生物物理技术提纲

一、生物大分子结构(一)蛋白质1.氨基酸：α-氨基酸，L型（除甘氨酸）2.肽键：一个氨基酸羧基和另一个氨基酸氨基脱水缩合形成的化学键1)性质：C-N键不能旋转；肽键平面（p-π共轭）2)肽平面：多肽链折叠为肽链主骨架的基本单元，包括两个碳原子和中间的一个肽键3.结构层次：1)一级结构：氨基酸序列2)高级结构：a)成因：肽平面；R基团空间位阻；规律性折叠；稳定高级结构作用力b)二级结构：多肽链借助氢键延一定方向排列成的具有周期性和规律性的结构单元i.α-螺旋（3.6aa/圈、r=0.23nm、螺距0.54nm、右手螺旋）；β-折叠；β-转角；无规卷曲）ii.稳定力：氢键c)超二级结构：两个或两个以上的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列为规则的，具有空间结构特征的组合体i.稳定力：氢键，范德华力，离子键，疏水作用力d)结构域：具有功能的单元，介于超二级结构与三级结构之间e)三级结构：一条多肽链所有原子的空间排布（疏水内核）f)四级结构：多条多肽链特点方式组装而成g)结构是功能的基础(二)核酸1.生物信息流与中心法则2.DNA1)作用力：碱基配对；碱基堆积；疏水作用；减小静电排斥3.核酸结构分级1)一级结构：核苷酸序列2)二级结构：核酸双链3)三级结构：超螺旋/其他高级结构4.RNA：易水解二、生物大分子内作用力(一)四种相互作用：引力；电磁；强；弱(二)蛋白质1.强相互作用：共价键（一级结构；二硫键烫发）2.弱相互作用：离子键；氢键（方向性；排他性）；疏水作用（熵增驱动）；范德华力(三)核酸1.染色体结构：1)40%DNA，60%蛋白2)组蛋白高度保守；修饰作用3)核小体：缠绕146bp4)高级结构：30nm纤维 1.RNA1)单链核酸（紧凑结构；碱基互补；茎-环结构）2)tRNA（两条A螺旋呈直角；非常规：特殊碱基对、三碱基对、碱基-骨架作用）3)形成高级结构要素：2‘-OH；单链；多种二级；三级包括碱-碱与碱-骨二、生物大分子间相互作用(一)蛋白-核酸复合物1.功能：结构（组蛋白）；调节（转录因子）；催化（聚合酶）2.作用：静电（蛋白-磷酸骨架）；氢键（蛋白-链/碱）；疏水（蛋白疏水-碱基）3.特异性识别：核酸内切酶；大沟4.识别结构域：1)HTH：a)结构特点：20aa；两α之间120°；第二α为识别螺旋b)序列特点：疏水核心；9thaa多为Gly；shs转角；phs（极疏小）1stαc)识别：回文DNAd)Rep：i.氢键定位；ii.识别螺旋与DNA特异性作用；iii.DNA形变有助于蛋白紧密结合与亲和特异性2)ZincFingera)锌指结构i.含一个或多个被Cys或His螯合的锌离子ii.锌离子稳定蛋白三维结构iii.结合DNA，转录因子功能，结合RNA/蛋白iv.多种结构模式b)锌指蛋白i.α螺旋与DNA大沟结合ii.单个锌指结合DNA无特异性iii.连续锌指特异性结合DNA，增强与DNA亲和力iv.含有2-37个锌指c)一对一相互作用i.单一锌指识别DNA中连续3个碱基ii.两相邻锌指识别6-7个碱基iii.不同aa组别识别特定序列3)Leucinezippera)特点i.30aa，Leu每7个aa出现一次ii.两α螺旋平行结构iii.coiled-coil结构，3.5aa/圈，准确每两圈一次Leuiv.Leu间相互作用，形成疏水核心b)与DNA作用i.碱性区域与DNA大沟作用ii.特异性作用：氢键；疏水iii.非特作用：氢键 1)HLH2)二聚现象(二)基因编辑1.定义：有目的性的对DNA核酸序列进行删除插入等操作2.传统方法：人工诱变；转化/转染；同源重组3.第一代技术：ZFN4.第二代技术：TALENs5.CRISPR/Cas9：成簇的、规律间隔的短回文序列二、蛋白质折叠(一)简介1.定义：蛋白质凭借相互作用在特定细胞环境下自我组装，形成有一定功能的结构过程2.Anfisen实验：1954；蛋白高级结构由一级结构决定；加入巯基乙醇，尿素再还原3.蛋白质折叠速率：？4.蛋白折叠问题：规律、稳定性、生物活性；热力学/动力学、体内/体外、理论/实验(二)第二遗传密码（第一问题：物理密码）1.定义：氨基酸序列与空间结构对应关系2.特点：1)简并性a)不同生物体内同功能蛋白质有aa差异，整体结构相同b)化学修饰影响侧链不影响总体c)定点突变说明个别甚至一段序列的替换不影响构象，生物活性2)多意性：同序列aa不同条件下空间结构不同3)全局性：3.