实验八：微生物大小及数量测定

实验八：微生物大小及数量测定一、实验目的1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法；2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识；3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。二、实验原理1、微生物大小的测定微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。2、显微直接计数法5 将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：1mL菌液中的总菌数=×25×104×B=5×104×A·B（25个中格）=×16×104×B=3.2×104×A·B（16个中格）三、溶液试剂1、菌种：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌；2、溶液试剂：0.1%吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水；3、仪器及其他用品：目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、血细胞计数板、移液器、锥形瓶、双层瓶（含二甲苯、香柏油）等。四、实验内容1、微生物大小的测定（1）目镜测微尺的安装把一侧5 目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。（2）校正目镜测微尺将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（μm）=（3）菌体大小的测定①　制作枯草芽孢杆菌的单染色制片洗片→干燥→加热、固定、干燥→美蓝染色1min30s→自然干燥②　制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美蓝→接种酵母菌→盖盖玻片③　将镜台测微尺取下，换上细菌制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。本次实验取三个。2、显微镜计数（1）血球计数板清洗。（2）自然干燥。（3）对酵母菌液进行适当的梯度稀释。取原液1mL到试管中，用移液管移取9mL水注入试管中。再取上一次稀释的菌液中的1mL加到另一支试管中，加9mL水。依此类推。即可得到一系列稀释梯度的菌液。（4）加样品。血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出多余的菌悬液。加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。（5）将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有不多于5个菌体。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。如遇酵母出芽，芽体全记或全不计。（6）清洗。使用完毕后，将血球计数板及盖玻片进行清洗、干燥，放回盒中，以备下次使用。三、注意事项1、5 使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻尺外的圆圈线进行准焦后再通过移动标本推进器进行寻找。2、细菌的个体微小，在进行细胞大小测定时一般应选用油镜，以减小误差。3、进行显微镜计数时应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。4、酵母菌计数加样品前，一定将菌液摇匀。5、为了确定稀释梯度，可以先将酵母菌的原液加到计数板上计数。六、实验结果1、目镜测微尺校正结果物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺代表的长度/μm低倍镜10555510高倍镜403382.424油镜1002120.9522、微生物大小测定结果表1枯草芽孢杆菌大小测定记录（单位:油镜下目镜测微尺格数）123平均长度3.022.52.5宽度0.50.50.50.5表2酿酒酵母大小测定记录（单位:40倍目镜测微尺格数）123平均直径5.05.06.05.3表3各菌测定结果名称目镜测微尺每格代表的长度（μm）长宽菌体大小/长×宽（μm×μm）目镜测微尺平均格数长度/μm目镜测微尺平均格数宽度/μm枯草芽孢杆菌0.9522.52.380.50.4762.38×0.476酿酒酵母0.9525.35.046----5.0461、酵母菌显微计数结果（A表示5个中格中总菌数，B表示菌液稀释倍数）酵母菌数量的测定结果5 菌种AB菌数/mL酵母菌202100.99×108七、思考题和小结1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为在不同放大倍数的目镜或物镜下，目镜测微尺每格代表的长度会发生变化。2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：相同。因为用不同的物镜时都重新校正目镜测微尺，目镜测微尺每格代表的长度可按照重新校正的数据计算。3．哪些因素会造成血球计数板的计数误差，应如何避免？答：器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差；由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差；由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差。前两者可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正；细胞分布误差可通过多次计数取平均值来减小。5