生物转化dl-ala分离d-ala的可行性

生物转化DL-Ala分离D-Ala的可行性1.DL-Ala的现状D-Ala为非天然型氨基酸，但由于它的生理活性不断地发现以及本身独有的特性，使得他越来越广泛的得以应用。（一）药物的应用D-Ala是生产维生素VB6的原料，具有镇痛作用；也可以制成输液注射单剂合剂；近期发现的D-Ala新的生理活性，可以增加D-Ala新的应用。（二）食品添加剂D-Ala具有丙氨酸的一些共性,即在食品添加剂方面的应用,主要供增味剂和调味料用,增加化学调味料的调味效果,改善人工甜味剂的味感,改善有机酸的酸味。而且D-Ala是合成二肽甜味剂阿力甜的原料，阿力甜甜味品质好,味道纯正,热量低、甜度高，符合人们目前对低热食品的追求。（三）化妆品D-Ala有抑菌作用,而且是自然保湿因子(ＮＭＦ)的主要成分,可用于保持水分化妆品的方向。2.生物转化优势及条件D-Ala为非天然型氨基酸，随着它的的生理活性和越来越广泛的应用，它的制取已经引起了很大的兴趣。一般氨基酸的制取方法有三种：水解提取法,微生物发酵法，化学合成法。（一）水解提取法一般都得到Ｌ-氨基酸，D-Ala不适用的制取。（二）化学合成法一般反应机制复杂，工艺过程长；不是需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，就是所得到的产物皆为ＤＬ-Ala，必须进行光学拆分，才可以得到Ｄ-Ala。（三）微生物发酵法一般产物浓度低,生产周期长,设备投资大,有副反应,分离较复杂且产物Ｄ-Ala的光学纯度比较低。从目前已掌握的情况看，寻找出一种生产过程简化，成本低，且产物纯度高的方法是人们梦寐以求的。其中在微生物领域，存在若干个菌群能够特异性的拆分DL-Ala外消旋物，其全细胞液发酵产物经过脱色、过滤、重结晶等能够得到化学纯度和光学纯度较高的D-Ala产物。这种微生物方法的原理是特定条件下培养微生物，能够产生对L-Ala具有强氧化能力的氨基酸氧化酶，而D-Ala完全不参加反应。，这样以DL-Ala为底物，随着反应的进行，D-Ala产物浓度增高，进而进行产物分离，可以成为生物转化DL-Ala生产D-Ala法。生物转化DL-Ala生产D-Ala法的优势在于生产过程简单，反映条件温和，生产成本低，污染小、分离效果好，产物纯度高等优点。从已有的资料分析，此工艺方法需注意或具有以下几点：1.在以DL-Ala为底物情况下，特异性地对L-Ala具有强氧化能力，而D-Ala完全不参加反应，作为目标物提取出来。2.作为底物的DL-Ala，其中的D-Ala和L-Ala比例不受限制，但当以D-Ala含量高的底物为优选。3.在生物转化DL-Ala生产D-Ala的微生物选择上，在包括假丝酵母、其他丝状真菌，包括细菌的大肠杆菌属、变形杆菌属、绿脓杆菌属等G_细菌；优选丝状真菌的曲霉属的黑曲霉或假丝酵母菌；作为病毒传染性的细菌类用于生产时因具有传染性，生产条件要求高，成本增大。4.次生产过程为微生物全细胞发酵液流加底物DL-Ala转化过程，因此需要有适于此实验工作需要的设备与场所。（附：微生物实验室与设备）3.前景从当前的一些资料、行业现状、产品需求等，可以得出以下几点：１.D-Ala的应用将出现两个增长点(1)D-Ala生理新活性的出现将引起第一个增长点（2）阿力甜的特点将引起消费者和厂商的亲睐，引发第二个增长点２.各个厂商、科研院所对于D-Ala生产工艺方法研究的热情从一个侧面反映出D-Ala在人们心目中的地位和前景。假使一种新的工艺方法能够生产出低成本、 高质量的D-Ala商品，无疑将是一场新的革命，将在竞争激烈的商业竞争中占据一个制高点；利用微生物特异性转化外消旋物DL-Ala中的L-Ala而集聚D-Ala的方法，提供了一条可以探索的途径；这条途径的成功将使前景一片光明。