高级生化试验-南京农业大学生物化学试验基本原理及主要实验

目录第一部分生物化学技术概论1.实验记录和实验报告的书写…………………………………………………2.普通实验技术…………………………………………………………………3.实验样品的制备………………………………………………………………4.离心分离技术原理及使用方法………………………………………………5.电泳原理………………………………………………………………………6.分光分析原理…………………………………………………………………7.层析分离原理…………………………………………………………………8.实验室规则…………………………………………………………………第二部分生物化学基本实验实验一维生素C的定量测定…………………………………………………实验二考马氏亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量…………………………实验三蛋白质紫外分光测定法……………………………………………实验四血清脂蛋白琼脂糖电泳………………………………………………实验五血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳……………………………………实验六血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳……………………………………实验七pH对唾液淀粉反应速度的影响………………………………………实验八碱性磷酸米氏常数的测定……………………………………………实验九改良Mohun法测定血清谷-丙转氨酶活性…………………………实验十氨基转移作用…………………………………………………………实验十一离子交换层析分离混合氨基酸……………………………………实验十二胡萝卜素的柱层析分离……………………………………………第三部分生物化学综合实验实验十三脲酶凝胶过滤分离……………………………………………………实验十四血清蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳………………………实验十五质粒DNA的微量快速提取…………………………………………实验十六多聚酶链式反应（PCR）技术………………………………………实验十七蛋白质印迹分析（WesternBlot）……………………………………实验十八碱性磷酸酶比活性测定………………………………………………实验十九四唑盐比色法（MTT）法………………………………………………实验二十核酸的提取、定量测定………………………………………………实验二十一肝糖原提取与鉴定…………………………………………………… 本部分的内容为生物化学实验中所涉及的主要原理。介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验寻林的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤，洗液的配制，吸量管的使用、混匀的方法以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分离技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。一.实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生科学思维、分析判断和解决实际问题的能力。也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，培养科学态度的重要环节。（一）实验记录记录实验中观察到的现象、结果和数据，及时地记录在激烈路本上。原始数据必须准确简练、详尽、清楚。记录时不能夹杂主观因素，在定量实验中观测的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光密度值等，都应设计一定的表格，依据仪器的精确度记录有效数字。完整的实验记录包括实验日期、实验题目、目的、操作、结果。（二）实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：1.实验名称（Thetitleofexperiment）：2.目的（Objective）：3.原理（Principle）：最好使用简式。4.操作步骤（Operationalprocedure）：5.实验记录6.计算与结果（CalculationandResults）：7.讨论（Discussion）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。操作者姓名，实验日期。二、普通实验技术（一）玻璃仪器的洗涤与清洁玻璃仪器的洗涤与清洁直接影响实验结果的准确性，因此玻璃仪器的洗涤工作是很重要的1.新购置玻璃仪器的清洗新购置来的玻璃仪器表面附着有游离碱质，应先用肥皂水洗刷后再用流水冲洗，浸泡于I－2％HCl中过夜，取出后再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2－3次，在干燥箱中烤干或自然晾干，备用。2.使用过的玻璃仪器的洗涤·（1）一般玻璃仪器：烧杯、三角烧杯、试剂瓶、试管等，可先用洗衣粉或肥皂水刷洗，将器皿内外壁细心地刷洗，使其尽量多地产生泡沫，然后再用自来水洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗2－3次，晾干备用。（2）容量仪器：吸量管、容量瓶、滴定管等在使用后立即用清水冲洗，勿使粘污物质干涸，并及时用流水或洗衣粉水尽量洗涤，稍干后有铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗，将洗液完全洗去，最后用蒸馏水冲洗2—3次，晾干备用。 （3）比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净，如不干净时可用HCl或适当溶剂冲洗（避免用较强的碱液或强氧化剂清洗），再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷或粗糙的布或纸擦洗，以保护比色杯透光性，冲洗后倒置晾干备用。（二）清洗液的原理与配制1.肥皂水，洗衣粉溶液和去污粉：是常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。2.铬酸洗液（1）原理：铬酸洗液由重铬酸钾（或重铬酸钠）和浓硫酸配制而成,其清洁效力主要应用其强氧化性和强酸性。K2Cr2O7+H2SO4→H2Cr2O7+K2SO4↓2CrO3(铬酐，红色)+H2O↓Cr2O3（绿色）+3（O）H2SO4→H2O+SO2+（O）铬酐越多硫酸越浓，其清洁效力也就越强，当洗液变绿色后则不宜应用。洗液的配制：称取重铬酸钾5g放于250ml烧杯中，加热水5ml搅拌，使其尽量溶解，烧杯下垫一一石棉网以防过热，然后慢慢加入工业用浓硫酸100ml随加随搅拌，尽量避免红色铬酐沉淀析出。此时洗液由红黄色转为黑褐色，冷却后储存于指定容器内，盖紧以防吸水，贴上标签（洗液变绿后不宜使用）。3．使用：使用洗液前需将玻璃仪器用自来水冲洗数次，并将仪器上的水分尽量除去再放洗液中浸泡，数小时后取出仪器，用自来水充分清洗至无水分为止，冲洗时注意勿将洗液溅出水槽，再用少量蒸馏水冲洗数次，晾干备用。上述两种洗液时常用的，实验中遇到特殊污染物，需用针对性强的洗涤液。（三）量器类的使用法量器是指对液体体积进行计量的玻璃器皿，如滴定管、移液管、容量瓶、量筒、刻度吸量管、刻度离心管及自动加液管等。l.滴定管：滴定管分常量与微量滴定管。常量滴定管又分为酸式与碱式两种，各有白色、棕色之分。酸式滴定管用于盛装酸性、氧化性以及盐类的稀溶液。碱式滴定管用来盛装碱性溶液。棕色滴定管用于盛装见光易分解的溶液。常量滴定管的容积有20、25、50、100毫升四种规格。微量滴定管分为一般微量滴定管和自动微量滴定管，容积为5、10g升等规格，刻度精度因规格不同而异。滴定管主要用于容量分析。它能准确读取试液用量，操作比较方便。一般是左手握塞，右手持瓶；左手滴液体，右手摇动。在滴定台上衬以白纸或者白磁板，以便观察锥形瓶内的颜色。滴定速度以10ml/min，即每秒3～4滴为宜。接近终点时，滴速要慢。甚至每秒半滴或l／4滴地进行滴定，以免过量。达到终点后稍停l～2分钟，等待内壁挂有的溶液完全流下时再读取刻度数。正确读取容积刻度是减少容量分析实验误差的重要措施。滴定管的读数方法，可依个人的习惯而不同。但是在同一实验中读取容积刻度时，必须以液面的同一特征标志为准，以保证其系统误差。一般读数方法∶普通滴定管读取数据，双眼与液面同水平读数。有色液读取数据是溶液弯月面两侧最高点连线与刻度线重合点°无色液读取数据是溶液弯月面最低点水平线与刻度线重合点。2．吸量管 可淮确地量取溶液的体积。（1）分类：常用分三类：①奥氏吸量管：供推确量取0．5毫升、l毫升、2毫升液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放液时必须吹出量后残留在吸量管尖端的液体，主要用于量取粘滞系数大的液体。②移液管：供推确量取5毫升、10毫升、25毫升等较多体积液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放出液体流毕后，将吸量管尖在容器内壁上继续停留15秒，注意不要吹出尖端最后的部分。③刻度吸量管：供量取10毫升以下任意体积的液体时用。分全流出式与不完全流出式。全流出式：一般包括尖端部分，欲将所量取液体全部放出时，须将残留管尖的液体吹出。此类吸量管的上端常标有吹字。不完全流出式：若吸量管上端未标有吹字样，则残留管尖的液体不必吹出o其刻度不包括吸量管的最后一部分。（2）吸量管的使用①选择：使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量。临用前要看清容量和刻度。②执管：用拇指和中指（辅以无名指），持吸量管上部，用食指堵住上口并控制液体流速，刻度数字要对向自己。③取液：用另一只手捏压橡皮球，将吸量管插入液体内（不得悬空，以免液体吸入球内），用橡皮球将液体吸至最高刻度上端l～2cm处，然后迅速用食指按紧管上口，使液体不致于从管下口流出。④调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体（如：全血、血清、血浆）时；先用滤纸擦干管尖外壁，然后用食指控制液体缓慢下降至所需刻度（此时液体凹面，视线和刻度应在同一水面上），并立即按紧吸量管上口o⑤放液：放松食指，使液体自然流入受器内。放液时，管尖最好接触受器内壁。但不要插入受器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。⑥洗涤：吸血液、血清等粘稠液体及标本（尿液）的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净。吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后再冲洗。冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。3.容量瓶用于配制一定浓度标准溶液或试样溶液。颈上刻有标线，表示在20℃，溶液装至标线的容积。有10、25、50、100、250、500、1000、2000毫升几种规格，并有白色、棕色两种颜色。使用方法：使用前应先检查容量瓶的瓶塞是否漏水，瓶塞应系在瓶颈上，不得任意更换。瓶内壁不得挂有水珠，所称量的任何固体物质都必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后，才能转移到容量瓶中。4.量筒量简是用来量取要求不太严格的溶液体积的。在配制要求不太准确的溶液浓度时，使用量筒比较方便。它有从5～2000ml十余种规格。用量筒量取液体体积是一种粗略的计量法，所以，在使用中必须选用合适规格，不要用大量筒计量小体积，也不要用小量筒多次量取大体积的溶液。读取刻度的方法与容量瓶和滴定管相同。（四）一般操作法1.溶液的混匀 样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染，严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。溶液稀释时也须混匀。混匀的方法通常有以下几种：⑴搅动混匀法：适用于烧杯内溶液的混匀。如固体试剂的溶解和混匀。搅拌使用的玻璃棒必须两头都圆滑，棒的粗、细、长、短必须与容器的大小和所配制的溶液的多少呈适当的比例关系。搅拌时必须使搅棒沿着器壁运动，以免搅入空气或使溶液溅出。倾入液体时必须沿着器壁慢慢倾入，以免产生大量气体，倾倒表面张力低的液体更要缓慢仔细。研磨配制胶体溶液时，搅棒沿着研体的一个方向进行，不要来回研磨。⑵旋转混匀法：适用于锥形瓶；大试管内溶液的混匀。手持容器使溶液作离心旋转．以手腕，肘或肩作轴旋转。⑶指弹混匀法：适用于离心管或小试管内溶液的混匀。左手持试管上端，用右手指轻轻弹动试管下部，或用一只手的大拇指和食指持管的上端，用其余三个手指弹动离心管，使管内的液体作旋涡运动⑷振荡混匀法：适用振荡器使多个试管同时混匀，或试管置于试管架上，双手持管架轻轻振荡，达到混匀的目的。⑸倒转混匀法：适用于有塞量筒和容量瓶及试管内容物的混匀。⑹吸量管混匀法：用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液混匀。⑺甩动混匀法：右手持试管上都，轻轻甩动振荡即可混匀。⑻电磁搅拌混匀法：在电磁搅拌机上放上烧杯，在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的。适用于酸碱自动滴定，pH梯度滴定等。2.过滤法是分离沉淀和滤液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。可用漏斗及滤纸或吸滤法。操作时应注意以下几点：⑴制备血滤液等实验时，要用干滤纸而不能用水把滤纸先弄湿，因为湿滤纸会影晌血液稀释的体积。⑵折叠滤纸的角度应与漏斗相合，使滤纸上缘能与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。—般采用平折法（即对折后再对折）。⑶向漏斗中加溶液时，使其沿玻璃棒慢慢流下；玻璃棒不能在漏斗中搅动。倒入速度不要太快，以防损失，不得使液面超过滤纸上缘。⑷较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时也可用离心沉淀法代替过滤法。3.加热法可直接用火（电炉）或水浴加热，使用水浴时防止浴中容器倾倒。酒精灯使用注意：①禁止头碰头点燃。②用过后先用盖子盖一下，灭后再拿下重盖，防止形成真空，盖子打不开。③加热时管口不要对着人。④加热时管夹夹住试管的上l／3部分，均匀加热，再固定管底加热。4.烤干法烤干试管时，应将管口向下倾斜约成45°角，由上往下，先烤管底，最后将管口的水份烤干。烤干时须经常移动以免炸裂。试管等普通玻璃器材，也可在烘箱内烘烤干。三、实验样品的制备在生物化学实验中，无论分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握此种实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。在基础生物化学实验中，最常用的实验样品是人或动物的血、尿和组织等。现将动物或人的这些样品制备的方法扼要介绍如下： （一）血液样品收集动物或人的血液样品时应使用清洁干燥的容器以防止溶血。1.全血取出血液后，迅速盛于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混匀，以免血液凝固。取得的全血如不立即进行实验，应储存于4℃冰箱中。常用的抗凝剂草酸盐（1~2mg/ml全血）、柠檬酸盐（5mg/ml全血）、氟化钠（5~10mg/ml全血）、肝素（0.01~0.2mg/ml全血）。可将抗凝剂配成适度的水溶液，按需要量加入试管中，并涂布于试管壁，横放烘干备用。2.血浆将上述抗凝之全血在离心机中离心，白细胞下沉，上清液既为血浆。分离血浆时必须严格控制溶血，除采血时一切用具都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。3.血清收集的血液不加抗凝剂，在室温下约5~20分钟即自行凝固，通常经3小时，血块收缩而分离出血清。血块收缩后，应及早分离出血清，一面溶血。若血块粘着容器壁过紧，血清不易分离出来，可用细玻璃棒轻轻剥离，将血液离心，可分离的较快、较多。4.无蛋白血滤液分析血液中某些成分时，为了避免蛋白质的干扰，需预先除去血中的蛋白质成分。常用三氯醋酸、钨酸或氢氧化锌等沉淀剂与蛋白质作用，然后用过滤或离心方法制成无蛋白血滤液。（二）尿液样品一般定性实验样品可以用随时收集的新鲜尿液。定量测定尿液中各种成分时应收集24小时的尿液，混合后再取样。收集方法：一般在早晨一定时间排出残余尿弃去，以后每次尿液收集于清洁大玻璃瓶中，到第二天同一时间收集最后一次尿即可。把收集地4小时尿液充分混合后用量筒量准起总体积，然后取样分析。收集的尿液不能立即进行实验，则应置于冷处保存。必要时收集尿瓶中预先放入防腐剂，通常甲苯约10ml/L尿或浓硫酸10ml/L尿。收集实验动物的尿液时，可将动物置于代谢笼中，按以上方法通过笼下的漏斗收集动物24小时的尿液。（三）组织样品在生物化学实验中，常常利用离体组织研究各种物质代谢的突击功能与酶系的作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。因此，利用离体组织作为提取材料或代谢研究材料时应在冰冷条件下迅速取出所需要的组织，并尽快进行提取或测定。1.组织糜将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机绞成糜状即可。2.组织匀浆向剪碎的新鲜组织中加入适量的冰冷的匀浆制备液，用高速电动匀浆机或玻璃匀浆器制成匀浆。3.组织浸出液将上述制成的组织匀浆加以离心，其上清液即为组织浸出液。四、离心分离原理（一）原理离心机是利用离心力把溶液中的粒子进行分离的一种仪器。所谓离心力是指物体作圆周运动时形成的一种使物体脱离圆周运动中心的力。离心力的单位为g，即重力加速度（980.6cm/S2），离心力的大小可根据离心时的旋转速度（r/min，每分钟转速）和物体离旋轴中心的距离r（cm）按下式计算：g=r×V2×1.118×10-5或按下式计算所需要的转速V=[（g×89445）/r]-2 制备离心几乎包括两种方法：一是分级离心法，另一种是密度梯度离心法。（二）分类1.分级离心法：非均一的粒子悬浮液在离心机中离心时，各种粒子以各自的沉降速度移向离心管底部，逐步字底部形成一层沉淀物质。这层沉淀物质含有各种组分，但是最多的是那些沉降得最快的组分。为了分出某一些特定的组分，通常需要进行一系列离心。通常先选择一个离心速度和离心时间，进行第一次利息，使大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时需要的组分大部分仍留在上清液内。然后将收集到的上清液用更高的转速离心，把需要的粒子沉积下来。离心时间要选择得当，使大部分不需要的小粒子仍留在上清液中。倾去上清液，再把沉淀悬浮起来，用较低转速离心。如此反复直至达到所需纯度。2.密度梯度离心法密度梯度离心法具有很好的分辨能力。可同时使样品中几个或全部组分分离。