食品微生物检测的市场分析报告

结论：国内国际频频发生的因微生物引起的食物中毒事件，其当务之急是不断提高食品微生物的检测技术水平和检测工作质量。目前在食品微生物检验方面还存在着一些亟待解决的问题。要使基因芯片技术在食品微生物检测和研究中得到更广泛的应用，还须解决简化样品制备和操作程序、建立标准化程序、降低检测成本、提高检测人员素质等等一系列问题。前不久，卫生部公布了2003年全国重大食物中毒情况：2003年卫生部共收到全国重大食物中毒事件报告379起，12876人中毒，323人死亡。与2002年比较，重大食物中毒的报告起数、中毒人数、死亡人数分别增加了196.1%、80.7%、134.1%。仅今年1月，卫生部共收到重大食物中毒24起，376人中毒，28人死亡。卫生部工作人员说，数据的严酷是因为今年监控力度的加大，使得更多中毒事件得以曝光。"没有人真正知道中国的漏报率。"疾控中心食品所陈君石研究员说。他认为，我国目前掌握的食物中毒数据仅为我国实际发生食源性疾病的"冰山一角"。事实上，根据世界卫生组织(WHO)的估计数据，食源性疾病的漏报率在发展中国家高达95%以上，即便发达国家也在90%以上。食源性疾病是一个巨大并不断扩大的公共卫生问题。发展中国家（不包括中国）1990年发生与腹泻相关的病例约27亿例，5岁以下死亡儿童为240万。既使在发达的工业化国家，每年亦有多达30％的人口感染食源性疾病，如美国每年约发生7600万例食源性疾病病例，造成3.25万人住院和5000人死亡。然而据估计，被报告的食源性疾病病例只代表10％，甚或低于1％的真实病例。   全球食源性疾病不断增长的原因，一方面是通过自然选择造成微生物的变异，产生了新的病原体，如在人和动物的治疗中使用抗生素药物以后，选择性存活的病原菌株产生了抗药性，对人类造成新的威胁；另一方面是由于新的知识和分析鉴定技术的建立，对已广泛分布多年的疾病及其病原获得了新的认识。由于社会经济与技术的发展，新的生产系统或环境变化使得食物链变得更长和更复杂，增加了污染的机会，如饮食的社会化消费，个体或群体饮食习惯的改变，预包装方便食品、街头食品和食品餐饮连锁服务的增加等。数亿人口的跨国界行为也是食源性疾病的高危因素。大量植物性和动物性食品的贸易全球化给食源性疾病的控制和预防带来新的挑战。  世界粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）联合专家委员会曾多次指出,由于食物污染造成的疾病可能是当今世界上最广泛的卫生问题,而且也是经济生产率降低的主要原因。1980年全球人类死亡原因统计,全球当年死亡人数为5091万人,死于多种感染的高达1686万人,居各种死亡原因的首位,而其中至少有1/3的人为食源性疾病,即大约有560多万人死于食源性疾病。其中包括人们常说的食物中毒及与饮食有关的肿瘤、高血压糖尿病和心血管疾病等。 食源性疾病按其病原分类,主要分为微生物性（细菌、真菌、病毒、寄生虫），化学性和有毒动植物性。无论是国际或国内的资料都表明,食品中微生物的污染所引起的急性食物中毒是食品安全中最重要的公共卫生问题，与不同区域人群的饮食习惯有密切关系。如，美国多食肉、蛋和糕点类,葡萄球菌食物中毒最多;日本靠海,喜食生鱼片,副溶血性弧菌食物中毒最多;我国食用畜禽肉、禽蛋类较多, 以沙门氏菌食物中毒最多。近年来，国际报道并关注较多的病原主要有肠出血性大肠杆菌O157：H7，单增李斯特氏菌，多重耐药性沙门氏菌，空肠弯曲菌，戊型肝炎病毒，轮状病毒，Norwalk病毒，球性寄生虫，弓形虫，口蹄疫病毒，阮病毒等。 就人的健康和经济而言，真菌毒素是目前为止食物链中最重要的污染物之一。