工业微生物育种复习资料

第一章绪论 一、微生物遗传育种 对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。 二、微生物遗传育种的具体目标: 1、提高产量   生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标 2、提高产物的纯度，减少副如色素； 提高有效产物组分 3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌 4、遗传性状特别是生产性状稳定 5、改变生物合成途径，获得新产物 三、优良发酵菌株应具备哪些特性 1、遗传稳定 2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到 3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体） 4、种子生长旺盛 5、发酵周期短，产量高，产物单一6、产物易于分离纯化 第二章微生物遗传学基础 一、名词解释： 基因：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。 转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。  转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重组   接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。 菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 二、 突变型的种类： 形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。 三、 试质粒的性质及其在基因工程中的应用 性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。  第四章工业微生物诱变育种 一、 物理诱变剂基本作用过程 物理过程：能量吸收和传递 物理化学作用：分子激发 化学过程：DNA断裂、碱基异构、碱基化学共价交联、碱基脱氨基等 生物学过程：经过DNA修复、复制、细胞分裂、代谢，产生死亡、基因突变、染色体畸变、染色体倍性变化等，使细胞死亡或形成各种突变体 二、紫外线的诱变机制 1、造成NDA断裂、与蛋白质交联、形成胸腺嘧啶二聚体 2、形成胸腺嘧啶二聚体是UV 引起突变的主要原因。形成于单链相邻TT间、或双链间 3、单链上出现TT二聚体，复制可能在此停止，或超越这一点继续复制，使子代DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成突变 4、双链间出现TT二聚体造成复制无法进行 三、 DNA中TT二聚体的修复方法 1、光复活：90％，可见光，在黑暗下TT与一种光激活酶结合成较稳定的复合物，但在可见光下这种酶吸收光能而解离，二聚体重新分解      ！！！紫外诱变时照射和分离均应在黑暗或红光下进行  1、切补修复：4种酶参与，识别、内切、外切、延伸、连接。  紫外诱变照射后在冰浴中处理1～2 h,以钝化修复酶 四、诱变剂低剂量处理与高剂量处理的选用原则  1、用照射时间或致死率来表示相对剂量 2、一般认为，对于初次进行诱变处理的菌株，采用致死率为90％～99.9%的高剂量处理，而对于已经受过诱变处理的菌株，采用致死率为70％～80%的较低剂量处理为好，或者交替进行 3、一般采用30W或15W紫外灯，30cm 照射一定时间4、不同细胞敏感性不同，需要确定照射时间与致死率的关系 五、紫外线诱变的基本步骤 1 、出发菌株的准备 2、前培养(预培养） 3、 菌悬液制备 4、 照射 5、冰浴处理 6、后培养 7、稀释涂布分离 六、 主要新型物理诱变剂 离子注入、激  光、微  波 七、化学诱变剂特点 1、化学诱变剂是一类对DNA起作用并引起遗传变异的化学物质，如碱基类似物、烷化剂、移码突变剂等。 2、化学突变剂往往具有专一性，对基因的某部位起作用；突变多为基因突变，主要为碱基的改变，且以转换为多。见p42表4.2 3、绝大对数具有毒性，90％以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接口吸，避免与皮肤接触；所有物品需要做无公害处理，防止环境污染；未生育者不宜操作 八、 碱基类似物诱变的原理P42 九、 5-BU的诱变机制,图示和文字说明P43 原理：酮式5-BU相当于T,与A配对，而烯醇式5-BU相当与C,与G配对。 十、 烷化剂及其作用机制 P45 十一、 常见烷化剂 NTG、NMU、EMS、DES 、DMS等等   十二、移码突变剂及其诱变机制,图示和文字说明 移码突变剂：分子扁平，可嵌入碱基之间；主要为丫啶类荧光染料，主要有丫啶橙、丫啶黄、原黄素、溴化乙啶（EB)等 机制：嵌入双链碱基间使链拉长，两碱基间距离加宽，在DNA复制时造碱基插入或缺失，使突变碱基后的三连体密码后移或前移，形成突变－移码突变。十三、名词解释： 微生物诱变育种：以人工手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。 基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，称为基本培养基。 完全培养基：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基，称为完全培养基。 