将样品粒子在一个密度梯度介质中离心，这个介质由一合适的小分子和样品粒子可在其中悬浮的溶剂组成。离心时离轴心愈远介质密度愈大。（三）电动离心机的使用方法欲使沉淀和母液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠，或颗粒过小能通过滤纸、总容量太少又需要定量测定时，使用离心沉淀法比过滤法要好。使用方法：1.应先将离心机放在稳定的台面上，放平、放稳，检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能。2．检查套管与离心管大小是否相配，离心管应能在套管内自由转动不至太紧，套管软垫（用棉花或橡皮）是否铺好。套管底部是否有碎玻璃片或漏孔（玻璃片必须取出，漏孔经修补好后才能使用）。3．检查合格后，将一对离心管分别放入一对套管中，然后连同套管一起分别置粗天平两侧，使两侧的总重量平衡（包括离心管、离心套管、离心管内装溶液的重量的总和），用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对已平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的管必须放在对称位置，严禁在对称两侧离心管套中，仅一侧放置离心管。离心时离心机内不得留有离心管套。4．将离心管放要后，应先盖好离心机盖，检查所需电源电压的大小，再按要求将电源接通。打通电源开关，逐步旋转转速旋钮，速度调节应缓慢，增加离心机转速直至所需的转速。5．离心机转动时，如果机身不稳或声音不均匀时，应立即停止离心，重新检查重量是否对称和离心机是否放平稳。离心时，玻璃管、套管打碎应立即清除，重新配平后再离心。6．离心达规定时间后，将转速旋钮逐步回转到零。再关闭电源。不可以用手强制使其停止转动，因这样既损伤离心机，同时沉淀又可能被搅动浮起，待离心机停稳后，取出离心管及管套，最后将电源插头拨下。注意事项：在配平时，勿使离心管套外部沾水，否则会影响结果。五、电泳原理（一）电泳的基本原理带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。许多生物分孑都带有电荷，其电荷多少取决于分孑性质及其所合在介质的pH和组戍，由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量、颗粒形状的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 设一带电分子在电场中所受的力为F，F的大小取决于质点所带电荷Q和电场强度X，即F＝Q·X根据Stoke氏定律，一球形的分子运动时受的阻力F’与分子运动的速度V、分子的半径r、介质的粘度η的关系为F＇＝6πrην当F=F′时，即达到动态平衡时：Qx=6πrην移项得v／x＝Q／6πrην(1)当v／x表示带电分子在单位电场强度下运劫速度，移为迁移率，也称为电泳速度，以v表示，即v＝v／x＝Q／6πrην（2）由式（2）可见，一个带电分子的迁移率不仅取诀于其本身所带的电荷，而且还与电场强度介质的pH、禹子强度、粘度、电渗等因素有关。在具体实验中，移动速度v为单位时内t（以秒计）内移动的距离d（以cm计），即V＝d/t又电场强度Ⅹ为单位距离I（以cm计）内电势差E（以伏待计），即以v＝d／t，X＝E／I代入（2）式即得v=v／x=（d／t）／（E/I）＝dI／Et故迁移率的单位为cm2.秒1伏待ˉ1。物质（A）在电场中移动的距离为：dA＝VAEt／I物质（B）在电场中移动的距离为：dB=VBEt/I两物质移动的距离之差为△d＝dA-dB＝（VA-VB）Et（3）（3）式表明物质A、B能否分离取诀于两者的迂移率，如相同则不能分离；如有差别则能分离。实验所选择的条件如电压和电泳时间与两物质的分离成正比；电场距离如滤纸与离距离成反比。（二）影响电泳的主要因素1.电泳介质的pH当介质等于其两性物质的等电点时，该物质处于等电状态即不向正极或负极移动。当保质pH小于其等电点时，则呈正离子状态移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离孑状态，移向正极。因此，任何一种两性物质均受介质pH的影晌，即诀定两性物质的带电状态及其量，为了倮持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液。2.缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰，如离子强度低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量（压缩双电层）使电泳速度减慢。所以常用离子强度为0．02～0.2之间。溶液离子强度的计算I＝l／2ΣCiZi2I表示离子强度Ci为克分子浓度（指离子而言）Zi表示离子的价数。3.电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。电场强度越高，则带电粒子的移动越快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白变性而不能分离。4.电渗作用在电场中液体对于固体支持物的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响。如果纸上电泳蛋白移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如果电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距禹等于二者相加。电渗现象所适成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糈点在支持物的中问。观察电渗方向和距离。1.其它因素例如滤纸、缓冲溶液的粘度以及电泳时的温度变化等因素也都影响泳动速度。（三）区带电泳分类 按支持物物理性状不同，可分为：l．滤纸及其他纤维素膜。如乙酸纤维素膜，玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。2．粉末电泳如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳o3．凝胶电泳如琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺电泳。4.丝线电泳知尼龙丝、人造丝电泳°按支持物的装置形式不同，可分为：I．平板式电泳，支持物水平置，是最常见的电泳方式。2．垂直板式电泳。3．连缓一流动电泳，首先应用于纸电泳将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品白顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质，以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。按pH的连续性不同，可分为：l.连续pH电泳电泳的全部过程中缓冲液的pH保持不变，如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。2．非连续pH电泳缓冲液和支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳，等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可对极微量物质（ng即10ˉ9g）迸行分离。（四）电泳技术的应用。电泳技术是目前医学研究的重要手段。它可分离各种有机物（氨基酸、多肽、蛋白质、酶、酯类、核苷、核酸等）和无机盐。并可用于某种物质的纯度及分子量的测定。电泳技术与层析技术结合和指纹图可用于蛋白质结构的分析。现免疫结合的免疫电泳，提高了对蛋白质的鉴别能力。与酶方法结合发现了同功酶。电泳技术是目前应用极广的分离物质的一种很好方法。也是医学科学中的重要研究技术。六、分光分析原理分光分析原理许多物质的溶液是具有颜色的，如高锰酸钾显紫红色，硫酸铜溶液显蓝色，这些溶液的颜色深浅是和溶液的浓度有关。在一定浓度范围内溶液的浓度越大，表现为溶液的颜色越深，因此，可以用比较溶液颜色的深浅来测定所含有色物质的含量，这种方法称力比色分析法，简称比色法。光是一种电磁波，具有一定的波长范围。波长在400～700nm范圈内的电磁波为可见光。自然界的白光是一种混合的光，是由七种颜色的光按一定的比例混合而成的；知果把两种适当的光按一定的强度比例混合也可得到白光，这两种颜色就叫互补色。溶液对可见光区的各色光几乎都吸收，则溶液呈黑色。如果溶液对各种不同波长的可见光有不同的吸收能力，则溶液呈现出被它吸收色光的补色。例如：白色光照射KmnO4溶液，溶液将其中的绿色光大部分吸收，而其它各色光透过溶液，通过溶液的光除紫色外其它颜色的光都两两互补成白色光，所以看到的是透过高锰酸钾溶液的紫色。从上面可知，有色溶液显现的颜色实质上是它所选择吸收光的互补色。（一）比色法 主要有目视比色法、光电比色法和分光光度法。它们的基本原理是相同的。光电比色法，分光光度法被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert和Beer定律。1.Lambert定律当一束平行单色光通过有色溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。若I0表示入射光的强度，I表示光线透过溶液后的强度，L表示溶液的厚度。则一dI／dI∝I—dI／dI＝aI或dI／I＝a.dI∫IoIdI／I=-a∫IoIdIln（I／I0）＝-aI所以lnI0／I=aI或I／I0＝eˉaI或lgI0／I＝K1e（K1e=a／2．303）（I／I0＝10ˉKie）K1是一常数，受光线波长，溶液性质和溶液浓度影响。从上述公式可知，透过溶液后光线I0强度的减弱（I／I0）与溶液厚度L呈指数函数关系。2.Beer定律当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高光线强度的减弱也愈显著，与Lambert定律推导相似；两者的关系可表示如下：lgI0／I＝k2C或I／I0=10K2C其中，C表示溶液的浓度，K2是一常数，受光线波长，溶液性质和溶液厚度的影响。上式公式所表示的光线强度与溶液浓度的关系称为Beer定律。然所有的溶液均符合Lambert定律，但并非所有的溶液都符合Beer定律，这是由于有些物质在不同浓度条件下其颜色可能发生改变，即在不同浓度条件下其吸收光的波长发生改变。3.Lambert—Beer定律及应用IgI／I0＝-KCL如果将通过溶液后的光线强度（I）和入射光I0的比值称为透光度（T），将-lgI／I0用光密度（A）表示，则它们之间的关系为：A＝-lgI／I0＝-lgT=KCL……·（1）其中K为常数，称为消光系数（E），表示物质对光线吸收的本领，受物质种类和光线波长的决定.从公式（l）可知，对于相同物质和相同波长的单色光（消光系数不变）来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。A1/A2=C1/C2或写作C1＝A1／A.C2……（2）如果C2为标准溶液的浓度，则可根据光密度值，按公式（2）求得待测液的浓度。（二）光电比色计和分光光度计的基本结构。 不论光度计、比色计还是分光光度计，其基本结构原理是相似的，都由光源、单色光器、狭缝、比色杯和检测器系统等部分组成。1.光源一个良好的光源要求具备发光强度高，光亮稳定，光谱范围较宽和使用寿命长等特点。一般的光度计采用稳控的钨灯，适用子340～900nm范围的光源，更先进的分光光度计外中有稳压调控的氢灯，适宜于作200～360nm的紫外分光分析光源。2.单色光器单色光器的作用在于根据需要选择一定波长的单色光。所谓单色光是指某特定波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长的发射能量较少而言。最简单的单色光器是光电比色上所采用的滤光片（一定颜色的玻璃片），由于通过光线光谱范围较宽，所以光电比色分辨效果较差。棱镜和光栅是较好的单色光器，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯的光线，因此分光光度计有较高的分辨效果。3.狭缝通过单色光器的发射强度可能过强，也可能过弱，不适于检测。狭缝是由一对隔板在光起路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小来调节入射单色光的强度使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的缝隙大小是可调的。4.比色杯又叫吸收杯、样品杯。是光度测量系统中最重要的部件之一，在可见光范围内测量时选用光学玻璃比色杯，在紫外线范围内测量时要选用石英比色杯。保护比色杯的质量是取得良好的分析结果的重要条件之一，不得用粗糙坚硬物质接触比色杯，不能用手指拿取比色杯的光学面，用后要及时洗涤比色杯，不得残留测定液。5.检测器系统硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，将通过比色杯的光线能量转变成电能。进一步再用适量的方法测量所产生的电能。光电比色计用硒光电池作为受光器，其光敏感性低，不能检出强度非常弱的光线，对波长在270nm以下和700nm以上的光线不敏感。较精密的分光光度计都采用真空光电管或光电倍增管作为受光器，并应用放大装置以提高敏感度，虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的弱得多，但这种有放大线路的灵敏检流系统仍可准确的将其检测出来。（三）几种常用国产光电比色计和分光光度计1.721型分光光度计 光谱范围在360～800nm，所有部件均在一主机内，操仵方便，灵敏度高。原理：以12伏25瓦白灼钨灯为光源，经透镜聚光后射入单色光器内，经棱镜色散反射到准直镜，穿狭缝得到，波长范围更窄的光波作为入射光进入比色皿，透出的光波被受光器光电管所接受，产生光电流，再经放大在微安表上反映出电流大小，并直接读出光密度。使用方法如下：①灵敏度选择钮放在“l”（如调不到“0”的选用较高档）。②转动波长旋钮，选用所需波长。③接通电源，打开电源开关，将仪器预热。④打开吸收杯暗箱盖（光门档板自动遮住光路），转动零点谓节旋钮，使电流指针圆复到透光度“0”。⑤将吸收杯放入杯架中，使空白杯对向光路，盖好吸收杯暗盖，转动“100%电位器”，调准电表指针使之指向透光度100％位置上。若空白杯液对光吸收能力过强，仪器灵敏度不够不能调到100％时，可将“100%电位钮”向回旋再将灵敏度选择开关拔到较高档（2～5档）。⑥将标椎液及测定的吸收杯依次推入光道，即可自电流计直接读出其光密度值。⑦用完毕后，将开关放回“关”的位置，切断电源，并将吸收杯取出，用蒸馏水充分洗干净。⑧注意事项a分光光度计属精密仪器，应糈心爱护使用。防震、防潮、防腐蚀。b要保持吸收杯的清浩干净，保护光学面的透明度。c读取光密度值的时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳，如连续使用时，中间应适当使之避光体息。d比色杯不要放置在仪器面上，以免液体腐蚀仪器表面。e调0位及100％旋钮要轻旋，旋到终点时指针仍未指到位，一定不能再用力旋，以免损坏电位器。2.722型分光光度计722型分光光度计是将光电管和微电流放大器同装在一密闭暗盒内，光信号由光电管接受后通过高值电阻转换成微弱的信号，再经微电流放大器加以放大后，在数字显示器上读出。操作方法如下：①将仪器的电源开关接通，打开样品室盖，选择所需用的单色波长。灵敏度选择在“1”档，调节“0％T”旋钮，使数字显示为“00．0”，然后将样品室盖合上。② 将装有溶液的比色皿置于比色架中，盖上样品室盖，将蒸馏水校正或空白对照管置于光路，调节透过率“100％T”旋钮，使数字显示为100.0T”。仪器预热15分钟。注意：如果显示不到100.0T，请调节灵敏度档。调节原则是保证空白档良好。调到“100%T”情况，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器具有更高的稳定性。特别指出的是：改变灵敏度后应按①重新调节“0％T”旋钮，使数字显示为“00．0”和透光度为‘‘100％T”。①将选择开关置于A，旋动吸光度调零旋钮，使数字显示为“0．00”，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。②浓度C的测量：将选择开关旋至C，将已标定浓度的溶液移入光路，调节浓庋旋钮，使数字显示为标定值。将被测溶液移入光路，即可读出相应的浓度值。③测毕，打开样品室盖，关电源，将各旋钮停在起始位置上，冲洗比色杯。注意：如果需大幅度改变波长时，需等数分钟才能正常工作，（因波长由长波向短波或短波向长波移动时，光能量变化急剧，光电管响应缓慢，需一段光响应平衡时间，使数字显示稳定后，重新进行“①”和“③”。在实际应用中常使用的待测介质颜色所对应的应使用的波长表选择波长（nm）波长对应颜色待测介质颜色400-435青紫黄绿435-480蓝黄480-490蓝绿桔黄490-500绿蓝红500-560暗绿深紫560-580绿黄蓝紫580-595黄蓝595-610桔黄蓝绿610-750红绿蓝3.UV-756MC紫外可见分光光度计使用（1）接通电源，打开电源开关（关好暗箱盖），仪器显示“756”并进行自检和初始化，整个过程约需要10分钟，结束后显示“220”，DATA显示“0.000”。2.按下“MODE”键，显示“2”，然后按下“ENTER”键，显示“220”。3.按下“GOTOλ”键，用数字键输入所需波长，显示所输入数值，按下“ENTER”键，等待出现所选择波长，DATA显示“0.000”。4.按顺序将空白杯、标准杯、测定杯置于比色槽中，将空白杯对向光路，Cell面板显示“R”位置（注意，比色杯中液体不得超过杯高的3/4）。5.按“A/T”键，再“2”，按下“ENTER”，再按下“ABSO/100%T”键，ABSO/位显示“0.000”。6.按下START/STOP键，将标准杯、测定杯分别对向光路，CELL显示“S”，DATA显示测定的A值。7.记录或打印数据。8.按下START/STOP键，关闭电源。七、层析分析原理 层析法又称色谱法，色层法和层离法（Chromatography），是广泛应用的一种生物化学技术，层析法是利用混合物各组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域；借此将各组分分离。层析利用两个相，一个相称为固定相；另一个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使各组得到分离。层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相称为气相层析。按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型：l.吸附层析利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。2.分配层析利用不同物质在流动相和固定之间的分配系数和溶解度不同，使物质分离。3.离子交换层析利用不同物质对离子交换剂亲和力不同分离。4.凝胶层析利用某些凝胶对不同分子量的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。