和干燥处理时，尽量减少因标本收缩导致的人为假象；③在应用组织导电法处理样品时，应充分漂洗，以防镜筒污染。七、思考题1.分析扫描电镜与透射电镜的主要异同点。2.简述扫描电子显微镜生物样品制备的过程。47 实验三、细胞膜的渗透性一、实验目的：了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞的速度。二、实验原理人工合成的脂质体主要用来研究细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。但不同分子通过脂双层扩散的速率差别很大，主要取决于它们在脂类和水之间的分配系数及其分子的大小。分子越小，分配系数越大，通过质膜的速率越快。小的、亲脂性的、非极性分子容易溶解于脂双层，可迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子如果时间足够，也能很快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子可以跨膜扩散运输，但比较困难；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都很难透过脂双层的疏水区，它们要通过载体介导的主动运输方式跨膜运输。与人工脂双层膜不同的是，生物膜不但允许水和非极性分子借简单的物理扩散作用透过，还允许各种极性分子，如离子、糖、氨基酸、核苷酸及很多细胞代谢产物通过特有的机制通过。　如果将红细胞放置在各种溶液中，根据红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可渗入，有的溶质不能渗入。即使能渗入，速度也有差异。可通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度。血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。渗入红细胞的溶质能提高红细胞渗透压，使水进入红细胞，引起溶血及细胞膜破裂。此时光线较容易通过溶液，使溶液呈现透明即为溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，可通过溶血现象来测量各种物质通透性的差别。三、材料、试剂和仪器1．材料一龄鸡，将鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中（肝素钠0.2mg/mL,一般范围在0.01-0.2mg/mL；等渗液为0.15mol/LNaCl）2.试剂0.17mol／L氯化钠，0.17mol／L氯化铵，0.17mol／L硝酸钠，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇；0.12mol／L硫酸钠，0.10mol／L草酸钠，0.10mol／L醋酸钠，3.器材试管，5mL量筒，滴管，载玻片，盖玻片，光学显微镜。四、实验程序1．血红细胞悬液：用注射器吸入2mL含有肝素的等渗液后从鸡翼下静脉取鸡血5mL，加47 入50mL烧杯，将鸡血用等渗液进行1：10稀释。　　2．溶血现象观察：取试管一支加入3mL蒸馏水，加入1滴或2滴稀释的鸡血，轻混一下，然后静止注意观察溶液的颜色变化。由于红细胞发生破裂，溶液颜色由浑浊的红色逐渐清亮。此即为溶血现象。3．鸡红细胞的渗透性记时比较：　　对上述溶液进行溶血记时比较，注意从滴进血红细胞开始记时，操作方法同2。注意观察颜色变化，回答是否有溶血现象？为什么？五、结果与分析　　将观察到的现象记录，并进行分析试管编号溶液种类是否溶血溶血所需时间结果分析12345678910六、思考题1.推断下列溶液的溶血反应会如何。0.17mol/L氯化钾、0.17mol／L硝酸钾0.12mol／L氯化镁、0.12mol／L氯化钙、0.10mol／L硫酸钾、0.10mol／L醋酸钾、0.10mol/L柠檬酸钠、0.32mol／L，甘露醇、0.32mol/L蔗糖。2.溶液的渗透压主要与哪些因素有关?对简单盐溶液如何粗略计算出其渗透压?47 实验四：细胞的凝集反应一、实验目的学习研究细胞凝集反应的方法，了解细胞发生凝集反应的原因。二实验原理凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。凝集素使细胞凝集是因为它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。大多数凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。凝集素与糖结合的活性及专一性决定其功能。三、实验材料与用品实验材料：马铃薯块茎，韭菜叶片。试剂：(1)磷酸缓冲液：分别称取NaCl7.2g、Na2HP041.48g、KH2P040.43g用蒸馏水溶解，混合后用蒸馏水定容至1000ml，用（NaOH）调pH值至7.2。(2)生理盐水：0.9％氯化钠无菌水溶液(3)硫酸铵(4)石英砂仪器与器材：离心机，光学显微镜，研钵（2），药匙（2），纱布，离心管（7ml，2个），带刻度（2ml）滴管，25ml烧杯，玻璃棒，10ml量桶，载玻片，盖玻片，滤纸，吸水纸。四、实验步骤：1.2%鸡血细胞制备：以无菌方法抽取鸡的静脉血液（含0.2％肝素钠）用生理盐水洗3次，每次1500r/min离心5min，最后按沉淀压积的红细胞体积加生理盐水配成2%鸡血细胞液。47 2.马铃薯块茎：(1)提取凝集素：称取马铃薯去皮块茎4g，加少许石英砂和磷酸缓冲液于研钵中研磨成匀浆，最终加到5ml磷酸缓冲液，浸泡1.5h，浸出的粗提液中含有可溶性马铃薯凝集素。(2)测定血凝活性：用滴管吸取马铃薯凝集素粗提液和2%鸡血细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置10min后于显微镜下观察细胞凝集现象。用一滴磷酸缓冲液和一滴2%鸡血细胞液混合作为对照观察。3.韭菜叶片：(1)取韭菜叶片5g用蒸馏水洗净剪碎，加少许石英砂和生理盐水于研钵中研磨成匀浆，最终加到5ml生理盐水，砂布过滤，滤液倒入2个离心管，平衡后在5000r/min下离心20min，弃沉淀,留上清液。(2)上清液加相应硫酸铵至60%饱和度沉淀（见附录“不同饱和度硫酸胺沉淀蛋白质表”）,边加入边用玻璃棒搅拌至完全溶解。5000r/min下离心20min，沉淀用1ml磷酸缓冲液溶解。(3)用滴管吸取韭菜凝集素提取液和2%鸡血细胞液各一滴,置载玻片上，充分混匀，静置10min后于光学显微镜下观察细胞凝集现象。五、结果与分析绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。六、思考题1.植物细胞凝集素在鸡红细胞凝集过程中起什么作用？2.哪些因素影响细胞凝集反应？