补充培养基：凡是只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为补充培养基。 营养缺陷型菌株：野生型菌株经过人工诱变或自然变异失去合成某种必需营养（氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，只有在基本培养中补充所缺乏的营养因子才能生长繁殖，成为营养缺陷型 温度敏感突变株：仅在某个温度范围内明显有与野生型不同表型的突变型。 十四、微生物诱变育种主要阶段 菌种的基因改变；菌种筛选，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株；产量评估。 十五、 诱变前的主要准备工作 对出发菌株菌落形态的了解；了解影响菌种生长发育的主要因素。 十六、诱变育种的主要步骤 出发菌株的选择和纯化；单细胞悬液的制备；诱变剂和诱变剂量的选择；诱变处理；分离纯化；筛选；培养基及培养条件优化 十七、最适剂量的选择原则 1、诱变的最适剂量是使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例  2、根据经验，在高产菌株选育中，正突变的最适剂量采用最高形态突变剂量的1/3  3、剂量的大小常以致死率和变异率来表示 4、经长期诱变后的高产菌株，以采用低剂量处理为妥 5、对诱变史短的菌株，多采用高剂量处理，然后逐渐使用较温和的突变剂和较低的处理剂量 十八、突变株筛选方法和原则 方法：随机筛选；平板菌落筛选。原则：让诱变后的 微生物群体相继通过一系列的筛选，每级只选取一定百分数的变异株，使被筛选的菌株逐步浓缩。 十九、自身产物耐受筛选法 在培养基中加入超过现有生产力水平的自身产物（抗生素)二十、琼脂块法筛选方法的原理和步骤 1、分离培养 2、琼脂块制备 3、琼脂块培养 4、琼脂块活性测定：抗生素用敏感指示菌检测平板；酶活性可用其相应的底物和琼脂制作平板 5、挑菌用于下一轮筛选 二十一、淘汰野生型菌株, 保留营养缺陷型菌株的方法和原理 抗生素法、菌丝过滤法、高温杀菌法 二十二、营养缺陷型的鉴定方法1、把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定     2、在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定 二十三、营养缺陷型的鉴定步骤  营养因子类别测定→ 营养因子种类测定→复证试验第五章 工业微生物代谢控制育种 一、 名词解释： 代谢控制育种: 在了解代谢产物生物合成途径、遗传控制和代谢调节机制的基础上，设计对特定突变型的筛选（定向选育），选育出解除正常代谢调节、或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用代谢产物选择性地大量合成和积累 葡萄糖效应: 当葡萄糖和乳糖同时存在时，微生物优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后，才开始利用乳糖，出现“二次生长”。葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成 二、酶合成的调节的主要方式 ：诱导与阻遏 三、阻遏调节主要方式及其原理 方式：末端产物阻遏、分解代谢物阻遏。原理：当代谢途径中某物质过量时，通过阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢和减少该物质的合成。 四、反馈抑制及其机制  反馈抑制(feedback inhibition):末端产物过量时，这个产物可以反过来直接抑制该反应途径中第一个酶的活性，使整个反应过程减慢或停止，从而避免末端产物的过量积累。 机制：反馈抑制主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调节酶的抑制。受反馈抑制的酶为变构酶(allosteric enzyme),具有与底物结合的催化中心(活性中心)，和与调节因子（效应物）结合的调节中心（变构中心）。当与效应物结合后，酶发生构象变化，引起酶活性中心对底物亲和力变化，阻碍或促进酶与底物的结合，从而抑制或促进酶活力。反馈抑制中，终产物作为抑制剂抑制酶活力。 五、图示并说明反馈抑制中的同工酶调节   六、反馈阻遏与反馈抑制的比较,表解说明  七、次级代谢产物的诱导调节两种方式 1 诱导物→ 刺激影响初级代谢造成代谢流改变→大量生成此生代谢物;    2 诱导物→次生代谢物合成酶的合成 → 大量生成次生代谢物  八、次级代谢产物碳源/氮源分解调节原理和特点九、次级代谢自身产物的反馈抑制的特点 一般产生菌产量越高,对自身抗生素的耐受力越强,反之越敏感 自身抗生素不一定对生长有影响 十、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用 1.营养缺陷型常由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活直接使某个生化反应发生遗传性障碍,使菌株丧失合成某种物质的能力,导致该菌株在培养基中不特点及类型 特点：抗反馈调节突变株产物不当积累,不会因其浓度超量而终止产生. 抗反添加这种物质,就无法生长. 2.营养缺陷型常常使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到积累 3.