5.亲和层析利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。层析法采用的方式主要是柱层和薄层层析，前者将固定相或载体装入柱内，使被分离物质沿一个方向移动而达到分离。后者将吸附剂涂成薄层，使样品在薄层上进行分离。（—）吸附层析（absorptionchromatography）氧化铝、硅胶等物质具有吸附其它一些物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被附物质的性质有关。l、柱层析法柱层析是用一根玻璃管，管内加吸附剂粉末，用溶解剂湿润后，即成为吸附柱。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A与B，则三者被吸附在柱上端，形成色谱。样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离。在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如，被吸附的A粒子被溶解随溶剂下移，但遇新的吸附剂，又将A吸附，随后，新溶剂又使A溶解下移，由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与被吸附力不完全相同，A与B移动的距离也不同。连续加入溶剂，连续分段收集洗脱液，各成分即可顺序洗出。最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降。甘油酯、磷脂、胆固醇等非极性的与极性不强的有机物用这种方法分离效果较好。2.薄层层析法薄层层析法是将吸附剂在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。（二）分配层析（partitionchromatography）溶质在两种不相混的溶剂中溶解分配是逐步达到平衡的，平衡后，溶质Ⅹ在两种溶剂中的浓度取决于分配系数（a）a=〖SXOX在溶剂1中的浓度／X在溶剂2中的浓度，分配层析即是利用物质在两种溶剂中的分配平衡。溶剂之一通常是水，它是保持在圈定的支持相之中（用淀粉、纤维素粉、滤纸等惰性材料制成），另一溶剂是移动相，由以水饱和过的有机溶剂组成，被分离的物质，如果彼此之间分配系数相差较大，就容易被分离开来。．（三）离子交换层析（iOn-exchangechromatography）离子交换层析，是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各离子的亲和力的不同，经过交换平衡达到一种柱层析法。目前大多数采用合成的离子交换剂，例知：以苯乙烯与二乙烯交联聚合的树脂为母体的离子交换树脂对分离小分子物质（如氨基酸，核苷，核苷酸等）是理想的。但对大分子物质（如蛋白质）是不适当的。因为它不能扩散到树脂的链状结构中，所以分离大分子物质常选用葡聚凝胶进行分子筛层析。（四）凝胶层析（gelchromatography） 凝胶层析即分子筛层析，是选用孔径大小一定的凝胶，将混合液中的小分子物质“筛”开来的一种分离方法。当一混合的蛋白质溶液通过凝胶柱时，分子直径小于凝胶孔隙的可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的不能进入。因此，小分子蛋白质在前进路上通过胶粒时遇到的阻力大，所以流速慢。相反地，大分子蛋白质不会进入胶粒内部，可以比较顺利地通过胶粒的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开，因为凝胶具有这种性能，所以把它称为“分子筛”。凝胶颗粒是多孔性的网络结构，凝胶作为一种层析介质，它是不带电荷的物质，在层析时一般不换洗脱液，只是一种滤过仵用。故又称为凝胶过滤。用于生物材料分离的凝胶主要有以下几类：交联萄聚糖（Ssphadex），聚丙烯酰胺胶（Bio—Gel），琼脂糖凝胶（Sepharose）和交联琼脂糖（SepharoseCI）。（五）亲和层析（aff1nityChromatography）亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法。它经常只需经过一种处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，并且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质具有的生物学性质，与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合，如某些酶可以通过其共价键与其特异的辅酶牢固结合。亲合层析的基本原理是：先把待提纯的某一蛋白的配体，通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂一类的多糖颗粒表面的功能团上，构成层析体。这种多糖材料在性能方面允许其它蛋由质白由通过。但能与配体结合的蛋白质则保留在柱内，然后改变洗脱条件，使蛋白质和配体分离，即可将蛋白质纯化。八、实验室规则（一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导进行实验。（二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。（三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂，蒸馏水，自来水，煤气和电。（四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛洒在实验台上。（五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。（六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。（七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全操作，避免事故。（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教师检查，允许后方可离开。 第二部分生物化学基础试验 实验一维生素C的定量测定［原理］维生素C具有很强的还原性。在硷性溶液中加热并有氧化剂存在时，维生素C易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中，维生素C能将染料2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型2,6-二氯酚靛酚，同时维生素C氧化成脱氢维生素C。氧化型的2,6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后即失去红色。根据滴定时2,6-二氧酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被测物质中维生素C的含量。［操作］1.称量样品2g，加2%草酸液5ml于研钵中，研成匀浆倾入50ml量筒中。2.以1%草酸液将样品稀释至20ml摇匀。3.如果样品有颜色，再加入适量的白陶土，振摇数次，使其充分脱色。4.取上层液过滤，收取滤液5ml，以标定过的2,6一二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈现淡红色，在15秒内不退为止，记录滴定用量为V1。5.取1%草酸5ml，用2,6一二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈现淡红色，记录滴定用量为V2。为空白滴定。6.计算［计算］维生素C(mg/100g)=(V1-V2)×T÷W×100W—滴定时所用样品稀释液中含样品的克数T—1ml2,6一二氯酚靛酚能氧化维生素C的mg数(0.088mg/ml)［注意事项］1、操作过程中要迅速，因还原型维生素C易被氧化。2、食物中含有较多的还原物质，亦能与2，6一二氯酚靛酚作用，故误差可达10%左右。［试剂］1.1%草酸溶液2.2%草酸溶液3.白陶土4.0.001N2，6-二氯酚靛酚溶液：称取氧化型2，6-二酚氯靛酚25mg，溶于100ml含26mgNaHCO3的水中，充分摇振，放置过夜。用前过滤，用蒸馏水稀释至125ml。用标准Vc标定其浓度。标准Vc溶液(1.0ml=0.5mg)：精确称取纯Vc25mg，溶于4%盐酸25ml，移入50ml和容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度。吸取标准Vc溶液1.0ml，置于蒸发皿中，加2%盐酸1ml，用配制的2，6一二氯酚靛酚滴定。然后将2，6-二氯酚靛酚稀释至每mlVc0.088mg，贮于棕色瓶中，置冰箱中可保存一周。1ml2，6-二氯酚靛酚相当维生素Cmg数=维生素C浓度(mg/ml)×维生素Cml数÷滴定消耗2，6-二氯酚靛酚ml数 5.维生素C溶液：纯维生素C粉末20mg，以10%草酸溶液溶解，并定容到100ml，冷藏保存。标定：吸取维生素C液2ml于锥形瓶中，加入6%KI溶液0.5ml，1%淀粉液2滴，再经标准的1.7×10-4mol/lKIO3溶液滴定至终点，呈淡兰色。维生素C浓度(mg/ml)=消耗1.7×10-4mol/LKIO3的ml数×0.088÷所取维生素C液ml数6.0.017mol/LKIO3溶液：精确称取干燥的KIO30.3567用蒸馏水溶解后，再加水至100ml刻度。7.1.7×10-4mol/LKIO3溶液：0.017mol/LKIO3液1ml用水稀释到100ml刻度。此液1ml相当于维生素C0.088mg。8.1%淀粉液：可溶性淀粉0.5克，加水1滴搅拌成糊状后倒入50ml沸水中，混匀，冷藏待用。9.6%KI溶液：称取KI0.6g溶于100ml水中临用现配。10.4%HCl：取38%含量的HCl21ml加水至200ml。［思考题］1.维生素的理化性质最重要是什么?为何用草酸提取维生素C?2.维生素C的生理功能有哪些?3.食品中维生素C的含量受哪些因素的影响?试举出三种含维生素C最高的食物。实验二考马氏量蓝G-250染色法测定蛋白质含[原理]此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。[操作步骤]1、标准曲线的制备：按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。编号123456蛋白标准（ml）00.020.040.060.080.10蒸馏水（ml）0.100.080.060.040.020染色液（ml）333333在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘出标准曲线。2、血清蛋白质测定稀释血清（或其他蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其他蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1，2，3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。试剂（ml）1（空白管）2（标准管）3（样品管）蒸馏水0.1————蛋白质标准——0.1——稀释血清————0.1染色液333[计算]每100ml血浆中蛋白质的含量（g%）=A样/A标ⅹC标ⅹ0.1ⅹ50ⅹ100/0.1ⅹ1000=A样/A标ⅹ5[仪器与试剂] 1、中试管2、刻度吸管0.1ml3支，5ml1支3、722型分光光度计[试剂]1、考马氏亮蓝G-250染色液称取100ml考马氏亮蓝G-250溶解于50ml95%的乙醇中，加入100ml85%的磷酸，加水稀释到1升2、蛋白标准（1mg/ml）准确称取100ml牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，-20℃冰箱保存。附注1、高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮等对测定有干扰2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行3、考马氏亮蓝G-250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗实验三蛋白质紫外分光测定法[原理]由于蛋白分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm之光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱色谱分离中）广泛应用。此法的缺点是（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。[试剂]1．标准蛋白溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正过的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/ml的溶液。2．待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg/ml的溶液[操作]1．标准曲线的绘制按下表分别向没支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。12345678标准蛋白质溶液/ml00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/ml4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/（mg/ml）00.1250.2500.3750.5000.6250.7501.00A2802．样品测定 取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测蛋白质的浓度。二、其他方法（1）将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质浓度。计算蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。此外，也可先计算出A280/A260的比值后，从下表查出校正因子F值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将F值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。蛋白质浓度（mg/ml）=F×1/d×A280×N式中A280为该溶液在280nm下测得得光吸收度值，d为石英比色杯得厚度（cm），N为溶液得稀释倍数。紫外吸收法测定蛋白质含量得校正因子280/260核酸（%）因子（F）280/260核酸（%）因子（F）1.750.001.1160.8465.500.6561.630.251.0810.8226.000.6321.520.501.0540.8046.500.6271.400.751.0230.7847.000.5851.361.000.9940.7677.500.5651.301.250.9700.7538.000.5451.251.500.9940.7309.000.5081.162.000.8990.70510.000.4781.092.500.8520.67112.000.4221.033.000.8140.64414.000.3770.9793.500.7760.61517.000.3220.9394.000.7430.59520.000.2780.8745.000.682注：一般纯蛋白质的光吸收比值（A280/A260）约1.8，而纯核酸的比值约为0.5。（2）对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和255nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△Ａ与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差△Ａ＝Ａ215－Ａ225式中的A215和A225分别式蛋白质溶液在215nm和225nm波长测得的光吸收值。此法在蛋白质含量达20—100μg/ml的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及1×10-1mol/l磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是1×10-1mol/l乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5×10-3mol/l才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收峰常因pH的改变而有变化，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线测定的pH一致。（3）如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值[A1%1cm]，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。实验四血清脂蛋白琼脂糖电泳[原理] 血清脂蛋白经苏丹黑B染色后，以琼脂糖为载体，在pH8.6巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带。按电泳移动的速度不同，正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β—脂蛋白（最深）、前β—脂蛋白（最浅）、α—脂蛋白（比前β—脂蛋白略深些）。在原点处应无乳糜微粒，也见不到中间脂蛋白的条带，有时前β—脂蛋白也显示不出来。前β—脂蛋白比α—脂蛋白深染，且血清甘油三酯明显升高，胆固醇正常或略高，可以确定为Ⅳ型高血脂症。β—脂蛋白区带比正常明显深染，血清总胆固醇明显增高而甘油三酯正常者为Ⅱa型高血脂症；血清总胆固醇增高而甘油三酯略高和前β深染者则为Ⅱb型高血脂症。β和前β—脂蛋白两条区带连在一起彼此难以区分称为“宽β区带”，同时血清甘油三酯和胆固醇均有增高，可定为Ⅲ型高血脂症。原点出现乳糜微粒，β和前β均正常或降低，同时血清甘油三酯明显增高，可定为Ⅰ型高血脂症。[试剂和主要器材]（一）血清。（二）苏丹黑B染色液苏丹黑B的饱和无水乙醇溶液，用前过滤。（三）巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）为电极缓冲液。巴比妥钠25.4g，巴比妥2.76g，EDTA酸0.292g，加水溶解后用水稀释至1000mL。（四）Tris缓冲液（pH8.6）为凝胶缓冲液。Tris1.212g，EDTA酸0.292gNaCL5.85g，加水溶解后再加水至1000mL。（五）琼脂糖凝胶琼脂糖0.45g，Tris缓冲液50mL，加水50mL，边搅拌边加热至沸腾，待琼脂糖溶解后立即停止加热。（六）水平电泳设备。（七）37℃水浴。（八）离心机。（九）载玻片（十）切口刀刀口长15mm的刀片两片，中央夹一有机玻璃或木片，用螺丝固定，使两片刀片相距1.5mm。