牛奶中微生物的检测

牛奶中微生物的检测一．目的和原理本试验采用标准平板计菌法及显微镜下直接计菌法对不同品质的牛奶中细菌总数进行检测。与此同时，还采用选择性很强的鉴别培养基去氧胆酸盐琼脂平板对牛奶中可能存在的粪便污染指示菌大肠菌群进行检测。这种培养基可抑制绝大多数非大肠菌群细菌的生长，大肠菌群细菌还可发酵培养基中的乳糖产酸，在培养基内指示剂的作用下菌落呈红色，而不发酵乳糖的其它细菌则呈白色，因此很容易加以鉴别并作计数。牛奶中的微生物，在贮存过程中可不断增殖，同时降低了溶解氧浓度，使氧化还原电位大大下降。我们可用美蓝还原酶试验来检测这一变化，当牛奶因微生物大量增殖而处于厌氧还原环境时，氧化还原指示剂美蓝即被脱色。通过测定牛奶样品中美蓝被还原脱色的速度，即可得知所测牛奶的质量。二、材料与器皿(一)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基去氧胆酸盐琼脂培养基培养基配制1.去氧胆酸盐琼脂培养基蛋白胨10.0g乳糖10.0g去氧胆酸钠1.0gNaCl5.0gK2HP042.0g柠檬酸铁1.0g柠檬酸钠1.0g中性红(1％溶液3ml)0.03g琼脂20.0gpH7.34 2.肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏0.3g蛋白胨1g氯化钠0.5g琼脂2g自来水100mLpH7.0～7.2灭菌1.05kg/cm2，22min(二)不同质量的生乳各10ml，(三)显微镜、试管架、水浴锅、铁丝架，(四)灭菌移液管、灭菌9ml稀释水试管、载玻片、血球计数移液管、载玻片、无菌带塞试管，(五)试剂-二甲苯、95％酒精、1：25，000美蓝溶液。三、方法与步骤(一)牛奶巴斯德消毒法取生乳5ml装试管内，放在61.7℃的水浴锅内加热30分钟，水平面必须高于牛奶的平面。注意处理时间必须准确，水浴温度要始终一致，并不时摇动试管，使管内牛奶均匀受热。(二)标准平板计菌法1、取未经消毒的生奶，充分摇混，使样品呈均匀状态。以十倍稀释法，将生奶稀释成10-1、10-2、lO-3、lO-4、10-5系列，2、从最大稀释度开始，各取lmll0-3、10-4、10-5的生奶稀释液，分别放入已标记好的培养皿内：将肉膏蛋白胨琼脂培养基融化，待冷至45℃左右时，在火焰旁倒入培养皿内，迅速盖好，放在桌面上轻轻摇转，使稀释的样品与培养基均匀混合，待平板冷却固化后，倒置，于30℃培养2天。3、同上方法，吸取lml10-1、10-2、10-3样品稀释液至灭菌培养皿中，分别倾入加热融化并冷至45℃的去氧胆酸盐琼脂培养基，冷凝后倒置，30℃培养2天，4 4、对经巴斯德法消毒的牛奶作同样的检测，其中细菌总数检测可取10-2、10-3样品稀释液，大肠菌群检测可取10-1、10-2样品稀释液，5、所有平板在30℃培养2天后，选择每皿出现30～300个菌落的稀释度为准，计算出每ml牛奶中含细菌总数；根据在去氧胆酸盐琼脂平板上呈红色的菌落数，算出牛奶中大肠菌群细菌数。(三)显微镜下直接计菌法1、取洁净载玻片一块，在其上刻好lcm2面积数块，或用白纸画好lcm2的面积，将载片放于其上，载片上写好待测样品名称，2、用无菌的血球计数移液管，准确吸取0.01ml待测样品，方法为用嘴吸取样品至0.01ml刻度线略为超过一些，然后用吸水滤纸接触吸管的管尖，借助于毛细管作用，吸去多余样品液，使之准确地到达0.01ml刻度线处，然后慢慢将样品液吹至载玻片lcm2面积的中央，3、用接种针，将样品均匀地涂布在lcm2的面积内，气干，将载片放在铁丝架上，铁丝架置于沸水锅内，用蒸气加热固定5分钟，4、将已固定的样品载片放入二甲苯缸内1分钟以除去牛奶中的脂肪，然后将载片取出，再放至95％乙醇缸内除去二甲苯，最后将载片放在蒸馏水内除去酒精，5、用1：25000美蓝溶液染色2分钟，6、用水缓慢冲洗样品载片，置空气中干燥后在显微镜(油镜)下计数，4 7、计算30个视野中细菌的数目，求出每个视野中平均细菌数，乘以常数500，000即为每础样品所含细菌数的近似埴。一般显微镜油浸物镜每个视野的直径为0．16mm，每个视野的面积为0.0002cm2(0.02mm2)，lcm2中的视野数=1．0÷0．0002=5,000，由于我们以0.01ml样品均匀涂布在lcm2面积内，每个视野所复盖的样品量为1／100×l／5000，亦1／500，000ml牛奶，因此视野每个细菌代表着每ml牛奶中可有500,000个细菌。(四)美蓝还原酶测定法l、分别用10ml无菌移液管从已混匀的待测样品中吸取10ml牛奶，放入带塞的无菌试管中(体积15m1)，不同样品各用1支试管，每种样品同用1支移液管，用记号笔编号，2、每个样品试管内各加l：25，000美蓝溶液lml，塞上瓶塞后充分摇匀，置于37℃的水浴内，记录培养时间，3、每隔半小时观察一次，记录各管美蓝脱色时间，根据表1，判断待测牛奶的质量等级。美蓝脱色时间与牛奶质量等级（表1）牛奶等级美蓝脱色时间（小时）上等奶6~8中等奶2~6下等奶0.5~2劣等奶少于0.5四、结果与分析将以上检测结果分别填入表2：样品名称标准平板计数(菌落数／m1）显微镜直接计数(菌数／m1)美蓝脱色时间(小时)大肠菌群数4 细菌总数未经消毒生奶（不同产地或不同保存方式）123巴斯德法消毒后牛奶4