47 附录“不同饱和度硫酸胺沉淀蛋白质表”47 实验五：诱导细胞融合——聚乙二醇法一、实验目的了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导细胞融合的方法。二、实验原理细胞融合，即在自然条件下或利用人工法(生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。聚乙二醇(PEG)结构为：CH2(OH)-(CH20CH2)n-CH2OH，相对分子质量在2000-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。三、实验材料与用品材料：鸡血红细胞。试剂：(1)Alsver液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，氯化钠0.42g，用柠檬酸溶液调节pH值至7.2,最后用双蒸水定容至100mL即可。(2)0.85％生理盐水：0.85g氯化钠溶于100mL双蒸水中。(3)GKN液：氯化钠8g，氯化钾0.4g，磷酸氢二钠1.77g，磷酸二氢钠0.69g，葡萄糖247 g，酚红0.01g，溶于1000mL双蒸水中。(4)Ringer溶液：氯化钙0.25g，氯化钾0.42g，氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。(5)Hanks液：氯化钙0.14g,氯化钾0.4g,磷酸二氢钾0.06g,氯化镁0.10g,氯化钠8.0g,碳酸氢钠0.35g,七水磷酸氢二钠0.09g,D-葡萄糖1.0g,酚红0.01g溶于100mL蒸馏水中。(6)50％PEG混合液：称取少许PEG(Mw4000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其溶化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制。(7)0.2%次甲基蓝仪器：显微镜，离心机，水浴箱，电炉，量筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯，吸管，载玻片，盖玻片。四、实验步骤1.鸡血红细胞悬液的制备：用注射器吸入1mL　Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2mL，注入刻度离心管内，按照3：1(V／V)加入6mLAlsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3--4天。2.取细胞悬液1mL，移人10mL离心管，加入4mL0.85％生理盐水混匀。1500r／min离心5min。3.弃上清液(用吸管吸去)，加0.85％生理盐水至5mL，混匀后1500r／min离心5min。4.重复上述条件，再离心洗涤1次。5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量的GKN液或Ringer溶液，按压积红细胞体积配成10％的红细胞悬液。6.取悬液1mL到1个试管中，加入0.5～0.8mL预热的50％PEG(慢慢沿着离心管壁逐滴加入,边加边轻摇离心管,使其混匀)，37℃水浴中温浴2min；7.缓慢加入Hanks液5ml以终止PEG的作用,轻轻吹打混匀,37℃水浴中静止5min47 8.1000r／min离心5min,去上清,指弹使细胞团分散.9.取细胞悬液1滴滴于载玻片上，再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴,染色3分钟盖上盖玻片,显微镜下观察细胞融合现象10.进行多个视野的测定，统计细胞平均融合率。五、结果与分析1、绘制观察到的融合细胞图,计算观察到的细胞融合率。　　　2、试说明细胞融合的关键.六、注意事项如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行灭菌，采血在无菌条件下进行。PEG有毒，请操作过程中勿沾到皮肤上。47 实验六　线粒体和液泡系的超活染色一、实验目的1.　观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；2.　学习一些细胞器的超活染色技术．二、实验原理　　活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法.其目的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡.活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态.根据所用染色剂的性质和染色方法的不同,活体染色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的.体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其“电化学”特性与被染部分相互吸引被选择固定在活细胞的某种结构中而显色．但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用.詹纳斯绿Ｂ和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性．詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基.中性红对液泡系的染色具有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核和细胞质不着色,这可能与液泡中的某些蛋白质有关.三、实验用品１.器材：显微镜、恒温水浴锅、、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸47 ２.试剂：①Ringer溶液氯化钠,０.８５g;氯化钾,０.２５g;氯化钙,０.０３g②1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5mlRinger溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液.取1ml1%原液加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力.③1/3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50mlRinger液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存.