其中黄曲霉毒素（Aflatoxins），伏马菌素（Fumonisins），棕曲霉毒素（Ochrotoxins），脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol），雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol），玉米赤霉烯酮（Zerolaenone），T-2毒素（T-2toxin）和展青霉毒素（Patulin）等是国际普遍关注的真菌毒素。化学污染物，主要包括农药残留、兽药（抗菌素）残留、环境污染物或雌激素（二恶英biotoxin、氯丙醇chlorinatedbiphenyls）和重金属等，均可通过植物或动物进入食物链，并引起人类的疾病或健康问题。由于世界各地不断爆发的因微生物引起的食物中毒事件，各国对食品卫生安全的重视程度越来越高。因此不断提高食品微生物的检测技术水平和检测工作质量显得越来越重要。但目前在食品微生物检验方面还存在着一些亟待解决的问题。就此进行了调查，以期我公司基因芯片技术在食品微生物检测和研究中发挥积极的作用。一、政府食品安全工作的管理目前食品安全的管理应该说处于相当混乱的过程，有时一个环 节多个部门插手，有时多个环节一个部门监督，整个体制错综复杂。业内人士常以肉类生产过程中的兽药监管为例。第一个环节生产兽药的企业由药品监督管理局、工商局负责；第二个环节使用兽药的养殖业归由农业部管理；第三、四个环节即兽药载体的饲料生产企业和饲料添加剂，由农业部负责；第五、六个环节肉畜收购和屠宰企业，除个体和私营业者外，均由商业部门负责；第七、八个环节销售及卫生监督是由商业部门、质检部门和卫生部门共同负责。据《财经》杂志统计，分布在卫生、农业、质检和环保多个部门的食品安全专业人员，已经超过百万人。卫生部有国家、省、市、县四级监督管理和技术保障体系，拥有一支10万人的卫生行政执法队伍和20万人的卫生技术支撑队伍，目前已在全国部分地区设置食品污染物约3000多个监测网络。农业部建立了13个国家级质检中心和179个省级质检中心。国家质量监督检验检疫总局在全国设置的食品质量检测机构超过3000个。根据有关法律规定，城乡集市贸易的食品卫生管理工作应由工商部门负责，相应的监督检验工作由卫生部门负责。有意思的是工商部门也考虑建立自己的检测队伍。综合我国检验机构，约有一万多家。为什么这么多人还监控不好中国的食品安全问题？　　学者梅方权很不客气地指出，地方有些单位执法不力。现在的情况是，还没被曝光前谁都不去查，等被曝光了，所有单位都去报到，以显示自己执法的到位。其实现在虽然这么多管理单位，真正在监督的少，搞审批、搞认证的多。因为，那可以挣钱。国家行政学院教授、行政法专家杜钢建十分尖锐地指出，行政监管领域当中，发放许可证、执照这些审批行为，都有一定的经济价值。审批权的背后是部门利益。 中国人民大学李景胜教授说，现在一些部门名为加强监管，实则进行"有偿服务"。他觉得不可理喻的是，在国内，食品委托检验竟然要缴费，这显然违背公共监督的服务性道德。据说检验一头猪五块钱，批一个认证万把块，全国各地多少个产品，算下来该有多少个亿？所以虽然有很多单位管食品安全，但他们大都把工作重点放在最终产品监督上，都来搞抽检，搞认证。二、食品安全监测的资金卫生、农业、质检和环保等系统的食品安全检验部门主要执行国家下达的食品监督的抽查任务，同时还接受企业食品的委托检验以获得市场准入证（主要是指供应国内市场的小型企业）。首先，执行国家的抽查任务，在食品微生物检测方面，约1次/季度，均3~4次/年（40~60份样品/次）。就资金投入，拿农残检测一个案例来说明：　据了解，大钟寺市场是北京市最早建立农残检测室的批发市场，农业部启动这个项目投入了30万元，而为了维持这个检测室市场的正常运转，每年需要投入20万元。即便这样，每天该检测室也只能检测20多种样品。检测样品需要投入时间和大量试剂。进口的化学显色剂像DTNB每克480多元，BTCI每克360多元。检测样品越多，市场投入越大。