微生物多样性的观察

微生物多样性的观察摘要：微生物在自然界广泛分布，无所不在，无论在万米高空，还是在深海，或是地壳、高原冻土，抑或极地冰芯，火山喷发地区、盐湖、热泉等都能寻找到它们的踪迹；可以这么说，微生物的生存环境涵盖了地球上的所有生境。为此，了解环境条件与微生物的关系对于理解微生物世界的多样性尤其重要。本实验采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基三种培养基对空气、水、土壤等采集到的样本进行观察，了解土壤、水体、空气中微生物的种类、数量和分布差异；了解微生物几大类群（细菌、放线菌、真菌和噬菌体）的多样性，辨识三大类菌群菌落的基本形态特征和差别；了解和掌握一些土壤、水体、空气和植物体微生物采集的常用方法。掌握如何从各种环境中采样、分离筛选和纯化功能性微生物，同时对其功能进行分析和初步了解；掌握功能性微生物的菌种保藏和分类鉴定方法。关键词：环境微生物分离纯化1实验原理及材料1.1自然环境中的微生物都是混居形式的，并且不同的环境下具有不同的微生物类群和区系，不同的微生物具有不同的营养需求和生长条件，通过不同的培养基和适当的分离方法就可以将以混居形式存在的各种微生物分来开来并得到它们的纯菌株，从而了解这些环境中的微生物类群和数量。分析微生物的数量和种类，首要的一步就是采取微生物的样品。采集微生物样品时，一般应当场做好采样记录，并用照相机拍摄采样点周围环境。采样记录项目应包括采样地点（包括地理位置、海拔高度、向阳程度、雨量、年平均温度和温差等）、日期、人员、样品编号、样品类型、采样深度、环境条件等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。1.21.2.1微生物多样性的表现之一就是其形态结构的多样性。微生物的形态结构特征包括个体形态结构与群体形态结构，个体形态结构主要通过显微镜以及染色技术辨别其形态构造；而群体形态则是通过单个微生物细胞在固体培养基上经生长繁殖后所形成的菌落（子细胞集合）来认识。肉眼观察在固体和液体培养基中培养的细菌菌落和菌苔的大小、形状、光泽、颜色、硬度、色素、生长速度、透明度以及生长状况等特征。采用显微镜观察细菌细胞的形态、大小和特殊的结构（如芽孢、颗粒内含物、荚膜），测定革兰氏染色反应、抗酸反应结果。利用扫描和透射电子显微镜观察细胞壁、鞭毛、纤毛和菌毛等细微结构的特征。1.2.2革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，该方法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram创立的。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色（图1-2-1A、B）。1.2.3芽孢、荚膜和鞭毛是细菌菌种鉴定的重要指标，在菌落形态上也有其相关特征。芽孢壁很厚且结构致密，着色不易，一般采用碱性染料并且加热和延长染色时间可以使得芽孢着色，通过水洗和复染可是使芽孢细菌染成两种颜色（图1-2-1C）。荚膜是一种含有多糖和蛋白的胶状粘性物质，结构疏松，与染料的亲和力低，采用负染的方法可将菌体与背景着色而荚膜透明以利观察。1.3 放线菌与细菌一样，属于原核微生物，但是其形态构造和繁殖方式与细菌具有很大的差别。真菌包括酵母菌、霉菌和蕈菌，为真核微生物，其中酵母菌为单细胞真菌，而霉菌则是丝状真菌的别称。放线菌和霉菌都具有比较发达的分枝菌丝，其中放线菌的菌丝体由伸入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝组成，气生菌丝可进一步分化为孢子丝。孢子丝和孢子的形态与颜色是放线菌分类的重要依据。霉菌在培养基上的生长方式类似放线菌，吸收营养的菌丝伸入于培养基里面，培养基表面以上的菌丝具有不同程度的结构与功能分化，形成子实体并可以产生各种类型的孢子。为了能比较完整的观察到形态比较完整的放线菌和霉菌的形态结构，通常可以采用插片培养法或搭片培养法来解决。当插在培养基中的盖玻片被取出时，沿着玻片两面生长的放线菌或霉菌能较好地反映自然生长状态的形态结构，有利于更好的显微观察。1.4噬菌体是细菌病毒的通称，是一类只能在电子显微镜下才能观察到的非细胞分子生物，专性寄生于活的原核微生物细胞内。就噬菌体与宿主细胞的相互关系来说，可以将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，前者在宿主细胞内的繁殖可以导致细胞的完全裂解，而后者在宿主细胞内多以溶源状态存在，只有在受到外界环境因素诱导或低频自发性诱因才会使得宿主细胞发生裂解。