临用前取1ml1%原液加入29mlRinger溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用.3.材料：人口腔上皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞绿豆幼根根尖四实验方法（一）线粒体的超活染色与观察１.人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察载玻片于37℃恒温水浴：1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液　　2滴人口腔上皮细胞黏液　　　牙签刮取染色10－15min，盖上盖玻片，吸去周围染液，显微镜下观察．　２.洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察47 载玻片于37℃恒温水浴：1/5000詹纳斯绿B溶液　　１滴洋葱鳞茎内表皮　　　　　镊子撕取染色10－15min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片，显微镜下观察．　（二）　绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察载玻片于37℃恒温水浴：初生绿豆幼苗根尖（1－2cm）纵切面切片　　１片1/3000中性红溶液　１滴染色5－10min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察．　五、结果与分析1.绘出人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析；2.绘出绿豆幼根根尖细胞示液泡系的形态与分布并简要分析．47 实验七：叶绿体和细胞核的荧光观察一、实验目的:1.观察叶绿体的自发荧光和细胞核的次生荧光2.熟悉荧光显微镜的使用方法二、实验原理:荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间。三、实验材料与用品：实验材料：烟草、大葱叶片试剂：O.01%吖啶橙，0.9％氯化钠溶液。仪器与器材：刀片，眼科镊子（直头），载玻片，盖薄片，滴管，微量加样器，枪头、1.5ml离心管、离心管架、锡箔纸、普通显微镜，荧光显微镜四、实验方法:1、徒手切片或撕取叶片表皮条在普通显微镜观察叶绿体形态47 用刀片将新鲜的叶片削出一斜面，沿斜面切下一薄层完整组织，置于载玻片上，递加1-2滴0.9％NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。2、徒手切片叶绿体自发荧光观察相同方法制备叶片徒手切片，置荧光显微镜下，用蓝光激发光照射标本，观察记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。3、叶绿体和细胞核次生荧光观察叶片的徒手切片或表皮条至于载玻片上，递加1-2滴O.01%吖啶橙，染色1分钟，加盖玻片，置荧光显微镜下观察。用紫外激发光照射标本，记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。五、实验结果与分析1、普通光镜下，可看到表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2、荧光显微镜下，在蓝光激发光照射下，叶绿体发出火红色荧光。3、加入吖啶橙染色后，叶绿体发出桔红色荧光，细胞核发绿色荧色。六、思考题：加入吖啶橙染色后，叶绿体和细胞核各发出什么颜色的荧光？为什么？七、注意事项:1.吖啶橙为致癌物，使用时注意不要涂到皮肤、实验台等其它器皿上。用过的载玻片放到指定地点统一处理。2.使用荧光显微镜时要正确操作3.吖啶橙易分解，染色时要致黑暗处，观察时动作要快。47 实验八：细胞骨架的观察一、实验目的:掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架的方法。对细胞内细胞骨架的网状结构有一个整体上的认识。二、实验原理:植物细胞用适当浓度的TritonX-100处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，考马斯亮蓝R250是一种蛋白质染料。处理后的材料固定和染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。三、实验材料与用品：实验材料：洋葱鳞叶，烟草叶片试剂：(1)0.2％考马斯亮蓝R250染色液：称考马斯亮蓝R2501g，溶于250ml无水乙醇中，加冰醋酸35ml，再加蒸馏至500ml。(2)磷酸缓冲液(pH6.8)：0.1M磷酸缓冲液，pH6.8。(3)M缓冲液(pH7．2)：50mmol／L咪唑，50mmol/L氯化钾，0.5mmol／L氯化镁,1mmol/LEGTA,0.1mmol/LEDTA,1mmol／L巯基乙醇(DTT)，调至pH7.2。(4)1%TrionX-100：用M缓冲液配制。(5)3%戊二醛：用磷酸缓冲液配制。仪器与器材：47 显微镜，1.5ml离心管，直头眼科镊子，滴管，载玻片，盖玻片，滤纸，吸水纸。四、实验步骤：1.用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片（1cm2左右)，烟草叶片下表皮若干片，置于1.5ml离心管中，加入pH6.8磷酸缓冲液1ml，使其下沉。2.吸去磷酸缓冲液，加1ml1％TritonX-100处理30min。3.吸去TritonX-100，用M缓冲液洗3次,每次1ml，3min。4.用1ml3％戊二醛固定30min。5.磷酸缓冲液(pH6.8)洗3次，每次1ml，3min。6.用0.5ml0.2%考马斯亮蓝R250染色15min。7.蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。五、结果分析:描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。六、思考题1.细胞骨架主要有哪几类？主要成分是什么？2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？47 实验九细胞中DNA、RNA的显示I.DNA的细胞化学——Feulgen反应一、实验目的了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。二、实验原理DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。（二）材料洋葱鳞茎或根尖（三）试剂1.1N盐酸的配制取82.5ml比重1.19的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。