用相应的打槽器更好。（十一）挖槽小匙用直径1.5mm的铜丝约6cm长，一端锤成扁平，用细砂纸磨光（用剪好的X光片亦可）。（十二）血色素管或微量加样器。[操作步骤]1.预染血清血清0.2mL加苏丹黑B染色液0.02mL于小试管中，混合后置37℃水浴染色30分钟。然后2000r/min离心5分钟。2.制备琼脂糖凝胶板将已经配置的0.45%琼脂糖凝胶置于沸水浴中加热融化。用吸管吸取凝胶溶液浇注载玻片，每片约2.5mL，静置约半小时后凝固（天热时需延长，或放冰箱数分钟加速凝固）。3.点加血清在已经凝固的琼脂糖凝胶板距离一端约2cm处，用切口刀片（打槽器）垂直切入凝胶后立即取出，然后用铜丝小匙将长方小条凝胶取出。以小片滤纸吸干小槽内水分，用血色素吸管吸取经过预染的血清约15μl，注入凝胶板上的小槽内。4.电泳将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于阴极一端。两块三层纱布于巴比妥缓冲液中浸湿，然后轻轻紧贴在凝胶板两端，纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中（注意：此电极缓冲液不能用三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替）。接通电源，电压为120~130V，每片电流为3~4mA。约经45至55分钟，即可见到分离的色带。[注意事项]1.电泳样品应为新鲜的空腹血清。 2.加热溶化琼脂时，须防止水分蒸发过多。琼脂凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离结果。3.在α—脂蛋白前若出现较浅区带，可列为α—前脂蛋白。4.如果要保存电泳图形，可将凝胶板（连同玻片），置于清水中浸泡2小时脱盐，而后放入干燥箱（80℃左右）烘干即可。5.制作凝胶板是琼脂糖浓度一般选用0.5%左右为宜，高于1%以上α—脂蛋白部分较紧密，β—和前β—脂蛋白部分不够清晰，低于0.45%则凝胶凝固性较差，图谱不清。6.样品槽要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图形。实验五血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳[原理]血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、用样量少和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。根据凝胶形状不同分为盘状电泳和板状电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管中，利用不连续的缓冲液pH值进行电泳而命名；同时，样品混合物分开形成的带很窄，呈圆盘状，因此圆盘电泳这个名字成了不连续性和盘状的双关语。不连续盘状电泳具有很高分辨力，这是由于有三种效应存在、浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。1.浓缩效应：管中装有三种不同的凝胶层，见附图，上层为样品胶，第二层为浓缩胶，这两层均为大孔胶、其缓冲为Tris-HCL缓冲液pH值为6.7。第三层为分离胶，该层为小孔胶Tris-HCL缓冲液，pH8.9。在上下电泳槽中充分以Tris—甘氨酸缓冲液，pH值为8.3。这样造成凝胶孔径、pH值、缓冲液的不连续性。在此条件下，HCL几乎全部电离为Cl-，甘氨酸有极少部分的分子解离成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白质也能解离而带负电荷。当电泳系统通电后，这三种负离子同向正极移动。根据有效泳动率的大小，最快的称为离子或先行离子(这里指Cl-)，最慢的称为慢离子或随后离子(这里是NH2CH2COO-)。电泳开始后，快离子在前，在它之后形成一离子浓度低的区域，即低导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，则在快离子和慢离子之间造成一个不断向阳极移动的界面，由于蛋白质的有效泳动率恰好位于快、慢离子之间，因此蛋白质样品被夹在当中浓缩成一狭窄层，这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。2.电荷效应：蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质样品按泳动率快慢顺序排列一个一个的圆盘区带。在进入分离胶时电荷效应仍起作用。3.分子筛效应：当被浓缩的蛋白样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的pH值8.9(电泳时实际测量是9.5)，使接近甘氨酸的pka(9.7～9.8)，这样慢离子解离度增大，因而其泳动率也增加，此时慢离子泳动率超过所有蛋白质的有效泳动率，高电压梯度不复存在。此时各种蛋白质不仅由于其分子量或构型不同，在一个均一的电压梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，表现泳动率不同而被分开。 ［操作］(一)凝胶柱的制备1.取0.5×100cm的玻管，从另一端量取7cm、8cm两处，分别用玻璃铅笔划线，起端管口用小块玻璃纸包封好，插入橡皮垫，垂直立于试管架上。2.取小烧杯2个，标号，先按表配制分离胶，待分离胶聚合后再配浓缩胶。试剂(ml)分离胶浓缩胶分离胶缓冲液单体交联剂浓缩胶缓冲液蒸馏水TEMED(四甲基乙二胺)催化剂1.25-1.00-1.256.27.640.0050.0050.050.1注意抽除溶液中气泡3.取1号杯混匀溶液后，用滴管吸取加入上述玻璃管至刻度(离底端约7cm)再以玻璃管小心在胶液上覆以0.5cm厚度的水层，将此玻璃管垂直放在试管架上，约半小时以上，凝胶聚合完成后，用滤纸吸去覆盖的水层，这是分离胶。按表配制浓缩胶，摇匀，用滴管吸此液加于上述凝胶层，至第二刻度(8cm处)。同样覆盖0.5cm厚水层，垂直放于试管架上。聚合后，用滤纸吸去水层，这是浓缩胶。(二)加样血清中加1/3体积50%甘油或20%蔗糖溶液，加入少量0.5%溴酚蓝作追踪剂，混匀，吸此样品30～50μ加在浓缩胶上。沿管壁加入电极缓冲液，直至项端。(三)电泳1.将制备好的凝胶柱分别插入电泳槽底部的小孔，凝胶管垂直在上槽和下槽中，做好标记。加好上、下槽电极缓冲液(Tris—甘氨酸)，插上电极，上负下正。2.将电流调至3mA/管，电压100～200V，当溴酚蓝追踪剂接近管底时(约电泳30分至1小时)，切断电源，将凝胶管取出(缓冲液倒入回收杯)。(四)剥胶取下凝胶管，用带有10cm长针头注射器，内盛蒸馏水作润滑剂，将针头插入胶柱与管壁之间，边注水边旋转玻璃管，直至胶柱与管壁分开，用洗耳球轻轻在一端加压，使胶柱从玻璃管中慢慢滑出。(五)染色与脱色从管中取出凝胶柱浸入0.5%～1%氨基黑染液中，一般染色约10～15分钟，但有的蛋白质需要更长时间。染色后用水冲去多余的染料，放入7%乙酸中脱色，直至余下黑色全部脱去为止。约30分钟。［注意事项］1.丙烯酰胺与N、N—亚甲基双丙烯胺是神经性毒剂，并对皮肤有剌激作用，操作时应避免与皮肤接触。2.催化剂最好当天配制，冰箱中贮存也不能超过一周。［试剂］1.分离胶缓冲液(pH8.9)：取Tris36.3克加入1NHC148ml，再加水到100ml。2.单体交联剂：取丙烯酰胺30g，N—N—亚甲基双丙烯酰胺0.8g，加蒸馏水到100ml。 3.浓缩胶缓冲液(pH6.7)：取Tris5.98g加1NHC148ml，加蒸馏水到100ml。4.加速剂：四甲基乙二胺。5.催化剂：10%过硫酸铵，取AP1克加水到10ml。临用前现配。6.电极缓冲液(pH8.3)：称取Tris6g，甘氨酸28.9g溶解后加蒸馏水到100ml，用时稀释到1000ml。7.0.5%氨基黑染色液：取考马斯兰R—2500.5g，7%冰乙酸10ml，溶解后加水100ml，混匀。8.7%乙酸：取含量37%的乙酸19ml加水至100ml。9.20%蔗糖100μl与0.025%溴酚兰5μl组成样品稀释液。实验六血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳［原理］乙酸纤维素膜电泳可将血清蛋白质分离为：清蛋白及α1、α2、β、γ—球蛋等5条区带。将薄膜置于染色液中蛋白质固定并染色后，不仅可看到清晰的色带，并可将色带染料分别溶于碱溶液中进行定量测定，从而可计算出血清中各种蛋白质的百分含量。正常人血清中蛋白质中各组分的蛋白质含量百分比为：清蛋白57～72%β—球蛋白6.2～12%α1—球蛋白2～5%γ—球蛋白12～20%α2—球蛋白4～9%［操作］(一)将薄膜剪切成1.5～2cm宽、8cm长的条带，或整张薄膜每隔1.5cm编号，预先在加样位置用铅笔作一记号。然后将光泽面向下漂于缓冲液上浸泡5～10分钟(也可预先浸泡随时取用)；待膜完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的液体。然后在无光泽面上距一端约1.5～2cm处用较细而尖端光滑的微量吸管或载玻片蘸血清约2～3μl点样。待血清吸入膜后以无光泽面向下两端紧贴在四层的滤纸桥上(加血清的一端在电泳槽阴极侧)。加盖，平衡10分钟，然后通电。(二)通电：通电前先检查薄膜上血清样品是否处在阴极一侧，通电后调节电压至110V～130V，电流为0.4～0.5mA/Cm宽，通电45～60分钟。(三)染色：电泳结束后，关闭电源。将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入到丽春红染色液中，染色5～10分钟。从染色液中取出薄膜，浸入漂洗液中漂洗3～4次直至薄膜的底色洗净为止用滤纸吸干薄膜表面水分。(四)定量：取试管6支，编号，将电泳薄泳按蛋白质区剪开，分别置于试管中。另于空白部位剪一平均大小的薄膜条放入空白管中。务管中加入0.4NNaOH5ml，需反复振摇使其充分洗脱。用分光光计进行比色，波长490mm，以空白管调零点，读取清蛋白及α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。［计算］吸光度总和(A)=AA+Aα1+Aα2+Aβ+Aγ 清蛋白%=AA/A×100%α1球蛋白%=Aα1/A×100%α2球蛋白%=Aα2/A×100%β球蛋白%=Aβ/A×100%γ球蛋白%=Aγ/A×100%(五)透明保存在玻片上滴加透明液3～4滴，将漂洗后晾干的薄膜平铺在上面并迅速展开，放置过夜晾干。然后在约40℃温水浸泡3～5分钟，即可将此透明的染有蓝色区带的薄膜揭起，夹在滤纸中。待吸干后即可保存或用光密度计直接测定各区的光密度。［注意事项］(一)点样时一定按操作步骤进行，否则常因血清滴加不匀或滴加过多，导致电泳图谱不齐或分离不良。(二)乙酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定密闭；电流不易过大，防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。(三)缓冲液的离子强度一般不应小于0.05，或大于0.075，因为过小可使区带施尾，而过大则使区带过于紧密。(四)透明液中乙酸含量适宜，含量不足，膜即发白，含量过高膜可被溶。(五)在剪开蛋白质各区带时，力求准确，以尽量清除人为的误差。(六)切勿用手接触薄膜表面，以免油腻或污物沾上，影响电泳结果。(七)电泳槽内的缓冲液要保持清洁(数天要过滤一次)，两极溶液要交替使用。最好将联结正极，负极的电流调换使用。(八)电泳槽内两边有缓冲液应保持液面相平。(九)通电完毕，要先断开电源，再取薄膜，以免触电。［试剂］(一)巴比妥缓冲液(PH8.6离子强度0.06)。巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，置于盛有200ml蒸馏水的烧杯中稍加热溶解后，移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。(二)染色液丽春红S0.9g三氯醋酸13.4g磺柳酸13.4g蒸馏水加至1000ml(三)漂洗液7%冰乙酸(四)洗脱液0.4mol／LNaOH(五)透明液冰乙酸25ml，加95%乙醇75ml混匀。(六)新鲜血清(无溶血)［思考题］1.在电泳的影响蛋白质泳动度的因素有哪些?哪种起决定性作用?2.如果血清样品溶血，在电泳时会出现怎样的结果?3.肝、肾病变时，乙醋纤维素薄膜分离的蛋白质电泳谱可能会发生什么样的变化?实验七pH对唾液淀粉反应速度的影响［原理］ 酶的作用对于环境pH变化非常敏感，能够使酶发挥最大催化活性的溶液pH值，称为酶的最适pH。pH不但影响酶分子本身，也可影响底物分子的解离，从而影响酶与底物的结合和催化作用。所以，每种酶都有其自身的最适pH值。酶作用的底物不同，其最适pH亦略有不同。过高或过低的pH亦会引起酶蛋白变性，使酶促反应的速度降低。本实验借助唾液淀粉酶对淀粉的水解作用来观察不同pH对其催化作用的影响。酶最适pH可通过酶在一系列不同pH环境中的底物反应速度的不同而求出。［操作步骤］(一)制备1∶50稀释唾液：漏斗内敷少量棉花，插入洁净试管内，收集2～4人唾液。取1ml混合唾液，置于锥形瓶内，加水49ml，充分混匀。(二)取3支试管，分别标以E1、E2和E3，各加入1ml1∶50稀释唾液。(三)另取3支试管，分别标以1、2、3。按顺序加入下表试剂，充分混匀。试剂（ml）1231%淀粉溶液1mol/LNaClpH5.7缓冲液pH6.8缓冲液pH8.0缓冲液422--42-2-42--2(四)以上6管置37℃水浴内，预热5分钟。(五)将E1倾入管1，立即混匀，隔1分钟，再将E2倾入管2，依次类推。(六)管1保温10分钟后，从管1中取出2ml置于相应试管中，隔1分钟，从管2取出2ml置于相应试管中，依次类推。余液继续保温。(七)取出的各管溶液分别滴入1滴碘液，观察并记录结果。(八)余液继续保温10分钟后，依前法，再取一次，加碘1滴，观察结果并记录之。［注意事项］(一)严格控制温度。在保温期间，水浴温度不能波动，否则影响结果。(二)严格控制反应时间。保证每管的反应时间均为10分钟。［试剂］(一)1mol／LNaCl。(二)pH5.7、6.2、6.8、7.4、8.0的0.2mol／L磷酸盐缓冲液：A液(0.2mol／LNaH2PO4)：NaH2PO427.8g溶于少量水中，转移到1000ml容量瓶内，稀释到刻度。B液(0.2mol／LNa2HPO4)：Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71g溶于少量水中，转移到1000ml容量瓶内，稀释到1000ml。按下表分别吸取一定量的A液和B液置200ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度以配不同pH的0.2mol／L磷酸盐缓冲液。溶液pHA液(ml)B液(ml)5.76.26.87.48.093.581.551.019.05.36.518.549.581.594.7(三)1%淀粉溶液。 实验八碱性磷酸米氏常数的测定在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加就开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。底物浓度与反应速度的这种关系，可用米曼氏方程表示：　　　　　　　　v=Vmax[S]Km+[S]式中v为反应速度；Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数。按此方程，可用作图法求出Km。（一）以V对［S］作图　　由米氏方程可知，当v=1/2Vmax时，Km=[S]，即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v，以v对[S]作图，当v=1/2Vmax时，其响应的底物浓度即为Km。（二）以1/v对1/[S]作图　　将米曼氏方程转换成林贝氏方程　　　　　1/v=Km/Vmax·1/[S]+1/vmax以1/v对1/[S]作图可得一直线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Km。1/v1/Vmax-1/Km1/[S]Km为酶的特征常数，对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此常可鉴别酶，大多数酶的Km值在10-2~10-5之间。本实验以碱性磷酸酶为材料，测定底物不同浓度时的酶活性，再根据林贝法作图，计算Km值。AKP磷酸苯二钠+H2O酚+Na2PO4OH-+4-氨基安替比林K3Fe(CN)6酚衍生物（红色）[试剂]１、0.04mol/L底物液　　磷酸苯二钠（C6H5PO4.·2H2O）10.16g或磷酸苯二钠（无结晶水）8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱内保存。次溶液只能用一周。２、AKP溶液　　纯制碱性磷酸酶5mg，用pH8.80.01mol/LTris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液配制成100ml，冰箱中保存。3、0.5mol/LNaOH。 ４、0.3%4-氨基安替比林　　４-氨基安替比林0.3g及NaHCO34.2g，用蒸馏水溶解，并稀释至100ml，置棕色瓶中，冰箱内保存。5、0.5%铁氰化钾　　铁氰化钾5g和硼酸15g各溶于400ml蒸馏水中，溶解后用两液混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，置棕色瓶中，暗处保存。６、pH8.8Tris缓冲液　　Tris12.1g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml即为0.1mol/LTris溶液。取0.1mol/LTris溶液★，加蒸馏水约800ml，再加0.1mol/mL乙酸镁100ml，混匀后，用1%乙酸调节至pH8.8。用蒸馏水稀释至1000ml即可。7、0.1mol/L乙酸镁　　乙酸镁21.45g溶于蒸馏水中并稀释至1000ml.8、pH10.00.1mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液　　无水Na2CO36.36g及NaHCO33.36g，溶解于蒸馏水中并稀释至1000ml.9、酚标准液１）称取结晶酚1.50g，溶于0.1mol/LHCI至1000ml为储备液。２）标定：取25ml上述酚液，加55ml0.1mol/LNaOH后，加热至65℃，再加入0.1mol/L溶液25ml，盖好放置30分钟后，加浓HCI5ml，再以0.1%淀粉为指示剂，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定。滴定反应如下：3I2　+　C6H5OH　→　C6H5I3(OH)　+　3HII2　　+　　2Na2S2O3→　2NaI　+　Na2S4O6根据反应，３分子碘（分子量为254）与１分子酚（分子量为94）起作用，因此每毫升0.1mol/L碘溶液（含碘12.7mg）相当于酚的毫克数为：　　　　　12.7×94/3×254=1.56725ml碘液中被硫代硫酸钠滴定者为Xml，则25ml酚溶液中所含酚量为：(25—X)×1.567mg3）应用时按上述标定结果用蒸馏水稀释至0.1mol/mL作为标准溶液。