维生素c阴道缓释片微生物限度检查法验证探究

维生素C阴道缓释片微生物限度检查法验证探究[摘要]目的：建立维生素c阴道缓释片的微生物限度检验方法。方法：采用平皿菌落计数法、培养基稀释法、低速离心结合培养基稀释法进行方法验证。结果：低速离心结合培养基稀释法回收率明显高于平皿菌落计数法或培养基稀释法。结论：低速离心结合培养基稀释法可以用于维生素C阴道缓释片的微生物限度检验。[关键词]维生素c阴道缓释片；微生物限度检验；方法验证[中图分类号]R-331　[文献标识码]A　[文章编号]1674-4721(2009)05(b)-029-02细菌性阴道病是正常寄生在阴道内的菌群失调所致。近年来有研究表明：将维生素C经阴道给药，维持阴道内微酸性条件对抑制杂菌生长及防止治疗后复发有积极意义。德国TaurusPharmaGmBH公司将规格为250mg的维生素C阴道缓释片(商品名：Vagi-c1在欧洲上市，其临床上主要用于细菌性阴道病的治疗，同时可使受破坏的菌群系统恢复正常。据此我们立项研制开发了规格为2507 mg的维生素C阴道缓释片，以期为国内细菌性阴道病患者提供一种安全有效的药物。中国药典规定含抑菌成分的药品的微生物限度检查，必须消除供试液抑菌活性后，再根据中国药典规定的方法进行检查；同时，所采用的检测方法需进行验证试验，以确认供试品的抑菌活性和保证测定方法的可靠性。本文对维生素C阴道缓释片的微生物限度检查进行了方法验证，为维生素C阴道缓释片的微生物限度检查法提供了科学依据。1　一般材料1.1样品维生素C阴道缓释片由中南大学湘雅二医院药剂科和福州海王福药制药有限公司共同研制提供。批号为：20080226、20080227、20080228，规格为：250mg，片。1.2试验茵株大肠埃希菌fCMCC(B)441021、金黄色葡萄球菌『CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]，均由中国药品生物制品检定所提供。1.3培养基及稀释剂营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、pH7.0氯化钠蛋白胨溶液、胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基，均由中国药品生物制品检定所提供：0.9％无菌氯化钠溶液由中南大学湘雅二医院药剂科提供。2　方法及结果2.1细菌、霉菌及酵母茵计数方法的验证7 2.1.1菌液制备取经35℃培养24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物加入到适量的0.9％无菌氯化钠溶液中，稀释至细菌数约为每1毫升含50～100efu的菌悬液，备用。取经25℃培养48h的白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物适量加入到适量的O.9％无菌氯化钠溶液中，稀释至细菌数为每1毫升含50-100efu的菌悬液，备用。取经25℃培养7d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加适量0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，取出霉菌孢子悬液倍量稀释至霉菌数为每l毫升含50-100efu的菌悬液，备用。2.1.2供试品溶液制各取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲溶液至100ml，用研钵法搅匀，制成1:10均匀供试液，备用。2.1.3试验方法2.1.3.1试验组：取验证方法项下供试液注入平皿中，加入50～100cfu试验菌，立即倾注45℃溶化的相应琼脂培养基15ml，摇匀，凝固后，按规定温度培养至规定时间，每株试验菌平行制备2个皿，计数其菌落数。2.1.3.2菌液组：取试验菌液各1ml，注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个皿，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。7 2.1.3.3供试液对照组：取验证方法项下供试液1ml，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个皿，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。2.1.3.4稀释剂对照组：取稀释剂1ml替代供试品。立即倾注琼脂培养基，平行制备2个皿，按菌落计数方法测定其菌数。2.1.3.5验证试验：按中国药典2005年版二部微生物限度检查法目，进行3次独立的平行试验，并分别计算各次试验菌的回收率。2.1.3.6菌回收率的计算：稀释剂对照组回收率=(稀释剂对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数)×100％；试验组菌株回收率=[(试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数)÷菌液组菌落数]x100％。2.1.4验证方法2.1.4.1平皿菌落计数法：直接取1:10供试液按试验方法注入平皿中进行方法验证，计算其回收率，结果见表1。2.1.4.2培养基稀释法取1:10供试液lm1分别等量注入5个平皿中(0.2mD，按试验方法进行验证，计算其回收率，结果见表1。2.1.4.3低速离心结合培养基稀释法取1:10供试液10ml置离心管中，以500r／min离心5min，取上清液，作为供试液。取此供试液17 m1分别等量注入5个平皿中(0.2ml)，按试验方法进行验证，计算其回收率，结果见表1。2.2控制菌检查方法的验证2.2.1金黄色葡萄球菌菌液的制备接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养18～24h，培养物用O.9％无菌氯化钠溶液制成每1毫升含菌数为10～100cfu的菌悬液。2.2.2铜绿假单胞菌菌液的制备接种铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35qc培养18～24h，培养物用O.9％无菌氯化钠溶液制成每1毫升含菌数为10～100cfu的菌悬液。2.3大肠埃希菌菌液的制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养18～24h，培养物用O.9％无菌氯化钠溶液制成每1毫升含菌数为10～100cfn的菌悬液。2.4试验方法和结果试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应的控制菌检查方法进行检查(《中国药典》2005年版二部微生物检查法金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)。阴性菌对照组：取大肠埃希菌10～1007 cfu加入增菌培养基中。结果：阴性对照组没有检出大肠埃希菌，试验组分别检出相应的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，表明供试品采用《中国药典》2005年版二部附录ⅪJ微生物检查法检查对结果无明显影响。3　样品微生物限度检查按照《中国药典》2005年版二部附录XIJ微生物限度检查法进行检查。三批样品的检查结果见表2。检查结果表明：三批样品微生物限度检查均符合规定。4　讨论维生素c分子结构中的3一羟基，由于受共轭效应的影响，酸性较强(pKa=4.17)，微酸性条件下可抑制杂菌生长，具有抑菌作用的药品可影响微生物限度检查的准确性。因此，本课题研究以中国药典2005年版二部微生物限度检查方法验证作为依据，参考有关文献将5种阳性对照菌的回收率试验作为评价所采用的方法是否适合于本品种的微生物限度检查。7 回收率结果表明：维生素C阴道缓释片对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用，可用常规法测定本品中的细菌数。本品用平皿菌落计数法或培养基稀释法检验时对污染的白色念珠菌、黑曲霉都有不同程度的抑制作用，影响了菌的生长，两种菌的试验组回收率均低于70％，两种方法都不能完全消除供试品的抑菌成分。当采用低速离心结合培养基稀释法检验时，由于本品中含有缓释骨架材料，低速离心除去了这些不溶于缓冲液的骨架材料，使本品中污染的白色念珠菌、黑曲霉回收率有所提高(回收率由培养基稀释法的65％提高到90％)，说明骨架材料部分具有一定的抑菌活性，在实验中采用低速离心清除了它的抑菌活性，故当选用低速离心结合培养基稀释法测定维生素C阴道缓释片的细菌数时，回收率大于70％，客观地反映了药品污染微生物的状况。采用常规法检查维生素C阴道缓释片的控制菌。结果符合药典规定。7