2.Schiff试剂的配制及保存称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1NHCl，冷却至25℃时，加入0.5gNa2S2O547 （偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。3.亚硫酸水取200ml自来水，加10ml10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml1NHCl，三者于使用前混匀。四、方法与步骤1.将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1NHCl中，加热到60℃水解8～10min。2.蒸馏水水洗。3.Schiff试剂遮光染色30min。4.用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。5.水洗5min。6.将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。7.显微镜检查。结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。对照片：方法一，先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1—7制片观察。方法二，材料不经1NHCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤4—7制片观察。五、作业1.简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。2.绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。II.RNA的细胞化学——Brachet反应一、实验目的了解Brachet反应的原理，掌握有关的操作方法。二、实验原理甲基绿—派洛宁（Methyl47 green-Pyronin）为碱性染料，它能分别与细胞内的DNA、RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。三、实验仪器、材料和试剂（一）器材显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸（二）材料洋葱鳞茎表皮（三）试剂1．Unna试剂：甲基绿—派洛宁（Methylgreen-Pyronin）染色液甲液：5%派洛宁水溶液6ml2%甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液：1M醋酸缓冲液（pH=4.8）16ml甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时甲乙两液混匀。2．1M醋酸缓冲液（pH=4.8）配方A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml。B液：醋酸钠13.5g加蒸馏水100ml。取A液40ml+B液60ml混匀即为pH=4.8。配制注意事项：（1）Pyronin可加热助溶。（2）Methylgreen批号不同，染色效果差别很大。商品Methylgreen常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。四、方法与步骤1.用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上。2.滴一滴Unna试剂，染色30min。3.蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余的水分。4.盖上盖玻片，镜检。对照片：47 （1）撕取洋葱鳞茎内表皮，经5%三氯醋酸中90℃水浴处理15min。再经70%乙醇洗片刻，然后按步骤1-4制片观察。（2）撕取洋葱鳞茎内表皮，用0.1%RNA酶室温处理10～15min。蒸馏水洗，吸干，然后按步骤1-4制片观察。五、思考题1.简述Brachet反应的原理。2.绘图示细胞中RNA和DNA的分布。47 实验十：细胞培养的准备工作一、实验目的了解细胞培养常用实验仪器的使用方法，掌握细胞培养常用物品的洗消方法和无菌操作的要领。二、实验原理细胞培养是从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。细胞培养需要的基本条件包括：1、合适的细胞培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。2、优质血清：目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。3、无菌无毒细胞培养环境：无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。4、恒定的细胞生长温度：维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。5、合适的气体环境：气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。三、常用培养器皿及清洗细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。一、清洗：离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。（一）玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4个步骤。47 1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。2.刷洗：将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。3.浸酸：浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于6h，一般过夜或更长。放取器皿要小心。4.冲洗：刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。（二）橡胶制品清洗新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/LNaOH煮沸15min，流水冲洗，0.5mol/LHCl煮沸15min，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20min，50℃烤干备用。