[主要器材]1、３７℃水浴2、分光光度计[操作]（一）底物浓度对酶促反应速度的影响１、取洁净干燥小试管９支，按下表操作，特别注意准确吸取底物液。混匀。　试剂（ml）　　1234567890.4mol/L底物液0.00.50.50.50.50.50.51.0　1.5H2O　　　　　1.53.53.02.52.01.51.01.00.1２、另取洁净干燥大试管９支，按下表操作，特别注意准确吸取底物液和酶液。试剂（ml）　　　　　１　　２　　３　　４　　５　　６　　７　　８　　９取上表编号稀1.01.01.01.01.01.01.01.01.0释的底物液pH10碳酸盐0.90.90.90.90.90.90.90.90.9缓冲液37℃水浴保温5分钟AKP溶液　　　　　0.10.10.10.10.10.10.10.10.1最终底物浓度00.630.710.821.001.251.672.505.00加入酶液后，立即计时，混匀后在37℃水浴准确保温15分钟。 ３、保温结束，立即加入0.5mol/LNaOH1ml以终止反应。４、各管中分别加入0.3%４-氨基安替比林１ml及0.5%铁氰化钾2ml，充分混匀，放置10分钟。以１号管为对照，于510nm波长处比色测定，并根据标准曲线计算酶活性。５、以酶活性单位（v）的倒数１／v为纵坐标，以底物浓度［S］的倒数１／［S］为横坐标，在坐标纸上描点并连成直线，求该酶的Km值。（二）酚标准曲线的绘制试剂（ml）1234560.1mg/mL酚标准溶液0.00.050.100.200.300.40蒸馏水2.01.951.901.801.701.6037℃水浴保温5分钟0.5mol/LNaOH1.01.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林1.01.01.01.01.01.00.5%铁氰化钾2.02.02.02.02.02.0混匀后室温放置15分钟，于510nm波长比色。以酚含量（ug）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制酚制标准曲线。（三）酶活性的计算在37℃保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位。以标准曲线查出释放的酚量（），即可算出酶活性。100ml酶液中的酶活性=释出的酚量（ug）×1/0.1×100×1/1000=释出的酚量(mg)实验九改良Mohun法测定血清谷-丙转氨酶活性［原理］以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在血清谷—丙转氨酶(SGPT)作用下，生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸与2，4—二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，此化合物在碱性溶液中呈棕色，与已知浓度的丙酮酸标准液在同样条件下显色，用比色法测出丙酮酸的生成量，即可计算谷—丙转氨酶的活性。按本法测定谷丙转氨酶活性单位的定义是：每ml血清在pH7.4,37℃保温条件下与底物作用30分钟，每生成2.5μg的丙酮酸为一个酶活性单位。正常人血清的谷丙转氨酶穆氏单位为2～40单位／ml。［操作］(一)标准曲线的绘制1、取干燥洁净试管9支，编号，按下表加入试剂，混匀。试剂(ml)123456789标准丙酮酸液(500μg／ml)蒸馏水丙酮酸的浓度(μg／ml)1.09.0502.08.01003.07.01504.06.02005.05.02506.04.03007.03.03508.02.04009.01.04502、另取干燥试管11支，编号，在1—9号管中依次加入上述：(“1”)所稀释的1—9号丙酮酸标准液0.10ml，在10号管中加入未经稀释的标准丙酮酸液(500μg／ml)0.10ml。再按下表操作：试剂(ml)1234567891011 蒸馏水谷-丙转氨酶底物液2,4-二硝基苯肼溶液丙酮酸实际含量(μg)—0.50.55—0.50.510—0.50.515—0.50.520—0.50.525—0.50.530—0.50.535—0.50.540—0.50.545—0.50.5500.10.50.50各管混匀，置37℃水浴20分钟0.4MNaOH0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5各管混匀，于室温静置10分钟，用520nm波长(或绿色滤光片)，以第11管为空白比色，读取各管的光密度。然后，以各管中丙酮酸的含量(5～50μg)为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。四、酶活性的测定取干燥试管2支，注明测定管及对照管，按下表操作：混匀37℃水浴保温20分钟，取出加入0.4MNaOH5.0ml,混匀，静置10分钟，在520nm波长下比色，用对照管调节零点，读取测定管的光密度，然后从标准曲线查出其相当的丙酮酸含量(μg)。试剂(ml)测定管对照管谷丙转氨酶底物液0.50—37℃水浴预温5分钟血清0.100.10混匀，37℃水浴准确保温30分钟2，4—二硝基苯肼液0.500.50谷丙转氨酶底物液—0.50［计算］谷-转氨酶活性单位／ml=标准曲线中查知的ug数／2.5×１／0.1［临床意义］谷丙转氨酶广泛存在于机体的各组织中，尤以肝脏的含量最高。在正常人的血清中此酶活性很低，用穆氏法测定时为2～40单位／ml，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及中毒性肝炎细胞坏死时，血清中谷丙转氨酶活性显著增高。其次在肝癌、肝硬化及胆道疾患时，此酶活性可见中度增高。故血清谷丙转氨酶活性的测定已成为目前临床上诊断肝脏疾病的一种重要方法但必须指出，其他脏器的疾病如心肌梗塞时，也可引起血清谷丙转氨酶活性上升。［试剂］1、标准丙酮酸液(500μg／ml)：准确称取丙酮酸钠(AR)62.5mg，溶于0.1NH2SO4100ml中。此液需在临用前配制。0.1NH2SO4：取浓H2SO42.8ml稀释至1000ml。2、0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4):K2HPO413.97g和KH2PO42.69g，加蒸馏水溶解后配成1000ml。3、谷丙转氨酶底物液(pH7.4)：α-酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸1.79g，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)50ml溶解，然后用1NNaOH调节至pH7.4，最后用0.1M磷酸盐缓冲液稀释至1000ml，贮存于冰箱内可保存一周。4、0.02%2,4—二硝基苯肼，称取2，4—二硝基苯肼20mg溶于1NHCl中，加热溶解后，用1NHCl稀释至100ml。 5、0.4MNaOH:取NaOH16g加水稀释至1000ml。实验十氨基转移作用［原理］转氨基作用是氨基酸代谢中的一个重要反应。在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α-酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化，转氨酶广泛分布于机体各器官、组织。本实验用纸层析法来观察α酮戊二酸与丙氨酸在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化下的转氨基作用。COOHCOOHCH2CH3GPTCH2CH3CH+HC-NH2CH+C=OC=OCOOHHCNHCOOHCOOHCOOHα酮戊二酸丙氨酸谷氨酸丙酮酸［操作］1、肝匀浆制备：取新鲜的动物肝脏1g在研钵中用剪刀剪碎，加入9ml冰冷的0.01MpH7.4磷酸缓冲液，迅速研成匀浆。2、保温：取离心管2支，标明测定管与对照管，各加入肝匀浆0.5ml，测定管放入37℃水浴保温10分钟，对照管放入沸水浴中煮10分钟，冷却后，于两管中各加0.1M丙氨酸0.5ml，0.1Mα—酮戊二酸0.5ml，0.01MpH7.4磷酸缓冲液1.5ml，摇匀，放进37℃水浴保温1小时，保温完毕立即将测定管放入沸水浴中10分钟以中止反应，取出冷却后，将两管离心，上清液备用。3、层析：取直径10cm圆形滤纸一张，用圆规作半径1cm的同心圆，通过圆心作两条相互垂直的线。在1.3两处分别点测定管和对照管上清液各1滴。在2，4两处分别点0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸各1滴。方法是用毛细血管在滤纸上点样，注意斑点不可太大(一般为直径0.5cm)。用吹风机吹干。在滤纸圆心处打一小孔(如铅笔蕊大小)另取同类滤纸约1.5cm，下一半剪成须状，卷成圆筒如灯蕊，插入小孔(勿使突出滤纸面)。将层析溶剂放入扩散皿的内室，将滤纸平放在扩散皿上，灯蕊浸入溶剂中，将另一同样大小扩散皿反盖上。可见溶剂沿灯蕊上升到滤纸，再向回周扩散，当溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用吹风机吹干或在60℃烘箱中烤干。4、显色：将上述滤纸放平，用喷雾器喷上0.5%茚三酮溶液，再吹干或烤干，此时可见紫色的同心弧色斑的位置及色泽深浅，计算各自Rf值。Rf(比移值)=斑点中心到原点的距离/溶剂前缘到原点的距离［试剂］1、0.01MpH7.4磷酸冲液：0.2MNa2HPO4溶液81ml与0.2MNaH2PO4溶液19ml混匀以蒸馏水稀释20倍。0.2MNa2HP4：取Na2HPO4·12H2O7.162g加水到100ml 0.2MNa2HP4：取NaH2PO4·2H2O3.12g加水至100ml2、0.1M丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1NNaOH仔细调节到pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。3、0.1Mα酮戊酸溶液：称取α—酮戊二酸1.46克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液以1NNaO仔细调节至7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。4、0.1M谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1NNaOH仔细调节到pH7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。5、0.5%茚三酮溶液：称取茚三酮0.5克溶于100ml丙酮中。6、层析溶剂：80%苯酚、称取80克苯酚加20ml水即可。注意加水过多出现混浊。［思考题］1.各种层析技术在应用上有什么特点?2.上述三种层析实验分别属于哪一类层析?3.氨基酸的脱氨基作用有几种方式?哪种最重要?4.体内的转氨酶主要有哪两种，测定它们的临床意义分别是什么?实验十一离子交换层析分离混合氨基酸本实验用磺酸型阳离子交换树脂（Dowex50）分离酸性氨基酸（天冬氨酸）、中性氨基酸（丙氨酸）和碱性氨基酸（赖氨酸）的混合液。在特定的pH条件下，它们的解离程度不同，所以与离子交换树脂的亲和力也不同，通过改变洗脱液的pH或离子强度可分别洗脱而达到分离。[试剂]1、磺酸型阳离子交换树脂（Dowex50）2、2mol/LHCI3、2mol/LNaOH4、0.1mol/LpH4.2柠檬酸缓冲液（0.1mol/L柠檬酸54ml与0.1mol/L柠檬酸钠46ml混合）5、0.1mol/LHCI6、0.1mol/LNaOH7、pH5,0.2mol/L乙酸缓冲液（0.2mol/LNaAc70ml加0.2mol/LHAc30ml混匀）8、0.2%酸性茚三酮溶液（0.2g茚三酮溶于90ml丙酮中，再加冰乙酸5ml和蒸馏水5ml）9、0.2%茚三酮溶液（0.2g茚三酮溶于100ml丙酮中）10、氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10mg溶于1ml0.1mol/LHCI中。[主要器材]1、沸水浴2、橡皮管3、50ml量筒4、层析柱5、分液漏斗6、分光光度计[操作步骤]（一）树脂的处理100ml烧杯中置约10g树脂，加2mol/LHCI25ml搅拌2小时，倾去酸液，用蒸馏水充分洗涤树脂至中性。加2mol/LNaOH25ml至上述树脂中搅拌2小时，倾去碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于50mlpH4.2柠檬酸缓冲液中备用。 （二）装柱取直径0.8~1.2cm，长度为10~12cm层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至8~10cm高度。在柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH达4.2为止。关闭柱子出口保持液面在树脂表面上1cm左右。在装柱时必须防止气泡、分层现象发生。（三）加样、洗脱及洗脱液收集打开出口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面，关闭出口（不可使空气进入树脂表面）用长滴管将15滴氨基酸混合液加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol/LHCI3ml，以10~12滴/分的流速洗脱。开始收集洗脱液，每管10滴，逐管收存。当HCI洗液刚平树脂表面时，用１mlpH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用２mlpH4.2柠檬酸缓冲液再冲洗柱壁一次，随后继续用pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10~12滴／分，并注意勿使树脂表面干燥。在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集二管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部的剩余pH4.2柠檬酸缓冲液移去。于树脂顶部加入0.1mol/LNaOH2ml，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面操作继续用0.1mol/LNaOH洗脱并逐管收集（注意仍保持流速10~12滴／分），每管10滴。用酸性茚三酮溶液检测，洗脱液中氨基酸是否存在。当第三个氨基酸用0.1mol/LNaOH洗脱下来以后，再继续收集二管茚三酮反应阴性部分。在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法：于10滴洗脱液中加10滴pH５乙酸缓冲液及10滴0.2%茚三酮溶液，沸水浴中煮10分钟，如溶液显紫兰色表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测定。最后以洗脱液各管光密度（以蒸馏水做空白，在570nm波长，读取光密度）或颜色深浅（以—，±，＋，＋＋……表示）为纵坐标，洗脱液管号为横坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。实验十二胡萝卜素的柱层析分离［原理］胡萝卜素存在于辣椒，胡萝卜等植物中。绿色植物中含有许多色素，根据结构不同可分为两大类。吡咯色素类：如叶绿素a、b及脱镁叶绿素等；多烯色素类：如胡萝卜素类。胡萝卜素又分α、β、γ等几种，可用乙醇、石油醚和丙酮等有机溶剂从植物中提取出来，且能被氧化铝(Al2O3)吸附，由于各种胡萝卜素的化学结构不同，它们被氧化铝吸附的强度以及在有机溶剂中溶解度都不相同，故利用氧化铝层析柱可以将植物提取液中混合的胡萝卜素分离出来。［操作］(一)样品为干树叶的提取1、提取液的制备：取干树叶1克，搓碎后放入研钵中，加无水苯10ml，快速充分研磨至提取液呈绿色，用双层纱布过滤入试管中备用。2、层析柱的制备：取直径为1cm，高度为16cm的玻璃层析管，在其底部放置少量棉花，然后将氧化铝直接装入层析柱中约10cm高度，轻轻扣击管壁使氧化铝粉末压实，以防出现断层。装入无水苯使层析柱全部浸透。将管垂直夹在铁架上备用。3、层析： 当层析柱上端的有机溶剂尚未完全浸入氧化铝时，即用吸管吸取提取液沿管壁加入层析柱上端，待提取液全部进入层析柱，立即加苯冲洗，使吸附在柱上端的物质逐渐展开成为数条颜色不同的色带，仔细观察色带的位置，宽度及颜色。(二)样品为干红辣椒的提取1、提取液的制备：取除籽的干红辣椒2克，剪碎后放入研钵中，加5%乙醇4ml，研磨至提取液呈红色，再加石油醚6ml研磨3—5分钟，提取液颜色愈深则表示提取的胡萝卜素愈多，提取液置于40—60ml分液漏斗中，用20ml蒸馏水洗涤数次，直至水层透明为止，借以除去提取液中的乙醇。将红色石油醚层倒入干燥试管中，加少量无水硫酸除去水分，用软木塞塞紧以免挥发。2、层析柱的制备：取直径为1cm，高为16cm玻璃层析管，在其底部放少量棉花，然后装入石油醚—氧化铝悬液，氧化铝即均匀沉积于管内，高度10cm即可，将管垂直夹在铁架上备用。3、层析：打开层析柱下端夹子，使石油醚缓缓流下，当其表面与氧化铝表面相平时，即用细吸管吸取胡萝卜素的石油醚提取液约1cm沿管壁加入层析柱上端，待提取液全部进入层析柱，立即加入含1%丙酮的石油醚冲洗，使吸附在柱上端的物质逐渐展开成为数条颜色不同的色带，即各种胡萝卜素。［注意事项］1.先用高温处理氧化铝以除去水分，提高其吸附力。2.石油醚提取液中的乙醇必须洗净，否则影响吸附，使色带弥散不清。3.在层析过程中分次加入有机溶剂冲洗时，注意连续，防止空气进入形成断层。1.展开剂中丙酮可增强分离效果，但含量不宜过高，以免分离过快，使色带分离不清晰。［试剂］1.干树叶①无水苯②Al2O32.干红辣椒①95%乙醇②石油醚及1%丙酮石油醚 第三部分生物化学综合实验 实验十三脲酶的凝胶过滤分离纯化［原理］脲酶（Urease）分子量较大（490000），当腺酶粗制品通过交联葡聚糖SephadexG-200层析柱时，此酶本身不易进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颖粒。因此，用蒸馏水作为洗脱液，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。定时或定量收集洗脱液，分别在紫外分光光计280nm波长测定其吸光度，以280nm的吸光度为纵座标，收集管号为横座标，绘出脲酶粗制品蛋白质分离的洗脱曲线，再分别测定洗脱峰内各管的脲酶活性，以酶活性为纵座标，收集管号为横座标，绘出酶活性曲线。酶活性与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠的部位即为分离所得到的脲酶所在部位。脲酶活性测定系根据脲酶催化尿素水解释放出氨和CO2的作用。／NH2脲酶C=O＋H2O---------------→2NH3＋CO2，＼NH2用Nessler试剂使氨显色来比色测定，从而计算脲酶活性。／Hg＼NH4OH＋2（HgI2·2KI）+3NaOH→ONH2I＋4KI＋3NaI＋3H2O＼Hg／Nessler试剂黄色化合物（碘代双汞铵）［操作］丨1．