利用反应曲面法对使用廉价生物氮源进行的红霉素分批补料发酵的优化翻译

文献翻译利用反应曲面法对使用廉价生物氮源进行的红霉素分批补料发酵的优化X.Zou,C.-F.Chen,H.-F.Hang,J.Chu,Y.-P.Zhuang,andS.-L.Zhang摘要为了红霉素的生产，发展了一种新颖的由多菌种发酵产生的生物氮源来源。这种由玉米浆、生物氮和黄豆粉构成的氮组成首先是使用RSM(Responsesurfacemethodology,反应曲面法)进行最优化的。使用Box-Behnken法估计出用于红霉素生产的最适宜的氮组成如下：玉米浆γ=5.1g·L-1，生物氮γ=5.96g·L-1和黄豆粉γ=24.17g·L-1。基于这种最适宜的氮源物质，葡萄糖连续补料和pH控制补料策略分别用于对50L搅拌生物反应器中的红霉素生产进行进一步优化。实验中发现pH控制在红霉素生产中能充当有效的调控策略，而且红霉素的最高产量为190小时内生产8528U·mL-1。这项工作证明了基于这种廉价的氮源物质——生物氮的新培养基，是一种经济的大规模红霉素生产的可行的选择。关键词生物氮，红霉素生产，分批补料策略，培养基优化，反应曲面分类研究法，红色糖多孢菌引言红霉素是一种用于治疗多种有细菌引起的传染病的大环内酯类抗菌素，由红色糖多孢菌发酵产生。[1-3]红霉素也被推荐给一些对青霉素过敏或治疗中青霉素无效的病人。近年来，红霉素与其半合成衍生物被广泛用于医学。因而为市场提供质优价廉的红霉素产品是一项大的需求。红霉素发酵时一种经典抗生素发酵过程。尽管曾在使用经典诱变和代谢工程策略进行红霉素菌种改良上做过一些努力，[4,5]发酵培养基的最优化仍然在红霉素生产和原材料成本中扮演着重要角色。在我们以前的研究中，黄豆粉被用作红霉素发酵的主要氮源，[6]然而在中国，黄豆粉的价格最近涨了30%~40%。红霉素发酵需要一种经济的氮源以缩减原材料的成本。生物氮（商品名：鑫氮素，由北京Jinruikang生物技术有限公司生产），作为一种新颖的生物氮源，由使用农副产品（大豆粕，棉籽粕，和油菜籽粕）为主要原材料通过多菌种发酵产生。与黄豆饼粉，棉籽饼粉，和鱼粉等常规氮产品相比，生物氮具有更稳定的质量，便宜和高含氮量，而且在中国生物氮比黄豆粉便宜50%。统计实验设计这种能有效地找出目标响应的最优化条件的方法已经被使用了几十年。反应曲面分类研究法(RSM)是一种在审查和优化培养基和流程中有用的统计技术，且已经被成功地用于一些抗生素发酵过程的最优化当中。[7-9]反应曲面分类研究法(RSM)适用于使用Box-Behnken法优化氮源组成。基于最优的氮源组成，一种不同的包括连续葡萄糖补料和pH 控制补料的补料策略更多的用于优化50L搅拌生物反应器中的红霉素生产。这项工作的目标是研究在廉价氮源的影响下的红霉素发酵，而反馈的信息对于使用红色糖多孢菌进行低成本的红霉素有效生产的大规模发酵是有帮组的。材料和方法微生物和培养方法由YiduHECBiochem.Co.Ltd.（中国湖北）提供的8号红色糖多孢菌用于在液体培养的条件下生产红霉素。将孢子接种到琼脂斜面中并在32℃的环境中培养7天，然后用于种子培养接种。对于种子培养来说，其培养基组成为(γ/g·L-1)：淀粉30，黄豆粉15，氯化钠5，硫酸铵2，pH7.0。种子培养是在装有5mL液体培养基的500mL摇瓶中进行，并置于32℃的摇床(220rpm)中培养两天。在发酵中，培养基作为控制物，每种营养物的浓度如下(γ/g·L-1)：可溶性淀粉40，糊精30，豆粕32，玉米浆15，碳酸钙5，氯化钠2，pH7.0。发酵培养接种在ψ=10%(1·108个mL-1)的上述种子培养基中，并在32℃和220rpm的摇床中仲培养7天。原料玉米浆由中国湖北YichangHuacheng发酵公司处获得，而黄豆粉由中国湖北YichangMingyuan技术公司处获得。生物氮从中国北京Jinruikang生物技术有限公司处购得。玉米浆，黄豆粉和生物氮中蛋白质的质量分数由凯氏定氮法测定分别达到w=22.5%，42%和53.7%。[10]Box-Behnken设计目前研究中使用的RSM法是一种包含3种不同氮因子（玉米浆，生物氮，和黄豆粉）的Box-Behnken设计，作为控制因素，其他的培养基成分是相同的。如表1所示，玉米浆(X1)，生物氮(X2)，和黄豆粉(X3)规定为3种代码级(-1,0,+1)。根据应用设计，使用了15种组合，而且其试验结果在多元回归技术上都符合公式(1)这个二级多项式。表1在Box-Behnken设计中的过程变量和水平变量符号变量代码-10+1玉米浆(γ/g·L-1)X151015生物氮(γ/g·L-1)X2468黄豆粉(γ/g·L-1)X3202530y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b11X12+b22X22+b33X32(1)式中y是因变量（红霉素生产），b0是中心点的回归系数，而b1，b2和b3是线性系数，b11，b22和b33是二次系数。