意义：完善中心法则；蛋白质设计需要；理解蛋白质折叠疾病需要(三)折叠过程（第二问题：折叠动力）（未解之谜）1.框架模型（1982，P.S.Kim/R.L.Baldwin）一步步折叠，局部构象依赖于局部序列2.疏水塌缩模型：疏水片段先聚集3.扩散-碰撞-粘合机制：几个位点生成疏水簇，非特布朗运动扩碰粘成大结构4.成核-凝聚-生长模型：折叠晶核（特异性相互作用）扩大5.拼版模型：多条途径折叠；折叠快；影响小6.邹氏模型：边翻译边折叠，从一端开始(四)蛋白质结构预测1.CASP2.同源建模/片段拼接(五)体内折叠：蛋白质浓度极高(六)分子伴侣1.定义：保守蛋白质，识别肽链非天然构象，促进各功能域和整体的正确折叠2.为非自发折叠蛋白提供微环境(七)蛋白折叠病：疯牛病，库鲁病三、生物大分子其他物理性质 (一)蛋白质1.胶体性质：扩散慢，粘度大，不透半透膜；水溶液中形成亲水颗粒，丁达尔现象2.蛋白质分子表面：胶核，胶粒（吸附层），胶团（扩散层）3.表面电势：PI取决于氨基酸与蛋白质三维结构4.盐溶，盐析二、分子生物物理技术(一)分离蛋白1.层析1)凝胶排阻层析（分子筛层析）：洗脱体积Ve=外水体积Vo+分配系数Kd*内水体积Vi2)离子交换层析3)疏水层析2.蛋白质电泳1)SDS-PAGE：浓缩胶原理，分子筛效应2)等电电泳3.结晶1)盐析2)气相扩散法(二)性质测定1.分子量：动态光散射2.热稳定性：Thermofluor(三)SPR（表面等离子体共振技术）1)等离子体：a)定义：密度相当高的自由正负电荷组成的气体b)金属=等离子体c)等离子体波：i.特征：高度局域消逝波；衰减传播；色散曲线在光右侧，同频率波矢量大于光ii.条件：存在表面等离子体；存在合适激发源；激发条件d)表面等离子体振动2)全反射a)定义：光从光密介质射入光疏介质，入射角到某一角度使折射角到90°，折射光消失，只剩下反射光b)消失波：全反射透入光疏介质一个波长深度c)衰减全内反射3)棱镜耦合：a)Kretschmann结构，otto结构b)共振角4)传感器a)原理：改变θ/λ，得介电常数εs/折射率nsb)Biacore传感器c)应用：识别生物分子；研究生物分子间作用5)优点 a)无需标记待测物b)适用于浑浊，不透明或有色溶液c)实时连续监视反应的动态过程d)检测方便快捷e)应用范围广2)局限a)难以区别非特异性吸附b)对温度，样品组成等干扰敏感3)发展a)提高灵敏度b)与质谱联用c)高通量检测d)敏感器件、测量装置微型化(二)X射线衍射1.X射线的发现与性质1)发现a)时间：1895.11.8b)人物：伦琴c)实验：稀薄气体-X射线d)地位：19世纪末20世纪初物理学三大发现之一；标志着现代物理学的产生e)荣誉：第一届诺贝尔物理学奖2)探索：偏振：巴克拉（1905、1909）；衍射：劳厄（1912）3)衍射：原子间距与X射线波长同数量级4)电磁波特性：波长：0.01-100埃5)发生步骤：高速电子轰击阳极靶；同步辐射光源6)特性：a)物理：穿透；荧光；电离；热b)化学：感光；着色c)生物：细胞抑制，损坏，坏死i.确定性效应：不孕，功能障碍ii.随机性效应：肿瘤，遗传效应7)质与量a)质（硬度）：X射线穿透物体的能力：单个光子能量b)量：垂直X光束单位时间单位面积通过光子数2.X的吸收与医学成像1)X吸收：人体不同组织衰减系数与厚度差别2)人体切片——断层扫描CTa)提出方法：科马克，美国，1963b)制作成功：菲尔德，英国，19723)CT原理a)联立方程法（代数法求解）：i.常采用的有256×256、512×512等矩阵ii.本质：求解衰减系数的分布 a)反投影法i.Randon定理：多方向投影重叠2)螺旋CT2.X射线晶体衍射1)X射线与物质相互作用：a)散射X射线：相干；非相干b)电子：反冲电子；俄歇电子；光电子c)荧光X射线d)衰减X射线e)热能2)X射线晶体衍射的出现：1912，小布拉格3)X射线的相干散射和衍射4)X射线晶体衍射的实验装置：X射线→晶体→探测器5)布拉格方程：2dsinθ=nλa)晶平面的衍射：晶平面的衍射＋晶胞内的衍射＋不同晶胞的衍射b)晶胞参数：晶胞的大小和形状，决定晶体的衍射方向，而原子在晶胞中的位置，则决定衍射光的强度c)解析大分子晶体结构的本质是获得电子(二)冷冻电子显微镜1.应用1)细胞超微结构成像2)电子断层三维现象：巨大分子，细胞器3)蛋白质电子晶体学：膜蛋白4)单颗粒三维重构学：大分子蛋白2.流程：制备样品；透射成像；图像处理；结构解析3.