凝胶的准备称取Sephadex－2oolg，置于三角烧瓶中，加蒸馏水60ml，于沸水浴中加热5小时（此为加热溶胀；如在室温溶胀，需放置48～72小时）取出，待冷却至室温后装柱。 2.装柱取直径为0.8－1.2cm,长度为45cm的层析玻璃管，底部装上带有细玻璃管的橡皮塞，用尼龙布包好塞紧，垂直夹于铁架上。细玻璃管接上一段细塑胶管，夹好。柱中先加入少量水，充满细玻璃管，并残留部分水于层析玻璃管中。关闭细玻璃管的出口，自顶部缓慢加入溶胀处理过的SephadexG-200悬液，待底部凝胶沉积到1～2cm时，再打开出口，待凝胶上升至离层析玻璃管顶3cm左右即可，再用蒸馏水平衡凝胶柱。根据表4-4凝胶床所能承受的最大水压，调整细塑胶管位置，把SephadexG—200的层析床承受的水压控制在10cm水柱高度，作为操作压（见图⒋－2），否则易使凝胶变形而影响流速及层析特征。在加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉，以免层析床分层，同时防止柱内混有气泡；如层析床表面不平整，可在凝胶表面用细玻璃棒轻轻搅动，再以凝胶自然沉降，使表面平整。3．样品的制备称取lg刀豆粉置于小三角瓶中，加入32％丙酮5ml，振摇10分钟，进行提取，然后倒入离心管中，用32％丙酮lmI洗小三角瓶一次，洗液也倒入离心管中，离心（3000r／min）5分钟，将上清液倒入刻度离心管中，量取体积，加入4倍体积的冷丙酮，使蛋白质沉淀。迸一步离心（3000r／min）5分钟，弃去上清液置回收瓶中。待沉淀中的丙酮蒸发后，加蒸馏水o．8ml，使沉淀溶解。如有沉淀，再离心（300r／min）5分钟，取上清液，为脲酶粗提取液，供凝胶过滤进一步分离纯化。留取0．lml粗提液，用蒸馏水稀释20倍为样品稀释液，用于检测。4．加样加样时先将层析柱下出口打开，使层析床面上的蒸镏水缓慢下流，直到床面将近露出为止（注意：不可使床面干掉，以免气泡进入凝胶。）关紧口。用吸管吸取0．6ml脲酶粗提取液缓慢地沿着层析柱内壁小心加于床表面，尽量不使床面扰动，然后打开出口，使样品进入床内，直到床面重新将近露出为止。再用滴管小心加入lml蒸馏水。这样可使样品稀释最小，而又能完全进入床内。当少置蒸馏水将近流干时，再加入蒸馏水便其充满层析床上面的空间，接上贮液瓶，进行洗脱，洗脱时必须保持床面的平整（有时可在床面上的液体表面加一塑料薄板，以保护床面的平整）。5．洗脱与收集流速是影响物质分离效果的重要因素之一。根据表4－4的数据，凝胶柱的操作压必须控制在10cm水柱以下，流速慢分离效果好，但太慢因扩散而造成峰形过宽，反而影响分离效果，因此把流速控制在3ml／15分钟（5～10滴／分）较好。流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为3ml／管，共约收集12管。6．检测与制图A．蛋白质检测：将所有的收集管分别在紫外分光光度计280nm波长测定其吸光度，以280nm的吸光度为纵坐标，管数为横坐标，在小方格纸上绘制出蛋白质洗脱曲线。同时测定样品稀释液在280nm波长的吸光度，乘以0.75代表其蛋白质含量(mg／ml）。！B·脲酶活性的检测：取试管若干，编号，按上表操作：（无280nm吸光度的收集管不必测酶活性）｜－空白1……..n样品稀释液3%尿素（ml）0.50.50.5 0.1mol/L磷酸缓冲液PH6.8(ml)1.01.01.0370C保温5分钟洗脱液(酶液)--0.50.5无离子水(ml)0.5----370C保温15分钟保温结束，各管中立即加入lmol／LHC10.6ml以终止反应，此为酶促反应液然后另取若干支试管同上述编号，按下表操作，进行显色。空白1……..n样品稀释液酶促反应(ml)0.50.05~0.50.05~0.1无离子水(ml)2.5加至3.0ml加至3.0ml3%阿拉伯胶(滴)222混匀Nessler试剂0.750.750.75立即混匀，在480nrn波长比色、测定其吸光度。*各管用量按下表:A280酶促反应液(ml)<0.10.50.1～0.20.40.2～0.30.30.3～0.40.20.4～0.50.1>0.50.05C．计算及作图根据测得的吸光度从标准曲线查得氨的umol数，然后计算各管中每mI洗脱液每小时保温所能产生的氨的um0l数作为酶活性单位数，以及每管洗脱液中酶活性单位数。以每管的酶活性为纵座标，以收集管数为横座标在方格纸上绘制酶洗脱曲线。试比较上样稀释液及酶活性最高一管的比活性，从而计算酶活性提高倍数。［试剂］1.3％尿素溶液称取3g尿素溶于100ml无离子水中。2.pH6.80.1mol／L磷酸缓冲液称取11.18gK2HPO4∙3H2O和6.9gKH2PO4溶于100ml蒸馏水中。3.1mol／LHCl将12mol／L的浓盐酸用蒸馏水稀释13倍即成。4.Nessler氏试剂于500ml锥形瓶中加入180gKI和100gI2，加水100ml及金属汞140～150g。剧烈振摇瓶中的内容物，使起反应,7～l5分钟至碘的颜色接近消失。以流水冷却锥形瓶，继续振摇，直至溶液呈黄绿色，把溶液倾出倒入大烧杯中，以蒸馏水（无离子）洗涤锥形瓶内的汞，将洗出液事并至烧杯中，并添加蒸馏水至2L体积，放积，放置备用。此即为配制Nessler试剂之母液。于l个5L试剂瓶中，加入10％NaOH液溶3500rnl及750ml上述制备的母液，750ml蒸馏水，混匀。即为Nessler试剂，放置数日待沉淀下沉后，取出上清液供实验使用。Nesseler试剂中的碱浓度很重要，碱浓度不淮会在使用时发生混浊或沉淀，因此应经过滴定。可用20mIlmol／L标准HCl与Nessler 试剂滴定，最佳终点（以酚酞作指示剂）应消耗Nessler试剂11～11．5ml，如碱太多，可用6mol／LHCl调节。5.32％丙酮溶液32ml丙酮加蒸馏水至100ml。6．3％阿拉伯胶称取3g阿拉伯胶，先加50ml蒸馏水，加热溶解，最后加蒸馏水至100ml刻度。7.0.02mol／L标谁硫酸铵溶液的配制取分析纯（NH4）2SO4‘置110℃烘箱内烘3个小时，取出后置干燥器内冷却，精确称取干燥（NH4）2SO4132mg，置于100ml溶量瓶中，加重蒸水若干，使其溶解，再以重蒸水稀释至刻度，即为0.02mol／L标谁硫酸铵溶液（母液）。8.0.002mol／L标淮硫酸铵溶液的配制取0．02moI／L硫酸铵标准液10ml至100容量瓶中，用水稀释至刻度，即为0.002mol／L（NH4）2SO4的应用液。［思考题］1．交联葡聚糖的结拍特征及其代号的意义是什么？2．为什么交联葡聚糖代号中G越大，承受水压愈小？如果要加强分离效果使流速加快，对胶粒的性质有何要求？3.比较分子筛层析与盐析或有机溶剂分离蛋白质的优缺点。附：硫酸铵标准曲线的制备：取试管7支、编号。按下表操作。12345670.002ml／L(NH4)2SO4(ml)0.10.20.30.40.50.6含NH3的umol数0.20.40.60.81.01.2重蒸水（ml）2,92.82.72.62.52.43.03％阿拉伯胶（滴）2222222混匀Nessler试剂（ml）0.750.750.750.750.750.750.75加Nessler试剂后，立即混匀。在480nm波长处比色。以测定得到的吸光度为纵座标，所含NH3＇的umol为横座标，绘制标准曲线。实验十四血清蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳［原理］蛋白质为两性电解质，当溶液处于某pH值时蛋白质游离成正负离子的趋势相等，此时蛋白质在电场中的迁移率为零，该溶液的pH值为该蛋白质分子的等电点(pI)，凡是碱性氨基酸含量多的蛋白质，其等电点偏碱，含酸性氨基酸较多或含其他酸性基团较多的蛋白质，其等电点偏酸，人体体液中的蛋白质等电点多数在pH5.0左右。在等电聚焦电泳时，通常是在电泳管的正负极之间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合液(载体)经电场作用，建立从正极向负极渐次增高的pH梯度。如果电泳槽中引入一组等电点相同的蛋白质分子。在电场作用下，无论它们的原始分布如何，最后都会聚集在梯中pI1、pI2、pI3、pI4……pIa的蛋白质混合物引入pH梯度中，在电场作用下，经一定时间，混合物中各个蛋白质即会分别聚集在pH等于各自pI的区域，形成分离清晰的蛋白质区带。 当等电点彼此接近的一系列两性电解质引入电泳槽，并在电泳槽的正极槽中注入酸，负极槽中注入碱，在电泳开始前，两性电解质混合物的pH为其平均值，电泳槽各段pH值相等。电泳开始后，pH最低的两性电解质(等电点pI1)带负电荷，向正极移动，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或低于这个两性电解质的pI，以致这个两性电解质不能再向前移动而逗留于此，由于两性电解质具有一定缓冲能力，则使周围一定区域内介质的pH保持着它的pH范围。同样，pH稍高的第二种两性电解质(等电点pI2、pI2＞pI1)也向正极移动，由于pI2＞pI1，它定位于pH低的两性电解质之后，并使其定位区周围的介质pH保持在它的pH范围，依次类推，经过足够时间后，两性电解质混合物中的各成分依等电点递增次序，从正极到负极排成一个pH梯度，如果两性电解质的成分很多，且彼此pH十分接近，则可形成几乎是线性的连续pH梯度。在此梯度中蛋白质混合物的成分，经聚焦作用，将会分布于pH中各自等电点的部位。从而得到非常清晰的分离区带。建立这种稳定的pH梯度的两性电解质以Ampholinc为最好。［操作］1.凝胶的制备：试剂量丙烯酰胺，双丙烯酰胺溶液1.33ml尿素20%Ampholine去离子水TEMED血清5.5ml0.5ml3.15ml10μml0.2ml混匀置于30℃水浴中，待尿素溶解10%过硫酸铵0.2ml混匀后，分别灌注玻璃管中至4/5高度，然后在液面上轻轻加覆盖液约1cm，待成胶后，吸弃覆盖液约1cm厚，将试管插入电泳槽。2.电泳：下槽加0.01mol/LH3PO4，上槽加0.02mol/LNaOH，检查各电泳管两端无气泡后，通电，上负下正。开始时调节电流每管3～5V电压连续通电3小时，停止电泳。3.剥胶：取下胶管，将带有10cm长针头的注射器充满水，把针头插入胶柱与管壁之间，边注水边旋转玻璃管，使胶柱与管壁分开，然后用洗耳球将胶柱轻轻吹出。4.将胶柱置于12.5%三氯乙酸溶液中固定1小时，并多次换液。5.固定后进行染色与脱色，保存于10%乙酸中。［试剂］1.丙烯酰胺及双丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺28.4g，双丙烯酰胺1.6g，加蒸馏水溶解成100ml。2.20%Ampholine(pH3—10)。3.10%过硫酸胺(用前现配)。4.TEMED(四甲基乙二胺)。5.尿素。6.覆盖液：Ampholine0.5ml，尿素3.0g，加蒸馏水至100ml。7.0.02mol/LNaOH。取0.8gNaOH加水至1000ml。8.0.01mol/LH3PO4。取浓H3PO40.67ml加水至1000ml。9.人血清，血清中加1/3体积50%甘油加少量0.5%溴酚兰。约1/6)。 10.染色液：取考马斯亮兰R-250，1.25g加无水乙醇225ml，冰醋酸50ml，加水至500ml。11.脱色液：染色液中除去染料。12.固定液：12.5%三氯醋酸。［思考题］1、为何等电聚焦电泳时电流会逐渐下降而接近于零?2、在等电聚焦电泳时，两性电解质载体有何作用?3、如配好凝胶后再滴加血清样品进行电泳，结果是否相同?说明理由。4、与醋酸纤维素薄膜电泳比较，聚丙烯酰胺电泳有何优点?实验十五质粒DNA的微量快速提取与鉴定[目的及要求]1．了解质粒作为载体在基因工程中的应用。2．熟记提取质粒的基本原理，学习提取过程和方法。[实验原理]基因工程诞生于1973年。在这一年。斯坦福大学的S。Cohen等人将大肠杆菌的抗四环素质粒PSC101和抗新霉素及磺胺的质粒R6-3在体外用EcoRI进行切割，并把他们连接在一起形成一新的重组质粒：然后，将此重组质粒转化到大肠杆菌中。结果，在含有四环素和新霉素和新霉素的平皿中，筛选出了抗四环素和新霉素的重组菌落。这是第一次实现重组体转化成功的例子，基因工程从此诞生。目前，基因工程已成为分子生物学的一个重要领域，但对其还没有一个统一的公认定义。一般认为基因工程是指：在体外，将核酸分之（无论采取什么方法从细胞中取得）组合到任何病毒、细菌质粒或其它载体系统（分子）中，形成遗传物质的新组合，并使之进入原来没有这类分子的宿主体内，而能持续稳定地繁殖。基因工程的最大特点使以重组DNA技术开辟了在短时间内改造生物遗传性状的新天地。基因工程的研究内容如下：1．目的基因的获取。2．克隆载体的选择与改建。3．目的基因与载体的连接。4．重组DNA导入受体细胞。5．重组体的筛选。6．设法使目的基因实现功能蛋白的表达。基因工程的重要环节就是如何把外源基因导入到受体细胞中去。外源基因自己很难进入受体细胞中，既是进入受体细胞中，一般也不能进入复制和表达。这是因为我们得到的目的基因不带有复制子系统和表达调空系统，所以我们必须利用运载工具即载体将外源基因导入到受体细胞中去。质粒就是一种最常用的载体。他是染色体以外的能自主复制的双莲、闭合、环状DNA分子。广泛存在于细胞中，在一些动、植物细胞中也发现有质粒存在。作为载体的质粒必须具备以下六个特点：（1）能自主复制：（2）具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能：（3）具有1-2个筛选标记：（4）分子量小，多拷贝，易于操作：（5）是非结合性质粒即不含有结合转移基因，在自然条件下不能从一个细胞转移到另一个细胞中去：（6）转化效率高。本次实验是从大肠杆菌中提取和纯化质粒，以备进一步研究之用，其原来如下：从大肠杆菌中提取和纯化质粒的方法很多，但不外乎三个主要步骤即细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒的分离和纯化。 1．细菌的培养挑单个菌落接种到适当培养基中培养。通常以细菌培养夜的O。D600nm值来判断细菌的生长状况，一般情况下，O。D600nm=0。4时，细菌处于对数生长期：O。D600nm=0。6时细菌处于对数生长后期。由于质粒在细菌内进行复制时，往往受到宿主的控制，因此在对数生长后期可进入氯霉素。氯霉素可抑制细菌的蛋白质生物合成和染色体DNA的复制，而质粒的复制不受其影响而得以大量扩增。对于新一代的质粒如pUC质粒系列，由于宿主对其复制控制不严，所以添加氯霉素已不十分必要。使用氯霉素的目的是，在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和数量以降低细菌裂解物的复杂性和粘稠度。2．细菌的收集和裂解细菌在生长过程中，会将大量代谢物排到培养液中。为提高质粒的纯度，往往通过离心弃除培养液，在将细菌沉淀适当干燥或用缓冲液漂洗1~2次，以便尽量将培养液去除干净。裂解细菌的方法很多，如SDS法、裂解法、煮沸法等。它们各有利弊，应根据所提质粒的性质、宿主菌的特性及纯化质粒的方法等因素加以选择。本实验采用碱裂解法。首先破坏细菌的细胞壁：再用SDS使细胞膜崩解，与此同时用NaOH提高溶液的pH值，使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。3．质粒的分离和纯化往第二步溶液中加入酸性溶液使裂解液的pH值恢复到中性，此时，质粒可复性并恢复原型，而染色体DNA仍处于变性状态。经离心，染色体DNA与细胞碎片一起沉淀。然后，再用酚、氯仿等蛋白质变性剂去除蛋白质，用Rnase去除RNA，即可得到质粒的粗制品。以后，可用超离心法、电泳法、离子交换层析法或排组层析法等进一步纯化质粒。[仪器与消耗]1.仪器：YXQ-SG41-280型电热手提高压锅、HZ-C恒温空气震荡器、5415D型台式高速离心机、WH-861型旋涡混匀器、SIN-F123颗粒型制冰机、SC-326冰箱、可调式移液器。2.耗材：含有重组质粒（pUC18/GAPDH）的菌株（HB101）Eppendorf管、吸[步骤]1.酶切：20μl酶切体系（按下表加试剂）质粒DNA10╳酶缓冲液EcoRI(15u/μL)BamHI(15u/μl)双蒸水实验组16μL2μL1μL1μL10μL实验组26μL2μL1μL11μL对照组6μL2μL—--12μL混匀，37℃水浴1-2小时。2.向上述个反应管中，分别加入4μL6×上样缓冲液。3.电泳：①将1%浓度的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mlEB）铺于水平电泳槽上，并插上梳子。②待凝胶凝固，将梳子拔出。往电泳槽中注入0.5×TEB缓冲液，直至刚没过凝胶。③按以下顺序上样：1道2道3道4道DNA分子量标准（Marker）对照组样品（未酶切质粒）实验组1样品实验组2样品④将加样一端接上负极，另一端接上正极，电场强度5V/cm，待溴酚蓝移动到接近正极一端停止电泳。⑤将凝胶移至黑暗处，用紫外灯观察电泳结果。[试剂] 1.EcoRI（15u/μL）2.BamHI（15u/μL）3.5×TBE（pH8.3电泳缓冲液）Tris5.4g硼酸2.25gEDTA0.46gddH2O2定容至100ml4.1%琼脂糖：琼脂糖1g，0.5×TBE100ml。5.6×上样缓冲液：50%甘油，1×TBE，0.5%溴酚蓝,0.5%二甲苯青6.溴化乙锭（EB）：0.5mg/ml质粒DNA实验十六多聚酶链式反应（PCR）技术PCR（PolymeraseChainReaction聚合酶链反应）是一种在体外大量扩增特意DNA片段的分子生物学技术。其利用合成的两段已知序列的寡核苷酸作为引物，将位于两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环，是模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在医学、分子生物学领域得到广泛应用，可用于DNA扩增、DNA克隆、突变分析、基因融合、基因定量、遗传性疾病的诊断等。PCR技术与其他分子生物学技术相结合产生的反转录PCR（RT-PCR）、反向PCR（IPCR）、单引物PCR、不对称PCR等技术使PCR在科研及临床上的应用得到更大的发展。[实验原理]（一）PCR反应过程分三步：变性、退火、延伸，如图所示：（二）步骤1.模板变性此步目的是：使双链模板DNA解离为单链结构。变性温度一般为92~96℃ 。温度和时间视模板DNA的复杂性、热循环仪的种类和反应的体积而定。对G-C含量高的DNA序列，需加入甲酰胺、二甲基亚砜（DMSO）、甘油（降低Tm值，破坏DNA间二级结构）或延长变性时间等，以提高变性效率。但过高的温度和过长时间可对Taq酶和dNTP造成损害。2.引物退火此步目的是：引物与模板互补成双链。退火温度一般为55℃左右（即Tm-5℃），温度和时间视引物与靶序列的同源程度和碱基组成而定。在Tm允许范围内，选择较高的退火温度可减少引物与模板间的非特异结合。注：由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。3.延伸此步目的是：在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。延伸温度一般为72℃，温度视所用DNA聚合酶而定，时间视产物的长度而定。一般1Kb以内的片段，延伸时间为1分钟；扩增10Kb片段时延伸时间为15分钟。4.循环次数为25~30次，循环次数越多，非特异产物越多。最后72℃延伸3~10分钟（目的是增加产物量，即将合成一半的DNA片段合成完毕）。