系数和最佳浓度是使用SAS软件（美国北卡罗来纳洲的SASInstitute 公司生产的9.0版本）计算得出的。这个二级模型的适应性是由衰退系数r2表达，且其统计显著性视F-试验而定。式中各函数的意义由T-试验决定。50L发酵罐中的补料连续发酵发酵罐使用的是由中国上海Guoqiang生物工程设备有限公司生产的工作容量为30L的50L搅拌式生物反应器，该设备有3组六涡轮叶片叶轮，且装备有各种用于监测和控制多于14个即时可测参数的传感器和设备。[11]培养温度和接种量和摇瓶培养是相同。没8小时取样，用于分析细胞成长状况（PMV），红霉素生产，残糖和全糖的含量。连续葡萄糖补料发酵对于连续葡萄糖进料的试验，发现一种将γ=300g·L-1的高浓度的葡萄糖溶液通过脉冲进料补进搅拌生物反应器的连续补料方式。通过这种方式进行补料，能在发酵液中葡萄糖浓度低于0.1g·L-1时将葡萄糖浓度提升到0.1g·L-1。提升的速率能通过葡萄糖离线间隔时间调整。pH控制补料发酵对于pH控制进料的试验，发现一种将γ=300g·L-1的高浓度的葡萄糖溶液通过脉冲进料补进搅拌生物反应器的pH控制补料方式。通过这种补料方式，能在发酵液的pH高于6.95时将pH控制到6.9~7.0。细胞生物量的确定（菌浓，Packedmyceliumvolume，PMV）对于细胞生物量的确定（PMV），每次通过离心法（ac=4000·g，10min）去除上清后，取10mL发酵液作为样本，PMV通过以下方法计算：沉淀的量/10mL发酵液。葡萄糖，总糖和残糖含量的确定葡萄糖的浓度通过葡糖氧化酶方法测量。[12]实验使用到的基准试剂由中国上海Feiheng医疗技术有限公司处购得。总糖和残糖含量通过婓林法测得。红霉素产品与成分的分析红霉素产品的总浓度是通过改良后的比色法侧定的。在去除生物量和不溶性部分后，发酵液使用醋酸丁酯萃取。萃取后的的红霉素与浓度c=0.1mol·L-1的盐酸混合。水相部分被很=小心地分离，且进一步与无水硫酸混合3分钟。其吸光率由分光光度计在波长λ=498nm处测得。为了证明红霉素产品，发酵终了时的发酵液样品要作进一步的生物鉴定，使用杯碟法与短小芽孢杆菌进行对比（）中国药典2005）。红霉素的组成由HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography，高性能液体色谱法）确定（JASCOPU2080，日本），HypersilBDS-C18柱（4mm×250mm，5μm，Elite，中国），流动相：由乙腈和浓度c=0.025mol·L-1磷酸氢钾的混合物（Ψ=60:40，在波长调为215nm的紫外线探测器下流量Q=0.9mL·min-1）。[14] 结果与讨论Box-Behnken设计有实验获得的设计模型和红霉素实际产出都标示在表2中。表现红霉素产品的模型的回归系数和显著性水平如表3所示。表23个独立变量与结果构成的Box-Behnken设计试验变量红霉素/U·mL-1X1X2X31-1-102862a2-110284831-1023724110178950-1-1227660-112481701-12403801112729-10-127931010-1248411-1012477121011974130002213140002115150002227a资料由3个独立样本计算得出表3由反应曲面法试验得出的回归结果的重要性参数参数值T值Pr>|r|X1-295.125-5.7330.002X2-209.875-4.0770.009X3-219-4.2540.008X1·X1303.3754.0040.010X1·X2-142.25-1.9540.108X1·X3-48.5-0.6660.535X2·X2-20.625-0.2720.796X2·X3-334-4.5880.006X3·X3-56.375-0.7440.490 由表3可以明显地得知，模型计算，X1，X2，X3，X12，X2X3是有重要意义（P<0.05）的。玉米浆（X1）比其他可变因素如生物氮（X2）和黄豆粉（X3）都重要。回归方程的系数都被计算出来，且它们都符合一个二次多项式。红霉素生成反应（y）可以用如下的回归方程式表示：y=2185-295.125X1-209.875X2-219X3+303.375X12-142.25X1X2-48.5X1X3-20.625X22-334X2X3-56.375X32(2)式中X1表示玉米浆，X2表示生物氮，X3表示黄豆粉。从方差分析中获得的回归方程式表明，衰退在95%的置信水平上具有统计学意义（P<0.05）（表4）。模型表现了一个高回归系数（r2=0.9566），而这个回归系数指出反应中95.66%的可变性能能用模型解释。