（三）塑料制品的清洗塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗3次，双蒸水泡24h，晾干备用。（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。四、消毒微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因（一）物理消毒法47 1.紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2m的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3h，期间可间隔30min。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5m照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5m，照射时间30min为宜。紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。2.高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。3.高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。4.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。47 可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。五、细胞培养常用试剂配置1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2、PBS(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。3、胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。47 4、RPMI1640：溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。5、血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。47 实验十一：原代细胞培养实验一、实验目的：掌握无菌操作技术和倒置显微镜的使用；了解小鼠解剖操作技术和原代细胞培养的一般方法与步骤。二、实验原理：原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。三、实验仪器、材料和试剂动物的选择：选择大约10－13天龄胚胎的小鼠，此时的胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。实验材料：每组的超净台中有以下物品：1.5ml配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS1瓶2.100ml灭菌烧杯2个；3、50ml离心筒2个4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个4、1ml，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个5、细胞计数板1块；6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；7、酒精灯1台；47 四、方法与步骤1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)a．采用认可的方案处死动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌青霉素瓶中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎中加入2－3ml0.25％的无菌胰蛋白酶,37°C培养箱中轻轻摇动30分钟。4)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌的离心管中，充分吹打。5）静置2min，吸上清接种至培养瓶中。6)补足培养基，37°C培养箱中培养。7）4h后可观察细胞贴壁生长状况。8）第二天更换培养液。a．到掉培养基。b．PBS洗三遍。c．加入4ml新鲜培养液，37°C培养箱中培养3－7天，细胞互相重叠爬满整个培养瓶底部即可传代。五、实验结果与分析大多数细胞贴壁生长后呈梭形六、思考题：1.为什么要用发育早期的胚胎？47 2.培养的梭形细胞为哪种类型？还有什么类型的细胞存在？七、注意事项:1.注意操作过程中保证无菌操作。2.绞碎胚胎时尽量绞碎。附图：小鼠胚胎的分离A:打开腹腔；B：取出胚胎；C：去掉胚胎外膜；D：绞碎胚胎47 实验十二：细胞的传代培养一、实验目的熟练掌握细胞的传代培养法。二、实验原理传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。三、仪器、材料与试剂材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks液。仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。四、实验方法与步骤1.人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。4．打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。47 5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7．倒掉培养细胞的旧培养液。8．PBS洗3次。培养瓶加入3－5滴胰酶，盖好瓶盖后室温消化。9．在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶。9．加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。五、思考题：1．细胞传代培养的目的是什么?2．如何保证在传代过程中不被微生物污染?3．贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同?4．如何估计是否传代和传代的方式?六、注意事项：1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。2．经常观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞。47 47