营养缺陷型由于合成不能完成,解除了终产物的反馈抑制,外加限量的营养物质,克服生长的障碍,从而使某一中间产物或另一途径的终产物得以积累 十一、抗反馈调节突变株馈突变型:结构基因突变,使相应的酶不能与终产物结合,便失去了终产物的反馈抑制作用 抗阻遏突变型:由于调节基因突变引起调节蛋白不能与终产物结合而失去阻遏作用 类型：抗终产物结构类似物突变株；耐自身产物突变株；回复突变引起的抗反馈调节突变株；耐前体或前提结构类似物突变株。 第六章 工业微生物杂交育种 一、名词解释： 有限培养基：专供异核体生长的培养基.通常在基本培养基或蒸馏水中加入少量(20%~20%)的完全培养基,仅供直接亲本稍许生长,以供相互接触,融合需要. 细菌结合因子：F因子(fertility factor)是一种质粒，它存在于细胞质中，一般为游离状态（F+菌株），有时又和染色体整合在一起，与染色体一起复制一起遗传（Hfr菌株），这种整合是可逆的。 微生物原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后制备原生质体,然后诱导原生质体融合杂交.双亲本不受亲和力限制, 甚至可以打破种属间的遗传障碍,获得远源杂交重组体。  原生质体再生：原生质体重新合成细胞壁,恢复完整细胞结构,并进一步生长繁殖 二、杂交育种特点 1.进行遗传物质的交换和重组,改变亲株的遗传物质基础,扩大变异范围,使不同菌株的优良性状集中于重组体(recombinant).      2.重组体体不仅可以克服因长期诱变造成的生活力下降,代谢缓慢等缺陷,也可以提高对诱变剂的敏感性 三、微生物杂交类型 真菌、细菌和放线菌 四、微生物杂交育种基本程序 选择原始亲本→诱变筛选直接亲本→亲本之间亲和力的鉴定→杂交→分离到基本培养基或选择培养基→筛选重组体→重组体分析鉴定. 五、杂交亲本选择依据 1 原始亲本的选择:  原始亲本是杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株,除具有一般的优良性状外,还应该具有遗传标记,如孢子颜色/可溶性色素/抗性标记等 2 直接亲本的选择: 具有优良性状,遗传标记和亲和力,直接用于杂交配对菌株. 它们是原始亲本经过诱变选育出来的具有营养缺陷标记或其它遗传标记,又通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株. 最好选择各自优良性状突出,遗传差异明显的近亲菌株为直接亲本 六、微生物杂交育种的主要方法 常规杂交育种（接合、转化、转导、溶源转换、转染）、原生质体融合育种。 七、细菌杂交原理 微生物杂交的本质是不同菌株间遗传物质的转移、交换和重组，主要方法有结合、转化和转导，供体菌(donor)把部分遗传物质传递到受体菌(receptor),经过染色体交换和重组，受体子代细胞中出现了新的遗传物质和新的遗传性状。 八、大肠杆菌杂交与菌株类型 类型:F- 菌株、Hfr菌株、F+菌株、F′菌株 九、Hfr菌株的特点  1、这类菌株含有F因子，并且F因子整合到染色体上，一起复制一起遗传。当与F-菌株结合时，与F因子连锁的染色体DNA会进入F－细胞，易于形成重组体。所以Hfr菌株称为高频重组(high frequency recombination)菌株。 2.、杂交过程为：结合， Hfr菌株染色体单链打开，远离F因子一端的染色体DNA先进入F-细胞(F因子最后才能进入),部分结合子形成, 经过交换， Hfr菌株的一段DNA整合到F-菌株染色体中，形成具有新的遗传性状的重组体。 3、Hfr菌株与F-菌株结合，供体细胞进入受体的染色体常常发生断裂，使进入受体的机会总是位于前端的基因比后端的大，而F因子位于最末端，也就没有机会或极少有机会进入F－菌株。  十、微生物原生质体育种优点/方法 优点1、保持原有细胞结构、活性与功能；可以再生成正常正常细胞 2、对渗透压特别敏感；对诱变剂更敏感；失去对噬菌体的敏感性；转化更容易与其它原生质体融合更容易 3、有原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种，原生质体融合育种 4、用对数期细胞制备原生质体 方法：微生物原生质体再生育种、微生物原生质体转化育种、微生物原生质体诱变育种 十一、微生物原生质体再生育种及其原理 含义：原生质体制备后直接再生,从再生菌落中分离筛选变异菌株 可能原理:1 原生质体本身敏感,制备和再生过程中各种理化因子有一定诱变效应;2 再生的细胞壁可能在组成和结构上变化,甚至产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异 十二、原生质体融合育种的优势 1、大幅度提高亲本间的重组频率:链霉菌达1%,如果先用紫外线处理再融合,重组率达20%~30% 2、扩大重组亲本范围:可以远源融合 3、整套染色体参与重组,遗传物质转移和重组类型多,集中双亲优良性状的机会大  4、多亲融合 十三、原生质体融合育种步骤 1 、直接亲本选择及其遗传标记选择 2 、原生质体制备 3 、原生质体诱导融合 4 、融合重组体分离 5 、遗传分析与测定 十四、原生质体融合直接亲本及其遗传标记的选择原则和方法 原则：一般选择具有较大遗传差异的近亲菌株；遗传标记主要是常用的营养缺陷型/抗性/孢子颜色等 灭活法: 再没有合适遗传标记时, 可以把双亲中任何一方原生质体用热灭活(如50℃,2h或60 ℃,5min), 或用紫外线/药物灭活, 然后和具有正常活性的一方融合 荧光标记:双亲用不同荧光染料标记,融合后选择同时具有两种荧光色素的融合体 十五、酶法分离原生质体 取健壮细胞悬浮于高渗溶液中,加入细胞壁水解酶, 在一定条件下酶解一定时间,再经过滤除去菌丝,离心收集原生质体,再悬浮于同一高渗溶液中备用 十六、主要融合剂 PEG、电场、激光 湖北生物科技职业学院生物工程系生物制药专业工业微生物育种复习资料 2014年5月