（三）反应体系模板DNA：102~105拷贝（100μl体系）DNA引物（一对）：浓度一般为0.1~1μmol/L，浓度偏高回引起错配和非特异扩增。dNTP：dATPdGTPdCTPdTTP20~200μmol/L，浓度↑，则酶促反应速度↑，但同时也增加了碱基的错误掺入率和实验成本。Mg2+：浓度应超过dNTP（因为dNTP可与Mg2+结合），一般为1.5~2.0mmol/L，具体视Taq酶而定。过量会增加非特异扩增，并影响产率。10×PCR缓冲液：维持pH恒定。其中，明胶或BSA对酶具有一定保护性，Kcl可促进引物退火。Taq酶：0.5~1U，具体视扩增片段大小和复杂程度而定。如浓度过高，可引起非特异扩增。注：1.反应体系通常在20μl~100μl之间。如体积过小，则产物的量不足以进行下一步操作和分析；如过大，则加热和冷却效率不够高，即液体达到规定的温度时所需时间较长。2.封上石蜡油防止高温反应是液体挥发（一些较先进的PCR仪无需此步）。[注意事项]1.模板的质量和数量在PCR中至关重要，因为①产物的大小由模板质量和反应条件而定（尤其是长片段PCRXL-PCR）；②过多的模板可能防碍扩增。2.目前随着PCR的广泛使用，最严重的问题是靶序列的污染（假阳性）。防止污染的措施：①物理隔离：将实验室分为样品制备、前PCR区、后PCR区（最好在超净台中进行）。②加入UDG（尿嘧啶N-糖苷键，广泛存在于所有细胞内，负责清除DNA中由胞苷脱氢而生成的尿苷。）：在PCR中可用dUTP代替dTTP或在引物合成过程中，用dUTP代替dTTP。这样在进行PCR前，往反应体系中加入UDG，使其破坏残留的PCR产物。UDG可通过加热灭活。3.热启动；可防止在低温时进行非特异扩增，因Taq酶在低温时（即加完各成分后至PCR仪升至变性温度的一段时间内）仍有一些活性。具体做法是：①在第一轮循环中，当温度升至75~80℃时保持1分钟，然后加入Taq酶。本法仅适用于对少量样本进行操作。②用蜡层将反应成分分隔为上、下两部分，当温度到达蜡层的融点（75~80℃）时，保持3~5分钟，蜡层即可完全融化。两部分反应成分充分混合，组成完整的反应体系。4.在循环参数中，退火温度的选择尤其重要。PCR的最优条件，最终应凭经验而定。触减PCR（touchdown-PCRTD-PCR）或步减PCR（stepdown-PCRSD-PCR）采用一个从高到低的退火温度范围，并以1℃的幅度下降。共有10~20的落差，其中在每个温度上进行两个循环。SD-PCR是对TD-PCR的改进，较为简便，更适用于简并引物或引物有3~5个碱基与模板不配对的情况。但其应用不如TD-PCR广泛。更多的循环次数可能导致产物的降解和高分子量产物拖尾现象（因为Taq酶具有5，-3，外切酶活性）。TD-PCR的步骤：①94℃变性1分钟，各温度下退火2分钟，74℃延伸3分钟。② 退火温度自55℃开始以1℃降至41℃，每个温度进行2个循环。共15个温度梯度，需30个循环。③然后以40℃为退火温度进行10个循环，最后74℃延伸7分钟，以提高产率。注：①如未出现扩增产物，可将退火温度范围下移5℃，重新进行。或将TD-PCR产物稀释100~1000倍后进行常规PCR或巢式PCR。②必须使用热启动方法。5.引物设计是进行PCR反应前的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。现在多利用计算机软件辅助设计。本实验以人3-磷酸甘油醛（GAPDH）基因中一段300bp的DNA片段作为模板进行扩增，引物5，末端引入限制性内切酶位点，为以后DNA的重组做准备。[实验仪器]1.仪器：基因扩增仪（PCR仪）、台式冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、恒温水浴箱、紫外分光光度计、紫外检测仪（手提式紫外灯）、制冰机、可调式取样器、取血用具2.耗材：0.5ml几1.5mlEppendorf管（Ep管）、tip头若干个。[试剂]1.红细胞裂解液（RCLB）：10mMNaCL，5mMMgCL2，10mMTris-CL（pH7.6）2.白细胞裂解液（WCLB）：5mMNaCL，10mMEDTA，10mMTris-CL（pH7.6），用前加1/50体积的10%SDS和1/200体积的蛋白酶K（200mg/ml）3.四种dNTP混合液（25mM）4.引物5.TaqDNA聚合酶/10×Taq酶缓冲液6.Tris平衡酚7.氯仿8.3M乙酸钠（pH5.2）9.TE溶液：10mMTris-CL，1mMEDTA（pH8.0）10.质粒提取液（TELT）：2.5MliCL，50mMTris-CL（pH8.0），62.5mMEDTA，4%TritonX-10011.其他试剂：10mg/ml溴化乙锭（EB）水溶液，5×TBE电泳缓冲液，6×上样缓冲液，DNA分子量标准，液体石蜡，75%乙醇，无水乙醇，琼脂糖，抗凝剂。[操作步骤]（一）模板DNA的制备：1.从白细胞中提取DNA（1）裂解红细胞：取0.6ml人抗凝血至1.5mlEp管中，加入0.9ml预冷的RCLB，混匀，冰浴15分钟，其间颠倒混匀四次，4℃5000rpm离心10分钟，吸弃上清，向沉淀中加入1.5mlRCLB，混悬沉淀，冰浴10分钟，其间颠倒混匀三次，再离心，去尽上清。（2）裂解消化白细胞：将沉淀重悬于0.4mlWCLB中，55℃保温3小时（3）提取DNA：假如0.4ml酚/氯仿（1﹕1），混匀，4℃5000rpm离心5分钟，转移上清至干净的1.5mlEp管中，加入等体积的氯仿再抽提一次。上清加入1/10体积的3M乙酸钠，2.5体积无水乙醇，混匀，4℃，12，000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml75%乙醇漂洗一下后晾干。待乙醇挥发尽后，加入100μlTE溶液，室温过夜溶解DNA。（4）DNA浓度测定：取20μlDNA溶液加入1ml双蒸水中，用紫外分光光度计测260nm和280nm波长处的光密度值，计算260nmOD/280nmOD的比值，以260nmOD值1相当于50μgDNA，计算出DNA的含量。2.从克隆好的菌株中提取模板DNA。 （1）将冻存的喊GAPDH/PUC质粒的菌株按1%的浓度接种于含AMP60μg/ml的LA培养液中37℃摇过夜培养。（2）取1.5ml菌液至离心管中，4℃，8000rpm离心5分钟，弃上清；（3）向沉淀中加入400μlTELT试剂，充分混悬（时间不要过长）；（4）再加入400μl酚/氯仿。混匀（用手摇），置10分钟；（5）4℃，10，000rpm离心10分钟；（6）转移上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟；（7）4℃，12，000rpm离心10分钟，弃上清；（8）加入1ml75%乙醇，漂洗沉淀，4℃，12，000rpm离心5分钟，弃上清；（9）待DNA干燥后，加入适量TE，溶解待用。（一）PCR反应及产物鉴定：1.取两只0.5mlEp管，分别加入下列试剂试剂实验管对照管10×TaqDNA聚合酶缓冲液5μl5μldNTP混合液1μl1μl引物11μl1μl引物21μl1μl模板DNA1μl—双蒸水40μl41μl2.预变性：短暂离心，将液体收集于管底，置于沸水浴中5~10分钟，冰浴冷却；3.加入1μlTaqDNA聚合酶（1U/ul）；4.混匀后短暂离心，将液体收集于管底，加入50μl液体石蜡；5.将离心管移入PCR仪，设置PCR反应参数为：变性94℃30秒退火55℃30秒延伸72℃45秒6.进行30次循环，然后72℃延伸10分钟。7.PCR产物电泳鉴定：制备含1μg/mlEB的1.0%琼脂糖凝胶，铺板，取10μlPCR产物，加入2μl6×上样缓冲液，上样后于14V/cm电压电泳1小时，用紫外检测仪检查并分析结果。[注意事项]1.使用酚和氯仿是注意勿腐蚀皮肤几取液器口。2.制备基因组DNA时避免剧烈操作，以免损伤大分子DNA。3.DNA干燥时不宜过干，否则很难溶解。4.PCR反应操作中注意防止污染。实验十七蛋白质印迹分析（WesternBlot）[目的及要求]1．掌握蛋白质印迹分析的基本原理。2．学会蛋白质印迹分析的基本操作。[实验原理] 蛋白质印迹免疫分析是以某种抗体作为探针，使之与附着在固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。这一技术将蛋白质凝胶电泳分辨率高与固相免疫测定特异性强的特点结合起来，是一种重要的蛋白质分析测试手段。具体过程包括：蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质调带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白的抗体作为探针与之结合，最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（125I标记的A蛋白或抗免疫球蛋白、与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。本实验以在原核细胞中诱导表达的GST－鸡生肌素融合蛋白作为待检胆白，将诱导后的菌体蛋白经SDS-PAGE电泳后，以鼠抗鸡生肌素单克隆抗体作为一抗，碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG作为二抗，对生肌素的表达情况进行检测。[仪器与材料]仪器：YXQ-SG41-280型电热手提高压锅、DYY-III6B电泳仪、DF-8A垂直版电泳槽、VDS型凝胶摄像系统、GDS-100真空凝胶干胶仪、DYY-III7B转移电泳仪、转移电泳槽、封口机、恒温水浴、杂交箱、子外交联仪、恒温摇床、微量加样器、可调式取夜器、电炉、平皿、滴管、50ml烧杯、吸量管、剪刀等。材料：诱导前菌体蛋白、诱导后菌体蛋白(在实验十七《克隆化基因在大肠杆菌的诱导表达》中，由学生自己制备)，硝酸纤维素膜（NC膜），一次性手套，杂交袋、滤纸、吸水纸、1。5mlEp管、吸头管。[试剂]1．30%丙烯酰胺储存液2．10%SDS溶液3．10%过硫酸铵溶液4．TENED（N，N，N，N，-四甲基乙二胺）5．0。5Mtris-Cl（PH6。8）6．1。5Mtris-Cl（PH8。8）7．1mg/mlDTT8．电极缓冲液：1。44%甘氨酸，0。3%Tris-Cl，0。1%SDS9．2X蛋白质上样缓冲液：4%SDS，20%甘油，100mMTris-Cl（pH6。8），2%溴酚蓝。10．电转阳性缓冲液I：0。3Mtris-Cl，20%甲醇11．电转阳性缓冲液II：25mMTris-Cl，20%甲醇12．电转阴性缓冲液：0。04M甘氨酸，0。5mMTris-Cl，20%甲醇13．TBS：150mMNaCl，50mMTris（pH7。5）14．封闭液：TBS+5%脱脂奶粉+0。1%Tween2015．碱性磷酸酶缓冲液（TSM）：100mMNaCl，5mMMgCl2，100mMTris-Cl（pH9。5）16．NBT（氮蓝四唑）溶液17．BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸）溶液18．染色液：0。25g考马斯亮蓝，45mlddH2O，10ml冰乙酸19．脱色液：45ml甲醇，45mlddH2O，10ml冰乙酸20．蛋白分子量标准21．鼠抗鸡生肌素单克隆抗体22．碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG[操作步骤]（四人一组）（一）SDS-PAGE电泳1．安装垂直板电泳装置，用1%琼脂糖凝胶封住底边及两侧。 1．配胶：（1）10%分离胶：30%丙烯酰胺储存液3。33ml1．5Mtris-Cl（pH8。8）2。5ml10%SDS0。1ml10%过硫酸铵0，1mlddH2O4。0ml混匀后，加入5ulTEMED，立即混匀。灌入安装好的垂直夹层玻板中至距玻璃板顶部3cm处，立即加盖一层蒸馏水，静止。待分离胶聚合后（约20分钟），去除水相，灌入浓缩胶。（2）5%浓缩胶：30%丙烯酰胺储存液0。83ml0.5％Mtris-Cl(pH6。8)1.25ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlddH2O2.8ml混匀后，加入3ulTEMED,立即混匀。灌入垂直夹层玻板顶端，插入梳子，静置（注意：整个灌胶过程一定要避免混入气泡）。待胶聚合后，将凝胶固定于电泳装置上。上、下槽各加入电极缓冲液，拔去梳子，用电极缓冲液冲洗加样孔。3.样品处理取两支Eppendorf管，分别加入诱导前菌体蛋白和诱导后菌体胆白各20ul,再各加入20ul2×上样缓冲液和4ulDTT，混匀，煮沸3分钟，短暂离心。4.上样：按下表顺序加样：12345671×上样缓冲液诱导前菌体蛋白诱导后菌体蛋白蛋白质分子量标准诱导前菌体蛋白诱导后菌体蛋白1×上样缓冲液2012012012012012012015.电泳：接通电源，将电压调至80V.当溴酚蓝加入分离胶后，把电压提高到150V,电泳至溴酚蓝距离底部1cm处，停止电泳。（二）蛋白质转膜1.取下胶板，小心去除一厕玻璃板，切去浓缩胶和分离胶无样品部分，将凝胶分成两半，含分子量标准的部分用考马斯亮蓝染色。2.测量剩余胶的大小，按该尺寸剪取一张硝酸纤维素和六张滤纸。3.硝酸纤维素膜用三蒸水浸润后，在阳极缓冲液II中浸泡3分钟。4.在半干式电转移槽中由阳极至阴极依次安放：（1）阳极缓冲液I浸湿的滤纸2张（2）阳极缓冲液II浸湿的滤纸2张（3）硝酸纤维素膜（4）凝胶（5）阴极缓冲液浸湿的滤纸2张注意：各层之间千万不要存有气泡。5.接通电源，15V0.8mA/cm2)转移2～3小时。（三）封闭 将转膜后的硝酸纤维素膜在TBS中漂洗一下，放入装有封闭液的平皿中，室温下轻摇1小时，中间更换一次封闭液。（一）一抗结合1.将滤膜放入杂交袋中，封好三面。2.按0.2ml/cm2加入封闭液和鼠抗鸡生肌素单克隆抗体（1:1000稀释）3.杂交袋封严后，置40C摇动过夜。（二）二抗结合1.剪开杂交袋，取出滤膜，用封闭液漂洗三次，每次10分钟。2.将滤膜再放入杂交袋中，封好三面。3.安0.2ml/cm2加入封闭液和碱性磷酸酶偶联羊抗鼠IgG.4.杂交袋封严后，室温下，轻摇1小时。（三）显色反应1.取出滤液，用TBS漂洗三次，每次5分钟。2.将滤膜放入碱性磷酸酶缓冲液中短暂漂洗3.配制显色液：碱性磷酸酶缓冲液10mlBCIP35lNBT45l加入显色液，室温避光显色30分钟左右。显色至满意程度的NC膜经水冲洗终止反应，对照分子量标准分析结果。六、注意事项1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道吸入，操作时要注意防护。2．蛋白加样量要合适，加样量太少，条带不清晰：加样量过多，则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖相邻泳道。3．电泳时电压不易太大，否则玻璃板会因受热而破裂。4．电转移时，滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。5．显色液临用前新鲜配制。七、思考题1.SDS-PAGE电压时，电压为何不易太大？2.电转移应注意那些问题？3.蛋白质印迹结果如何定量分析？实验十八碱性磷酸酶比活性测定酶的提取纯化是酶学实验的基本技术。因为酶的本质是蛋白质，因此酶的分离提纯方法常采用分离提纯蛋白质的方法。无论是分离提纯酶还是蛋白质，制备的原料必须新鲜，该酶含量必须丰富。对于体液中的酶一般可直接提取，而组织细胞内的酶则必须先破碎细胞，然后再再用一定的试剂提取，目前用于破碎组织细胞的方法主要有玻璃匀浆管、组织捣碎器、分散器、超声波等机械破碎法，或低渗、酶消化、冻融、有机溶剂、去垢剂处理的化学法等。细胞破碎后，分离纯化酶或蛋白质来取何种方法，主要根据该蛋白质的物理化学性质来决定。一般采用中性盐沉淀法（如硫酸铵盐析等）、有机溶剂沉淀法（如乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇等提取）、层析法（如离子交换层析、吸附层析、分子筛层析、亲和层析等）、电泳法（制备型）聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶等电聚焦电泳等）。通常要多种方法配合使用，才能得到纯净的蛋白质或酶。 一般来说，在分离纯化的最初阶段，采用比较粗而筒单的方法，而在后期采用高分辨率而费时的方法。而中性盐沉淀法是一种比较粗的分离法，可从大量的材料中对酶或蛋白质进行初步分离，但是由于含盐多，分离后需要进行透析。而柱层析与电泳不能用于大规模的制备，因此这一类方法往往放在分离纯化的后阶段。但是如果能够一开始就采用高分辨率的方法，如亲和层析法，那么一下于就可除去大量杂质，而且可使样品体积大大缩小。因此究竟采用何种方法还得根据具体情况来确定。在分离纯化酶的过程中，一个非常困难而十分重要的问题就是要保护酶的活性。不使酶在纯化的过程中失活，因此，酶提取纯化时一定要注意以下问题：1．pH在相当多的情况下，酶的作用的最适pH不一定就是酶最稳定的pH。两者可能相差1个或1个以上的pH单位。根据不同的情况选择合适pH和合适缓冲容量的缓冲溶液，对于稳定酶是十分重要。2．温度一般来说，在0℃时，酶比较稳定，所以提取纯化酶的操作都是在0～4℃进行（如用有机溶剂沉淀法应预先将有机溶剂预冷，因其提取时会产生大量的热）。但也有例外，如丙酮酸羟化酶，在0℃时，很不稳定，而在26℃时最稳定。有些酶可能需要温度低至－20℃或－70℃才能保留其活性，也有些酶溶液经冻融处理往往是十分有害的。3．氧化通常大多数酶和蛋白质含有相当数目的游离巯基，这些巯基中可能有一个或一个以上是属于必需基团的。如果这些巯基被氧化，形成分子内或分子间的二巯键，常常导致酶活性的丧失。在酶纯化过程中，要防止巯基的氧化，一些还原性化合物如β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等，在提取液中含有10-4～5×10-3mol／L浓度的这些化合物，就能有效地防止酶蛋白中巯基的氧化。4．强金属离子的污染巯基除了可被氧化以外，还可能与铅、铁、铜等重金属离子起作用而丧失其酶活性。这些重金属离子的主要来源是所使用的试剂、配试剂采用的蒸馏水、透析时采用的透祈袋，离子交换树脂等。所以提取纯化酶时配制试剂所用的水最好是无离子水、或是重蒸馏水。在试剂和离子交换树脂中的重金属离子，可以加入1～3×10-4mol／L的EDTA（乙二胺四乙酸）来螫合这些重金属离子，透析袋也可用0.5mol／LEDTA溶液处理。通常在提取液中也常加入小量的EDTA，以螫合纯化过程中可能混入的重金属离子，来保护酶分子上的巯基。5．蛋白酶的污染在酶的纯化过程中，另一个难题就是蛋白酶的污染。在细胞破碎后，细胞内的蛋白酶会从溶酶体中释放出来，有可能水解破坏所要分离的酶。因此，为了防止蛋白酶的破坏作用，在纯化过程中常使用一些蛋白酶的抑制剂来保护纯化的酶，常用的蛋白酶抑制剂有PMSF（苯甲基磺酰氟化物）、DFP（二异丙基氟磷酸）或胰蛋白酶抑制剂等。但是，有些抑制剂不仅抑制了蛋白酶，而且还有抑制其它各种各样酶的副作用，必须小心使用。6.介质的极性和离子强度在纯化酶的过程中，必须根据酶的性质来选择所用的介质。由于有些酶要求为疏水的环境，可以用蔗糖、甘油等，使溶液的极性降低，则能成功地把这些酶保存在溶液中，常用的浓度一般为1％～10％（v／v）。但适宜的浓度必须通过探索试验来确定。另一方面亦有少数酶需要高离子强度的极性介质才能保持其活性，可采用KCl、NaCl、NH4Cl或（NH4）2SO4等来提高溶液的离子强度。