三维重构技术：1)衬度传递函数；中央截面定律2)多角度二维投影→傅里叶转换→三维傅里叶空间→三维重构4.断层扫描：1)随扫描角度增加清晰5.单颗粒冷冻电镜：1)电子/颗粒相互作用：a)入射电子散射；b)入射电子对固体的激发c)受激发电子在固体中的传播2)信噪比随次数提高(三)NMR1.历史1)X射线晶体学获得蛋白，1963；NMR获得蛋白，19852)发展史a)1952年Bloch和Purcell获得诺贝尔物理学奖（核磁共振观测方法）b)1992年Ernst获得诺贝尔化学奖（高分辨脉冲傅立叶变换核磁共振方法）c)2002年Wuthrich获得诺贝尔化学奖（核磁共振解析生物大分子结构） a)2003年Mansfield和Lauterbur获得诺贝尔生理与医学奖（核磁共振成像）2.原理：1)定义：自旋不为零的原子核，在外磁场的作用下核自旋能级发生赛曼分裂，共振吸收特定频率的射频辐射的物理过程2)条件：磁性核；静磁场；射频场；检测线圈a)质量数与原子序数均为偶数的原子没有NMR信号b)原子核自旋、原子核的磁矩c)分裂：分裂为2I+l种能态d)吸收：射频辐射能量达到△E3.仪器1)静磁场：a)MHz：1H在该静磁场下的共振频率b)超导磁体2)检测线圈：检测FID4.参数1)化学位移2)标量耦合：两磁性核通过核外电子发生的相互作用，大小为耦合常数3)NOE（核增强效应）：a)空间上相近的两个原子核，一个原子核饱和时，另一个信号增强b)增强程度与距离有关，可确定两原子核距离c)解析最主要的结构信息4)弛豫：激发的原子核和环境能量交换回到平衡态（FID/自由感应衰减信号）5.傅里叶变换：可以把FID时间信号转化为频率信号6.自动化结构计算方法(二)荧光1.原理：某些物质被一定波长光长光照射时，会被较短时间内发射比入射波长更长的光，成为荧光2.基态与激发态：激活/失活3.电子能级：1)激发（S0→S1/S2）（单重态）2)荧光（S1→S0）3)外转换（熄灭）4)磷光（T1→S0）5)振动弛豫4.磷光、荧光1)荧光：发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长2)磷光：发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间5.产生条件：1)吸收光子发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量小于断裂其最弱的化学键所需要的能量2)结构中有荧光基团（含有不饱和键的基团）6.荧光与分子结构关系1)荧光助色团与荧光消色团 1)增加稠合环可增强荧光2)提高分子的刚性可增强荧光3)激发态电子组态的影响4)重原子将导致荧光量子产率的降低2.荧光应用举例：1)萤光素酶报告基因：a)萤光素的氧化产生荧光i.萤光素酶：单体，61000ii.辅-底物：ATP，Mg2+iii.萤光素b)原理：i.构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒ii.将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系iii.加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用2)GFPa)发现i.1962年下村修从水母中分离出GFP，并发现这种蛋白质在紫外光下呈亮绿色ii.马丁·沙尔菲向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用iii.钱永健完成的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强，另外还利用GFP来追踪追踪多种生物细胞进行的生物反应b)优点i.不加任何底物，荧光性质稳定ii.分子量小，无细胞毒性iii.活细胞实时定位观察iv.突变蛋白改变荧光特性3)FRET（荧光共振能量转移）a)条件i.供体发射光谱与受体吸收光谱重叠ii.供体、受体荧光生色团适当方式排列iii.供体、受体足够接近b)举例：CFP（青色荧光蛋白）/YFP（黄色荧光蛋白）c)应用：检测蛋白质之间相互作用i.蛋白分子共定位ii.蛋白分子聚合体iii.转录机制iv.转换途径v.分子运动 i.蛋白折叠2)荧光显微镜a)分类：透射式/落射式3)激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）