同样，对于食品微生物的检测，在执行国家下达的抽查任务时，国家下拨到各系统食品安全检验部门的资金也很有限，需要监测的食品生产及经营企业多，检测的食品种类广，诸如饮料类、灭菌牛奶类 、糖果类、罐头类、奶粉、食品添加剂类、糕点类、豆腐豆制品类、快餐类以及冷冻肉类、冷冻水产品、保健食品、薯片类、加工蔬菜类等等等等。其次，按中华人民共和国食品卫生法食品准入的法规，食品在进入市场时，必须要有监管部门的市场准入证，各系统的食品安全检验部门进行委托检验，按规定收取费用。从中国肉类食品研究中心李气清教授得到的实际数据，食品微生物常规检验项目细菌总数￥50.00，大肠菌群￥80.00，致病菌包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的收费为￥190.00，需要进行非常规项目检验时再另收费，全项检验收费约为￥1000.00，不论是什么程序或采用什么技术，目前收费都一样。而其它一些地方或单位收费情况与之接近。据“北京市物价局，北京市卫生局；京价（收）字[1998]第383号”的收费规定略低于上述实际的数字。中国70%的食品制造商是小于10人以下的家庭式作坊，降低成本是他们赖以生存的必须手段，取得准入证对他们可说是一种极其额外的支出，因此，花费越低越好。　中国目前能够建立检测室的农贸市场估计至少有5000个（中国农科院潘家荣博士提供） ，而检测成本确实比较高，业内有种估计，检测成本需要占到食品本身成本的30%～40%，这样的成本谁付呢？如果政府出钱，这笔钱确实是个重大的负担；如果加在商家身上，商品涨价，造成安全认证的食品昂贵，消费者能承受吗？我们注重食品安全，但是，现在的问题是，包括政府、生产者和消费者，愿意为安全付出多大代价，可以为安全付多少代价？学者梅方权指出："按照目前的经济能力，全球的相当一部分消费者还不能支付超过普通食品价格40%～50%的额外支出。"显然，中国大多数消费者也在此列。所谓"有机蔬菜"和"绿色蔬菜"近年来在各地都是赔本赚吆喝，即是一个证明。而另一种情况是大型食品企业，他们多为食品出口企业，严格按照出口贸易国的要求或标准进行监测，从饲养、加工、生产到成品出口的一系列过程，均是按贸易国提供的标准、方法、技术、设备、试剂等进行，对于供应国内市场，对他们来说，检验与否并不重要，当然，检验的费用也不是特别考虑的。对于国家出入境检验检疫部门，他们承担的检测量较大，仅食品微生物即有均10万-数十万份/单位/年，而检测费用由受理人支付。当然，所使用的方法多种多样，根据国际标准或贸易国要求的限量标准而采用不同的被认可的检测方法。有些检验项目的检验成本高过检验收费标准，比如：出口日本的加工蔬菜，目前我国无此类产品的国标，按进口国日本标准的平皿法检验大肠菌群，使用的培养基均为进口成品培养基，成本较高。另外，为了快速、准确、有效地检测某些致病菌及危险病菌，经常用到某些仪器，比如Mini-VIDAS检测仪，其试剂全部为成套进口试剂盒，仅试剂成本就接近或超过检验收费标准。目前，微生物的检验收费仍延用旧的标准，没有考虑到当前方法的进步和仪器的发展换代所造成的成本大幅增加的问题。 三、食品微生物检验的项目检验项目表项目名称内容常规检验项目细菌总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、溶血性链球菌非常规检验项目霉菌、酵母菌、产毒霉菌、大肠杆菌、肠出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）、致泻大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、乳酸菌、嗜热菌芽孢计数、葡萄球菌肠毒素、牛奶中的抗生素等（非常规检验项目为部分样品检验）四、检验方法主要为国家标准、进出口商品检验行业标准、进口国标准。1、国家标准GB4789.2《菌落总数测定》、GB4789.3《大肠菌群测定》、GB4789.4《沙门氏菌检验》等等。