一、硷度磷酸酶（AKP，Alkalinephosphatase）的提取和分离［原理］ 本实验采用有机溶剂沉淀法从肝或肾组织匀浆中提取分离碱性磷酸酶（AKP）。利用乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以降低酶的溶解度，系通过降低介质的介电带数及其对酶蛋白的脱水作用而致。由于降低了溶液的介电常数，带有相反电荷的酶蛋白表面残基之间的吸引力增加，导致酶蛋白凝集而易从溶液中沉淀出来。此类有机溶剂也溶解于水，与水分子结合，于是导致蛋白质的脱水作用，进一步加强酶蛋白沉淀祈出。在制备肝匀浆时采用低浓度醋酸钠，可以达到低渗破膜的作用，而醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用。匀浆液中加入正丁醇能便都分杂蛋白变性，再通过过滤而除去。含有AKP的滤液中再进一步用冷丙酮和冷乙醇进行分离纯化。裉据AKP在终浓度33％的丙酮或终浓度30％的乙醇中是溶解的，而在终浓度50％的丙酮或终浓度60％的乙醇中是不溶解的牲质，采用离心的方法重复分离提取，可使AKP得到部分纯化。因为在室温下有机溶剂能使大多数酶失活，因此要注意分离提纯实验必须在低温下进行。有机溶剂应预先冷却，加入有机溶剂时要慢慢滴加，并充分搅拌，避兔局部浓度过高或放出大量的热，以致酶蛋由变性。有机溶剂法析出的沉淀一般容易在离心时沉降，因此可采用短时间的离心以分离沉淀，最好立即将沉淀溶于适量的冷水或缓冲液中，以避免酶活力的丧失。另外，有机溶剂法进行分离时，除应注意pH值及蛋白质浓度外，溶液的离子强度也是一个重要因素，一般在离子强度0.05或稍低时为好。［提取、分离的操作步骤］1．称取2g新鲜免肝或lg肾剪碎后，置于刻度离心管中，以下按每g组织操作，加入0.01mol／L醋酸镁—0.01mol／L礴酸钠溶液3ml，在电动匀浆器上中速匀浆3～4分钟，或用组织捣碎30秒，共2次：记录其体积。吸出0.1ml（A液）置另一试管中，在此试管中加1.9mlPH8.8Tris缓冲液稀释，待测比活性用。2．加lml正丁醇于匀浆液中，用玻棒充分搅拌2分钟左右，然后在室温中放置20分钟。到时间后用单层尼龙布过滤，滤液置于刻度离心管中。3．滤液中加入等体积的冷丙酮，立即滤匀后离心（2000r／min）5分钟，将上清液倒入回收瓶中，在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2ml，用玻棒充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积。此时吸取0.1ml（B液）置于另一试管中，在此试管中加入pH8.8Tris缓冲液1.9ml，待测比活性用。4．溶解的悬液中缓缓加入冷95％乙醇，使乙醇最终浓度达30％，混匀后立即离心（2000r／min）5分钟，将上清液倒入另一离心管中，弃去沉淀。在上清液中加入冷95％乙醇，使乙醇最终浓度这60％，混匀后离心（2500r／mln）5分钟，上清液倒入另一回收瓶中，沉淀中加入0.01mol／L醋酸镁—0.01mol／L醋酸钠2ml，充分搅拌，使其完全溶解。5．重复上操作：在悬液中缓缓加入冷95％乙醇，使乙醇最终浓度送30％，混匀后离心（2000r／min）5分钟，将上清液倒入另一离心管中，弃去沉淀。上清液中加入冷95％乙醇，使乙醇最终浓度达60％，混匀后离（2500r／min）5分钟，上清液倒入回收瓶中，沉淀中加入0．5mol／L醋酸镁1.5ml充分溶解，并记录体积。吸取0.2m1（C液）置于另一试管中，加入pH8.8Tris缓冲液1.8ml，待测比活性用。6．上述悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮最终浓度达33％，混匀后离心（2000r／min）5分钟，弃去沉淀；上清液在另一刻度离心管中再缓缓加入冷丙酮，使丙酮最终浓度达50％，混匀后离心（4000r／min）10分钟，上清液倒入回流瓶中，沉淀物即为部分纯化的碱性磷酸酶。此沉淀中加入pH8.8Tris缓冲液0.8ml，待测比活性用，吸去0.2ml（D液）置于另一试管中，加入pH8.8Tris缓冲液0.8ml，待测比活牲用，吸去0.2ml后，余下的上清液为D液，留着测蛋白质含量时用。*加入有机溶剂计算公式：设应加xml95％乙醇， 原体积ⅹ浓度差x＝————————溶剂浓度一最终浓度①加至30％浓度：！（原体积v＋x）×30％＝95％×x0.3Vx＝—————0.95－0.30②从30％加到60％（原体积v十x）×60％一（原体积v×30％）＝95％×X（0.6—0.3）Vx＝——————0.95－0.60丙酮浓度计算与上相仿。注意：①各步加入有机溶剂量的计算要准确，否则会影响整个实验结果。②加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。③凡弃去上清液中含有丙酮及乙醇者均需倒入回收瓶中。［试剂］1．0.5mol／L醋酸镁溶液称取醋酸镁107.25g溶于蒸镏水中，稀释至1000ml。2．0.lmol／L醋酸钠溶液称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。3．0.01mol/L醋酸镁—0.01mol/L醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁20ml及0.1mol/L醋酸钠10ml，混合后加蒸馏水稀释至1000ml4．丙酮（分析纯）。5．95%乙醇（分析纯）。6．PH3.8Tris缓冲液。二、碱性磷酸酶的比活性测定[原理]比活性是指单位重量蛋白质的样品中所含的酶活性单位。因此，随着酶被逐步纯化，其比活性也随之逐步升高，所以测定酶的比活性可以鉴定酶的纯化程度。根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示，因此，计算样品中酶的比活性必须测定（1）每毫克样品中的蛋白质毫克数。（2）每毫克样品中的酶活性单位数。本实验测定碱性磷酸酶提取纯化过程各阶段的得率及比活性的提高倍数，其中碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠法测定；样品中的蛋白质含量用改良Folin-phenol法测定。[操作步骤]1．样品碱性磷酸酶活性测定取试管7支，编号，按下表操作。试剂（ml）12345670.04mol/L基质液1.01.01.01.01.01.01.0Tris乙酸缓冲液0.90.90.90.90.90.91.0酚标准液-----0.1-混匀，37℃水浴保温5分钟A0.1------ 样品液B-0.1-----C--0.1----D---0.1---E----0.1--混匀，立即计时，37℃准确保温15分钟0.5mol/LNaOH1.01.01.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林1.01.01.01.01.01.01.00.5%铁氰化钾2.02.02.02.02.02.01.0将各管充分混匀，在室温放置10分钟，于波长510nm处比色测定，以第七管为空白。2．计算每毫升酶液的酶活性单位酶单位/ml=酶液光密度/标准液光密度×酚标准液的浓度（mg/ml）×1/0.1×稀释倍数总酶活性单位=酶单位/ml×样品ml数三、样品中蛋白质含量用Folin-酚法测定。1．取样品液A稀释10倍。2．取试管7支，按下表操作试剂A（稀释后）BCDE标准管空白管待测样品1.01.01.01.01.0--标准样品----1.0-0.9%NaCl------1.0碱性铜液-------混匀后室温放置20分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.50.5立即混匀各管，放置30分钟后，用空白管调零，在波长650nm比色，分别读取各管光密度。计算：样品蛋白质含量=测定管光密度/标准管ⅹ标准管蛋白质含量ⅹ稀释倍数四、比活性及得率的计算1．比活性的计算碱性磷酸酶的比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质的毫克数2．纯化倍数的计算纯化倍数=各阶段比活性/样品A的比活性3．得率计算碱性磷酸酶的总活性单位=样品A的比活性ⅹ肝匀浆毫升数各阶段碱性磷酸酶得率=各阶段酶的总活性单位/肝匀浆中酶的活性单位（由样品A推算）ⅹ100%4．将实验结果填入下表内，分析各提纯步骤的意义。分离阶段匀浆（A）第一次丙酮沉淀（B）第一次乙醇沉淀（C）第二次乙醇沉淀（D）第二次丙酮沉淀（E）总体积（ml）蛋白质含量（mg/ml）蛋白质总量（mg） 酶活性（单位/ml）酶总活性（单位）比活性（单位/毫克蛋白）纯化倍数收得率（%）［思考题］1．操作过程中为什么要留取样品测酶的比活性？2．随着酶的逐步纯化，样品中酶的总活性、蛋白质含量，酶的比活性发生怎样的变化？为什么？⒊应用有机溶剂分离纯化蛋白质时应注意哪些问题？实验十九四唑盐比色法（MTT）法MTT法是一种定量检测活细胞的新方法，最早用于检测淋巴细胞的增殖活性，以后广泛用于肿瘤细胞的化学敏感性检测，近年应用于肿瘤细胞辐射敏感性试验。试验基本过程包括：（1）制备单细胞悬液；（2）接种96孔板；（3）进行实验处理如加药、照射等；（4）MTT检测；（5）统计学处理数据，将测得的吸光值转换为细胞数，求存活分数。存活分数（SF）＝实验组对数生长期细胞数/对照组对数生长期细胞数MTT法与克隆法比较具有以下几个优点：（1）适用性广。悬浮生长细胞、贴壁生长细胞、克隆形成细胞及多细胞球体均可应用；（2）实验周期短。一般一周左右即可出结果；（3）重复性好；（4）实验成本低。然而，要获得可靠的实验结果，必须充分了解受试细胞MTT还原产物吸光值的大小与细胞数量之间的线性关系范围，选择适当的接种细胞密度及细胞培养时间。否则，实验误差仍会偏大。四唑盐（MTT）比色实验〔概述〕四唑盐比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的燃料，化学名3-（4,5-二甲基噻唑－2）－2,5－二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称MTT，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测，大规模的抗肿瘤药物筛选，细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、快速、易自动化，无放射污染，与其他检测细胞活力的方法（如细胞计数法、软琼脂克隆形成实验和3H－TdR掺入实验等）有良好的相关性。〔用品〕（1）MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS（0.1mol/l，pH7.4）在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22μm的微孔滤器除菌，分装，4℃保存，，2周内有效。（2）含10%胎牛血清RPMI1640培养液、0.25％胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）（使用分析纯产品）。（3）96孔培养板（单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板）、可调移液器、吸管、离心管、计数板。（4）CO2孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪。 〔步骤〕（1）接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl。（2）培养细胞：将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，培养3～5天（培养时间取决于实验目的和要求）。（3）呈色：培养第3～5天后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。[注意事项]（1）选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一个孔内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，在进行MTT实验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不至于细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。（2）避免血清干扰。用15%胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响试验孔内的光吸收值。由于试验本底增加，会降低试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内的残余培养液。（3）设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。其他试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。实验二十核酸的提取、定量测定［原理］细胞核中核酸的组成与细胞质不同，核内含大量DNA，而RNA较少，细胞质则RNA含量丰富。RNA在碱性溶液中水解后，其核糖部分被浓盐酸缩水形成糠醛，后者能和3，5二羟基甲苯缩合成绿色化合物，从而可以进行测定。本实验测定肝细胞质中的RNA。［操作］1.肝匀浆制备取动物肝脏，用生理盐水洗去血液，除去结缔组织，称取0.5g，剪碎加4.5ml1.5%柠檬酸溶液，在玻璃匀浆器中制成匀浆。倾入离心管，以3000r/min离心15分钟，上清液为核酸提取液，备用。2.水解：取核酸提取液1.0ml，加1mol/LKOH1.0ml混匀置于沸水浴煮沸10分钟（注：沸水液面应没过反应液面），取出冷却，加8ml5%的三氯醋酸，搅匀，使蛋白质及DNA沉淀，3000r/min离心5分钟，其上清液为RNA的碱性水解液。3.显色及比色：取试管3支，编号，按下表操作：试剂（ml）123RNA水解液标准RNA液5%三氯醋酸3,5一二羟基甲苯液1.0---2.0-1.0-2.03.03.03.0立即混匀，置沸水浴煮沸10分钟，取出冷却，在660nm波长比色，以第3管调零点，读取OD值，计算得水解液中RNA的含量。4.计算 水解液中RNA含量(μg/管)=样品中RNA含量(μg/ml)=碱水解液中RNA含量(μg/管)×稀释倍数(10倍)5.RNA标准曲线的制备(1)RNA标准液：准确称取0.4mg纯RNA溶解1.0ml生理盐水，加等量1mol/LKOH溶液，沸热10分钟使其水解，冷却后，加入6ml5%三氯醋酸，配成50μg/ml之标准液。(2)标准曲线制备：取试管6只，编号，按下表操作试剂（ml）123456标准液5%三氯醋酸3,5二羟基甲苯2.01.61.20.80.4--0.40.81.21.62.03.03.03.03.03.03.0将上述6管混匀置于沸水浴中10分钟，取出冷却，以660nm波长比色，用第6管调零点，读取各管吸光度。以各标准管RNA含量为横座标，吸光度为纵座标准线。［试剂］1.1mol/LKOH2.5%三氯醋酸3.3，5-二羟基甲苯试剂取比重1.19HCl100ml，加入FeCl3·6H2O100mg及重结晶3，5-二羟基甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中。此试剂可用一周，颜色变绿即已变质，不能应用，市售之3，5-二羟基甲苯往往不纯，必须用苯重结晶一二次，必要时用活性炭脱色方可使用。4.1.5%柠檬酸［思考题］1.核酸彻底水解的产物有哪些?两类核酸的组成或有何异同?2.三种RNA的功能是什么?3.DNA双螺旋结构的要点及与DNA生物学功能的关系?4.根据核酸的理化性质测定核酸含量常使用哪种方法?当DNA变性时会发生什么改变?实验二十一肝糖原的提取和定量［原理］糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，而糖原仍稳定地保留于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其它成分分离开。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用90%的乙醇将糖原沉淀，再溶于热水中，使糖原纯化。糖原水解液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色，这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中依靠水分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的使碘呈红色，20～30个之间呈紫色，60个以上会使碘呈现蓝色，淀粉中分枝链较长，故呈现蓝色，而糖原体分枝中的葡萄残基在20个以下(通常为8～12个葡萄糖残基)，吸附碘后呈现红棕色糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓H2SO4能使后者进一步脱水成糖醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再和蒽酮作用形成蓝绿色化合物，在620mm有最大吸附峰，可借此进行比色测定。［操作］1.糖原的提取(1)准确称取1g肝脏，0.8%NaCl冲洗，吸去多余水份。 (2)在研钵中将肝脏组织剪碎，加入5%三氯醋酸2ml，将肝组织研磨至糜状，经滤纸过滤入刻度离心管中。再用蒸馏水3ml洗残渣两次，最后加入蒸馏水使总体积达到5.0ml。(3)取滤液2ml于另一离心管中，加入95%乙醇ml，混匀后静置10分钟，离心(3000r/min)5分钟，弃去上清液，白色沉淀即为糖原。2.糖原的鉴定(1)加蒸馏水2ml于糖原沉淀中，沸水浴加热5分钟使糖原溶解，可见有乳样光泽。(2)取糖原水解液2滴于白磁皿中，加入碘试剂1滴，观察颜色变化。3.糖原的定量(1)取滤液0.5ml加蒸馏水4.5ml为滤液稀释液。(2)取糖原水溶液0.5ml加蒸馏水4.5ml为糖原水溶液稀释液。⑶取试管4支，标记，按下表操作：管号试剂(ml)1234样品蒸馏水蒽酮试剂滤液稀释液0.5—5.0糖原水溶液稀释液0.5—5.0标准葡萄糖0.5—5.00.55.0混匀，置沸水浴中10分钟，冷却后以第四管为空白，波长620mm在分光光度计中比色。共计算糖原含量及提取的得率。［计算］糖原含量(μg)=A标准管÷A吸光度×标准管葡萄糖含量×1/1.11据此计算每100g肝糖原含量。注：1.11为此法测得葡萄糖含量换算为糖原含量得常数，即100μg糖原用蒽酮试剂呈争相当于111g葡萄糖所显之色。［试剂］1.0.9%NaCl2.5%三氯醋酸3.95%乙醇4.碘试剂I2100mgK1200mg溶解于30ml蒸馏水中。5.标准葡萄糖溶液0.5ml相当于50μg葡萄糖6.蒽酮试剂(1)蒽酮重结晶6g市售蒽酮溶于300ml无水乙醇中，加热至完全溶解。加蒸馏水直到结晶不再析出为止，放冰箱过夜，抽滤得淡黄色结晶，置棕色瓶内，放入干燥器内，备用。(2)配制试剂取结晶蒽酮0.05g及硫脲1g，溶于66%硫酸100ml中，加热溶解，置棕色瓶中，冰箱中可何存二星期。［思考题］1.鉴定糖原的方法及其原理有哪些?2.根据肝组织用量及提取时稀释情况，列出计算肝糖原含量的公式。3.为什么可以用饱食鼠来观察肾上腺素的作用，而用饥饿鼠来观察皮质醇作用?