（酶工程法与微生物发酵法转化DL-Ala分离D-Ala的反应本质相同，皆属酶转化反应，但前者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化；酶工程技术工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少；固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可长期反复使用。此外，用酶法协同化学方法可能会得到比微生物特异性转化外消旋物DL-Ala中的L-Ala而集聚D-Ala的方法更好的结果，首先设备简单，其次不消耗L-Ala，产物为L-Ala和D-Ala，更具优势。）（附件）微生物实验室及设备一、选址：1.实验室应选择在清洁安静的场所，远离生活区，锅炉房与交通要道；2.实验室应选择在光线充足，通风良好的场所，要与生产加工车间有一定距离；3.实验室应选择在方便选样与检验，距离车间较近的工作场所．二、结构和布局：根据实验实际需要，主要包括以下三大部分：细菌实验室、理化实验室、办公室．1.办公室2.理化分析实验室：（或者和细菌检验操作室合并）①理化分析室（物理化学分析，可兼作感观检验室）②仪器室（兼放细菌室显微镜等少量仪器）3．细菌实验室：①细菌检验操作室；②无菌室（微生物的扩培、接种制细胞培养液，灭菌后培养基的分装）；③培养基制作室（培养基的配制，但灭菌后的培养基接种需在无菌室操作）；一般布局要求如下：1.办公室：办公室是化验人员进行原始记录等各项工作的场所，是与非化验室人员交往较多的场所，只需有桌、椅等简单设施即可．2.细菌检验操作室（常规操作）细菌检验操作室是细菌检验主要操作室，主要设施是实验台．实验台的要求：a.实验台面积一般不小于2.4×1.3m；b.实验台位置应在实验室中心位置，要有充足光线．c.实验台两侧安装小盆与水龙头；d.实验台中间设置试剂架，架上装有日光灯与插座；e.实验台材料要以耐热、耐酸碱为宜．3.无菌室：无菌室通过空气的净化和空间的消毒为微生物实验提供一个相对无菌的工作环境，无菌室是处理样品和接种培养的主要工作间，应与细菌检验操作室紧密相连．为满足无菌室无菌要求，无菌间应满足以下布局：a.入口避开走廊，设在细菌检验操作室内；b.与操作室用两道缓冲间隔开；c.无菌室与缓冲间均装有紫外灯，要求每3平米安装30ｗ紫外灯一盏；d.无菌室内设有实验台（实验台与边台皆可），紫外灯距实验台面要小于1.5m；e.无菌室与操作室之间设有双层窗构成小通道．4.培养基制作室：培养基室是制作、配制微生物培养所需培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为边台与药品柜．a.边台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用；b.边台材料要耐高热、耐酸碱；c.药品柜分门别类存放一些一般药品及试剂；d.危险、易腐易燃有毒有害药品单独设保险柜存放；e.边台上要放天平，以称取药品用．5.洗涤消毒室：洗涤消毒室用以消毒洗涤待用与已用之玻璃器皿，培养基及污物，其面积应大于10m2（此区域的部分职能可在理化分析室完成）．为满足洗涤消毒的功能，洗涤消毒室应设有：a.1-2个洗涤池，洗涤池上下水网要畅通；b.器皿柜或实验台，以放置洗涤好器皿； c.高压灭菌锅，其所用电源应满足用电负荷；d.室内安有通风装置（通风柜）或换气扇；e.有条件的单位还可在该室内，设供日常检验用水蒸馏水器装置．6.