2、进出口商品检验行业标准SN0168《出口食品平板菌落计数》、SN0169《出口食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》、SN0170《出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法》。3、进口国标准AOAC976.26《食品中沙门氏菌检验方法》、IS07251《大肠杆菌计数通用准则-最近似值（MPN）技术》、日本厚生省食品卫生法规小六法《大肠菌群》。无疑，传统的细菌培养法仍是金标准，因为液体肉汤和固体琼脂培养基中靶细菌的存在及计数是其增殖能力的有力证据。遗憾的是，某些难于生长的细菌培养所需时间长或生长条件复杂。 免疫学方法可快速地检测食物病原菌，如各种基质中的金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）、沙门菌（Salmonella）、利斯特菌（Listeria）和弯曲杆菌（Campylobacter）。然而，这些方法以检测细菌表面抗原为基础，不能提供有关靶细菌活动性的信息。以核酸为基础的技术，如PCR和杂交方法，也已经在食品微生物学领域得到广泛应用。尽管检测细菌特异性高，但不能获得定量结果或细菌生活力资料。流式细胞计数（FPC）及落射荧光显微镜法也用于检测食品中的细菌，但具有局限性，如检出限相当高。三、检验标准问题原进出口商品检验局出口食品的微生物检验方法采用SN（商检行业标准），而原国境卫生检疫局进口食品的微生物检验方法采用GB（国家标准），“三检合一”后，微生物检验方法就有了两套标准，即：GB和SN。一般情况下，出口采用SN检验方法标准，进口采用GB检验方法标准。两套标准间有一定差异，如：大肠菌群的检验方法，GB4789.3采用乳糖胆盐发酵培养基，培养24h，验证用乳糖发酵培养液；而SN0169则采用月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST），培养48h，验证用煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）。GB、SN中的细菌总数、利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌检验等同样存在着一定的方法差异。标准是检验、执法的重要依据，目前，在某些方面的标准（特别是国标）的制定上显得比较薄弱，如在冷冻水产品方面，冻虾仁、冻鱿鱼、冻鱼翅等均无国标；豆制品方面也一样，如蔬菜豆腐 包、鸡肉豆腐包等；其它方面还有冷冻/干燥/盐渍蔬菜、冷冻/冷藏半成品面制品、保健品、保健食品等；在检验方法标准方面，无肠出血性大肠埃希氏菌（O157；H7）检验方法的国标。由于缺乏上述国家标准，给实验室检验和行政执法在结果的综合评定上造成一定的困难，同时也容易使某些国外生产的并不优质甚至是较差的食品能蒙混进入我国市场，损害我国人民的利益和国家声誉。另外，有些国标不适应目前的需要，如在冻禽肉方面，多年来，从GB2710-81《冻鸡肉卫生标准》、GB10148-88《鲜（冻）鸭、鹅肉卫生标准》到GB2710-1996《鲜（冻）禽肉卫生标准》、GB/T16869-1997《分割鲜（冻）鸡肉》均无微生物指标要求，而实际上进出口的冻禽肉在国内外有关部门的要求下，一直在检沙门氏菌等微生物指标，后来在GB16869-2000《鲜、冻禽产品》中才加入了微生物指标，但仍无肠出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）、单核增生性李斯特氏菌的指标。而目前国际上对冻品（冻水产品、冻禽、冻肉类等）基本上都要求检肠出血性大肠埃希氏菌（O157：H7）、单核增生性李斯特氏菌，我国有关部门也要求检验。