实验数据符合等式（2），且图1演示了由SAS软件分析所得出的权威的响应曲面图，说明了红霉素生产在如下的成分组成是能达到其最大值：-0.986（X1，玉米浆），-0.015（X2，生物氮）和-0.164（X3，黄豆粉）。这个模型预测了在最优化的氮组成水平，即玉米浆γ=5.1g·L-1，生物氮γ=5.96g·L-1，黄豆粉γ=24.17g·L-1时，红霉素的最大响应值为2798U·mL-1。要证明上文的预测，在相同培养条件下进行了更多的使用最优化氮源组成培养基（和预测相同）与使用以前的培养基（作为对照）的实验。表5展示了2757U·mL-1这个由Box-Behnken设计得出的红霉素产品的实际最大值，且和控制条件的结果相似。这个结果表明实验所确定的生产值与统计预测的值基本相同，证明了模型的真实性。与控制培养基相比，最优化的氮组成培养基能减低原料的成本。表4与二次多项式相匹配的反应曲面分类研究法参数的方差分析（ANOVA）来源DFSSMSFPr>F模型92338326.00259814.0012.260.006线性31432858.00477619.4022.530.002二次方程3368894.20122964.705.800.044向量3536573.30178857.808.440.021误差5105997.3021199.45不合适398549.2532849.758.820.103纯误差27448.003724.00总计142444323.00r2=95.66%；修正r2=87.86%；SS，平方和；DF，自由度；MS，均方表5在最优化氮组成培养基和控制条件下红霉素和组成A生产的改变培养基红霉素/U·mL-1红霉素A/U·mL-1最优化27572164控制29172304 图1基于Box-Behnken实验结果，以玉米浆(X1)，生物氮(X2)和黄豆粉(X3)为函数的红霉素生成反应搅拌式生物反应器中的分批补料发酵基于最优的氮源培养基，进一步地发展了两种不同的分批补料策略用于更优化在V=50L的搅拌式生物反应器中的红霉素生产。连续葡萄糖分批补料和pH控制分批补料的时间过程分别展示在图2和图3之中。通过连续葡萄糖分批补料策略，培养pH在第72小时补入葡萄糖后开始不停地变化，且由第100小时时的6.89降低到发酵终了时的6.47。图4显示从发酵第100小时到发酵终了时，连续葡萄糖分批补料的葡萄糖进料率比pH控制补料高。在使用这两种补料策略后，红霉素的最高产量分别为6677U·mL-1和8528U·mL-1。实验结果表明尽管使用连续葡萄糖分批补料时残糖浓度在红霉素生物合成的一段时间中低于γ=0.1g·L-1，葡萄糖还是通过新陈代谢生成一些酸性物质且使pH值降低，还更多地抑制了红霉素的生物合成。这证明了pH控制分批补料更有利于红霉素生产。 图2搅拌式生物反应器中连续葡萄糖补料发酵的细胞生长的热适应性(▼)，总糖(◆)，葡萄糖(▲)，pH(●)和红霉素产品(■)的时间过程图3搅拌式生物反应器中pH控制补料发酵的细胞生长的热适应性(▼)，总糖(◆)，葡萄糖(▲)，pH(●)和红霉素产品(■)的时间过程图4不同分批补料策略的葡萄糖进料率变化。符号为pH控制分批补料(■)和连续葡萄糖分批补料(◆) 表6展示了使用连续葡萄糖分批补料和pH控制分批补料时红霉素组成的变化。pH控制分批补料中的红霉素中的主要组分A较连续葡萄糖分批补料的高，且结果和上面提到的化学测定结果一致。在使用两种不同的分批补料策略时，红霉素的杂志部分B和C都没有明显增长。表6通过HPLC测定的不同分批补料策略中红霉素组成的变化策略培养时间t/h红霉素/U·mL-1ABC连续葡萄糖分批补料1834205167226pH控制分批补料1906145145473结论一种经济的原料对于工业发酵产品的生产和生产率的提高时很有用的。在这次的试验中，生物氮这种新奇且可再生的产品作为一种廉价的氮源应用在红霉素的经济生产中。利用Box-Behnken设计优化在摇瓶中使用的生物氮，以获得最优的氮组成。基于生物反应器规模的最优化氮源培养基，实验对不同的的分批补料策略进行了深入的研究。结果表明pH控制分批补料策略更有利于红霉素的生产。而从实验中所获得的资料对红霉素工厂规模生产这一经济过程的进一步发展有深远影响。这项工作还对其他抗生素的次级代谢生产有利。符号列表b-公式（1）的系数c-摩尔浓度，mol·L-1Q-体积流率，mL·min-1r2-回归系数V–体积，mL，Lt–培养时间，hw–质量分数，%γ–质量浓度，g·L-1Γ–进料率，g·L-1·h-1φ–体积分数，%Ψ–体积比率λ–波长，nmθ–温度，℃参考文献1.Hoyt,J.C.,Robbins,R.A.,FEMSMicrobilo.Lett.205(2001)1. 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