理化分析室（如果没有条件，这个可以和微生物常规实验室合并）理化分析室是物理化学分析的主要操作室a.实验台与细菌操作室要求相同b.设置通风柜以满足加热、消化、干燥、烧灼和化学处理等工作需要；c.洗涤池．7.仪器室：如果没有条件，这个可以和微生物常规实验室合并，用以放置显微镜、电子天平及理化分析用小型仪器；a.要求清洁干燥、防潮防虫、避光；b.仪器台要稳固、牢靠．从上述资料可以总结出简单微生物实验室须具备以下几点：1.办公室即实验纪录整理和相关资料文献存放区2.常规操作区包括（1）微生物试验结果的显微和理化检测（2）试剂、检验用仪器存放；药品需分门别类存放；危险、易腐易燃有毒有害药品单独设保险柜存放（3）培养基的一般配制；但培养基灭菌后的分装与接种必须在无菌条件下操作3.无菌操作区此区域为洁净区，作为微生物接种扩培和微生物发酵产物后处理工作区；超净工作台可代替无菌室，提供相对无菌的工作平台．其构造主要有电器部分、送风机、三级过滤器（初、中、高）及紫外灯等。特别注意：高压灭菌器材设备要独处放置。三、一般仪器设备1.恒温培养箱：主要用于实验室微生物的培养，一般有（1）普通培养箱：一般控制的温度范围为：室温＋５～６５度，又分为电热恒温培养箱和隔水式恒温培养箱．（2）生化培养箱：如SPX-250智能生化培养箱，宁波海曙赛征实验仪器厂，一般控制的温度范围为：５～５０度．（3）恒温恒湿箱：一般控制的温度范围为：５～５０度，控制的湿度范围为：５０～９０％．可作为霉菌培养箱．4）厌氧培养箱：适用于厌氧微生物的培养．可根据实际需要选用．2.电热恒温干燥箱：用于吸管，平皿类玻璃器皿的干热、灭菌和烘烤．3.高压蒸汽灭菌锅（又叫高压灭菌锅）：如MLS-3020高压灭菌锅，SANYO公司培养基，试验用培养皿等用品的灭菌．4.冰箱：如4℃冰箱(MDF-382E)，SANYO公司；BC/BD-325型低温冰箱，海尔公司；做暂时保藏菌种用.5.电子天平：如OHAUSUSA型，一般要求具备精度达到万分之一的分析天平．6.显微镜：观察微生物形态的必备仪器．7.均质器：用于均质样品，有旋转刀片式和拍击式可以选择；例如旋转振荡器．8．蒸馏水器：提供蒸馏水；根据现实情况，非必需.9．水浴锅：部分培养温度需要水浴（如大肠杆菌检验）10.超净工作台：超净工作台作为代替无菌室的一种设备，使用简单方便，为实验的开展提供一个相对无菌的操作台．超净工作台根据风向分为水平式和垂直式，例如苏净集团安泰公司制造厂制造.11.摇床培养机：如ZHWY-211B双层摇床，上海智诚分析仪器有限公司，制备细胞培养液时，用以摇匀接种微生物、细菌和细胞等.其它可能用到的设备：恒温水浴箱、菌落计数器、电位pH计、高速离心机、冷冻离心机、可见光分光光度仪等设备．12.针对本实验要增加一个实验室用小型发酵培养罐、真空泵、旋转薄膜蒸发器。四、常规玻璃器皿1.移液管：用于移取少量液体，常用的吸管有0.1刻度1mL及1.0刻度的10mL吸管等． 2.培养皿：为硬质玻璃双碟，常用于分离培养，盖与底大小应合适，常用规格为90mm．3.三角烧瓶与广口瓶：多用于盛培养基及配制溶液，常用的规格有250mL、500mL、1000mL．4.烧杯：供盛液或煮沸用，常用的规格为100mL、250mL、500mL、1000mL．5.量筒：用于液体测量，常用规格为100mL、250mL、1000mL．6.试管：用于菌种培养，有多种规格．7.载玻片盖玻片：菌种涂片观察用．8.微量移液管：移取微量液体，一般有1000～5000μl，100～1000μl，10～200μl，1～20μl，0.1～2μl等多种规格.其它，如试管架、毛刷、酒精灯、接种针、接种环、牛皮纸、脱脂棉等．五、化学试剂和培养基 参照所需购买试剂和培养基原材料以及消毒液．