就检验技术而言，国标对于新技术、新方法的采用显得较为保守，如酶联免疫、PCR、PCR-ELISA等技术都已较为成熟，在国外检验中都有一定程度的应用，有些这方面的仪器、试剂盒已商品化生产，如Bio-Merieux公司的Mini-VIDAS仪及其试剂等应用已相当广泛，而我国国标中极少采用这些新技术与方法，对口岸要求的快速检测有一定的影响。三、食品保质期与检验周期冲突问题 食品有一定的保质期，而微生物检验同样也需要一定的时间，当食品保质期较短时，往往会与检验周期发生冲突，最明显的案例是出口供港澳的消毒保鲜牛奶，保质期为5d，而抽样检验周期约需3d，等检验结果出来后，再运输到港澳就已接近保质期，完全失去了销售价值。受客观因素限制，目前出口消毒保鲜牛奶是边检验边放行，存在着一定风险。在港澳市场上，也有从其它国家空运来的生产日期即为运抵当日的奶制品，没有随附出口国检验证书，其出口检验在短期内同样难于完成。食品保质期与检验周期冲突问题，在国内外都客观存在，如何尽量解决好这一冲突是一个值得探讨的问题。三、基因芯片技术按照传统的检测方法，目前的微生物检验方法对牛奶等保质期短的食品显然是不适宜的，建议对这类产品的出口企业要求全面实施HACCP体系，以满足此类产品的出口需要。同时应加快符合我国国情的微生物快速检验方法的研究。目前虽然国际上已有一些较成熟的微生物快速检测系统，如Bio-Merieux公司生产的“Bactometer”微生物检测计数仪，其测定牛奶中的细菌总数仅需6~24h、大肠杆菌6~14h等，但其价格高，检验成本大，难以满足我国的需要。自二十世纪八九十年代以来，食品微生物检测和研究在快速自动化采样和检测方面取得了较快的进展，生物传感器、基因分析及酶联免疫分析等技术在食品微生物学检测中被广泛应用。然而，上述生物学技术一般每次仅能检测一种食源性微生物，无法全面分析检测食品中所存在的微生物的种类、分布及数量，这是食品微生物学亟待 解决的一个重要问题。进入本世纪后，随着大量细菌，酵母菌等微生物基因组测序的完成以及新近发展起来的基因芯片技术的建立与广泛应用，为全面快速准确地分析鉴定水体、空气、土壤和食品等环境中的各种微生物提供了一种崭新的技术工具和平台。一）与传统方法相比，基因芯片技术先进性主要体现在：Ø可以对环境中的微生物实现高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；Ø整个检测4h~6h基本可以出结果，而传统方法一般需4-7d时间；Ø特异性强，敏感性高。二）基因芯片的步骤1、PCR扩增引物及芯片探针的设计与合成2、基因芯片的制备，杂交检测和结果分析3、样品的采集制备和DNA分离纯化微生物在食品中的分布具有随机性、低分度、种类广的特点，食品卫生检测工作日常检测的食品种类多、样品数量大，因而利用基因芯片技术检测食品中的微生物首先需要解决采集典型样品、大范围筛选及分离纯化食品中低丰度DNA等问题。食品中微生物靶核酸浓度低、异质性强，同时PCR扩增对DNA的纯度要求高；因此分离纯化微生物DNA是包括基因芯片技术在内的食品基因分析检测的难点。三）近年来许多研究者对基因芯片分析检测食品中常见致病菌 进行了一系列探讨：Borucki等构建的混合基因组微阵列可准确鉴别各种近缘单核增多李斯特菌分离物；Volokhov等通过单管复合体扩增和基因芯片技术检测和鉴别6种李斯特菌；Call等通过分析EcoliO157-H7的Shiga样毒素I，Shiga样毒素II及溶血素A发现基因芯片可准确检测各种EcoliO157-H7分离物；Chandler等确定免疫磁珠分离结合微阵列可检测生禽肉清洗液中的EcoliO157-H7，其检测限达103cfu/ml；空肠弯曲菌是食源性腹泻的主要病因，但其主要生物学特征尚不甚了解，Dorrell等通过比较11株空肠弯曲菌的全基因组序列证实该菌荚膜决定Penner血清型，为确定该菌致病性相关指标指出进一步研究的方向；Wilson等采用病原体诊断区基因扩增和20寡核苷酸藻红素标记探针开发出一套多病原体识别（MPID）微阵列，可准确识别18种致病性病毒、原核生物和真核生物，对炭疽杆菌的检测限低至10飞克（×10-15）。Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究大肠杆菌、志贺氏菌及沙门氏菌的抗原决定簇和毒力因子与其致病性的关系，发现细菌毒力因子可用于肠道致病菌的分析检测。四）基因芯片检测食品微生物的灵敏度 食品微生物中检测病原体的最低要求是能在25g样品中检测到1个活细胞，显然目前的基因芯片技术达不到这一要求。为了提高基因芯片检测的灵敏度，一方面应在靶核酸分子与芯片杂交前除去各种杂质，这样即可提高检测的信噪比，又可防止杂质堵赛芯片。另一方面应通过PCR扩增或体外培养增殖等方法提高病原体的数量。五）微生物的死活食品样品中检测到微生物靶核酸分子仅表明样品中确实含有某种微生物，但无法确定该微生物是否存活。那么，有专家提出，微生物是否存活？与是否引起食源性疾病，其相关性有多大？是一个值得思考的问题。因此，必要时也要采用一定的方法确定微生物是否能在培养基中生长。六）芯片的检测品种在食品微生物实际检测中，常检项目仅有细菌总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、溶血性链球菌，而其它仅仅在必要时检测，因此，基因芯片上是否有必要同时处理各种致病微生物？深究其实际意义也显得非常重要。七）应用前景展望用一种方法采集、处理和分析食品中的各种致病微生物是食品微生物学家多年的梦想。近年来，在样品采集、处理以及基因芯片技术等方面的进展为实现这一梦想提供了坚实的基础。然而，要使基因芯片技术在食品微生物检测和研究中得到更广泛 的应用，还须解决建立标准化程序、降低检测费用、简化样品制备和标记操作、进一步提高检测的特异性等一系列问题。三、综合分析一）无疑，法规的完善与降低检测费用需要一定的时间，而这些决不是一件随便哪个人或哪个部门能决定得了的。检测成本高，检测成本占到食品本身成本的30%～40%，这样的成本强加到任何人身上都是负担，而与之相应的是收费标准的固定而又偏低，检测单位只能是尽可能地使用能降低成本的技术或方法。实际上，已经有很多好的技术或方法，推广到检测部门去，但由于成本高的原因，迟迟不得采用。二）各种标准的统一，客观求是，据了解，这是一件令业内人士摇头的事情，非常复杂，非常难办；一些先进技术的被采纳、被认同，也许也需要一定的时间。也正因为此，为国外商家提供了机会，他们使用的技术或方法，灵敏度高，对我们进行技术壁垒，若我们出口，要采用他们的技术，使用他们的仪器，消耗他们的试剂，而一些不被认可的技术很难被接受。三）我国检验机构有一万多家，但是资源的配置极不平衡，技术力量参差不齐，技术储备不足，比如检测微生物的技术人员已经习惯了传统的方法，接受新的技术需要一定的时间。 一）基因芯片法无论是检测时间、灵敏度上都具优越性，但由于需要配备扫描仪，消耗芯片、试剂，成本会比较高；由于它采用了分子生物学的技术，因此对于基层单位（大多仅有简单的实验室）是否能够接受？也是值得考虑的问题。二）总之，如上所说，基因芯片技术在食品微生物检测和研究中得到更广泛的应用还需要解决一系列问题。 食品微生物检测的市场分析报告市场部韦欣妤二○○四年十二月十三日 目录一、政府食品安全工作的管理二、食品安全监测的资金三、食品微生物检验的项目四、检验方法五、检验标准问题六、食品保质期与检验周期冲突问题七、基因芯片技术一）与传统方法相比，基因芯片技术先进性主要体现二）基因芯片技术的步骤三）近年来一些研究者对基因芯片分析检测食品中常见致病菌进行的探讨四）基因芯片检测食品微生物的灵敏度五）微生物的死活六）芯片的检测品种七）应用前景展望八、综合分析