由于噬菌体生命属性的特殊，因此研究它们的方法学和前面所述的几类原核微生物和真核微生物都有明显的区别，比如分离方法、培养方法与检测方法等。对噬菌体的研究导致了一批重大的生命科学现象的发现。1实验方法2.12.1.1在选好适当地点后，用灭菌小铲子除去表土和地面植被及枯枝落叶，然后用土壤采样器采取离地表以下5-15cm处的土约10g，剔除石砾并混合均匀后盛入清洁的信封中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。采样使用ETC桶式深水采样器采取环境中的水，备用。在约定的时间和地点（室外环境和室内空间各一组）依次打开皿盖在空气中暴露5min。然后合上皿盖并做好标记即可。称取2克土壤样品，放入盛有18mL无菌水并带玻璃珠的三角瓶中（玻璃珠的主要作用是打散土壤样品），振摇15min，使得土壤与水充分混合，将微生物细胞均匀分散。静置5min后，用移液器戴上无菌吸嘴从中吸取0.1mL土壤悬浮液，加入事先盛有0.9mL无菌水的离心管中并吹吸混匀。然后用换一支无菌吸嘴从此离心管中再吸取0.1mL加入下一支0.9mL无菌水的吸管中混匀。按此法类推，制作10-1，10-2，10-3，10-4等不同稀释度的土壤溶液。取上述稀释土壤样品液各0.1mL，分别加在已经制好的牛肉膏蛋白胨、高氏一号和马铃薯培养基平板上。将以上所有接种有环境样品的培养基平板涂布后，倒置放在合适的温度下进行培养留待下次实验使用。2.1.2口腔微生物采集与简单染色观察1)先取干净的载玻片一张，在载玻片中央滴上一小滴蒸馏水。2)用无菌牙签在口腔内牙缝中反复擦拭几遍，刮下少许牙垢然后将其在水滴中打散并涂布于载玻片上。3)自然干燥后通过酒精灯火焰2~3次加热固定。4)将沙黄染液滴在玻片中央的干燥涂面上，静置染色3~5min，用水将多余的染液洗掉并用吸水纸把残余的水分吸干，待充分干燥。5)在显微镜下按照从低倍到高倍，再到油镜的顺序进行观察。2.22.2.1菌落的观察。菌落形态特征包括大小、颜色、边缘、质地、表面形貌、湿润或干燥、光滑或皱褶、是否隆起，是否产生色素、同心圆等。2.2.21)制片：在一干净载玻片上的三个区域做上标记（＋、待测、－）。将玻片翻转，在标记的相应位置各滴加一小滴蒸馏水。用接种环分别挑取一环标准革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）斜面或液体培养物，以及实验一细菌分离平板上的单个菌落的少量菌体（需提前24h 活化培养），分别与上述三个水滴混合，均匀涂开制成一薄层细菌涂面。自然干燥或将细菌涂片通过酒精灯火焰数次（每次用手背测试玻片，以不烫手为宜），用热空气将玻片烘干，以使菌体能够被固定在载玻片上。2)染色：①结晶紫初染：在上述细菌涂片区域滴加草酸铵结晶紫溶液（以覆盖样品为准），1min后使用慢速水流（水流与载玻片的距离应尽量短，以免过大的水流将样品冲掉）将染液洗掉；②碘液媒染：在样品上滴加卢戈氏碘液覆盖初染面以加强结晶紫的染色效果（碘与结晶紫可形成大分子复合物，嵌固在细胞壁肽聚糖层中），1min后水洗。③酒精脱色：将载玻片倾斜，使用95%酒精由玻片一端缓慢滴下对染色菌体进行脱色。10-15秒后，然后立即水洗去除残留的酒精。④沙黄复染：将沙黄染液滴加于玻片上，使之覆盖细菌涂面约5min，水洗后放在干净吸水纸上，将纸折叠轻轻沾去残余液滴，然后在酒精灯火焰上方20-30cm处用热空气将玻片的水分完全烘干；⑤镜检：遵循低倍-高倍-油镜的顺序依次观察显微镜视野中的细菌样品，当使用油镜观察时注意将显微镜的聚光镜提升至最高，光圈关闭至75%以上，以便能清晰地观察到物像。⑥结果判定：在油镜下观察自土壤中分离的细菌颜色，并与标准的革兰氏阴性和阳性。2.2.3细菌的芽孢、荚膜染色和观察细菌的芽孢染色方法：同实验一中简单染色方法，由于芽孢致密光滑很难被染上染色，仅在边缘芽孢衣被染上颜色，因此在高倍镜和油镜下，可以观察到菌体显示为蓝紫色或红色，而芽孢则显示为无色透明的亮圈。（用孔雀绿进行芽孢的复染色法参见模块备选实验）细菌荚膜的染色1)制片：在一块干净的载玻片上面滴加一滴蒸馏水，无菌操作挑取一环硅酸盐细菌的斜面培养物与蒸馏水混匀涂布，或用一片载玻片将其推抹成一薄层，自然晾干或用滴加结晶紫初染1min用蒸馏水洗去残余染液滴加碘液媒染1min用蒸馏水洗去残余染液酒精脱色10-15秒迅速洗去多余酒精沙黄复染5min用蒸馏水洗去残余染液用吸水纸将玻片沾干吹风机冷风吹干。2)染色：滴加几滴碱性复红染液染色5-10min，然后将多余的染液洗去。在载玻片的一端滴加黑色素染液一滴，然后用另一块干净的载玻片的短边将墨汁推向细菌样品液滴直至推到第一块载玻片的末端为止，以形成一个均匀的墨汁与样品混合的推片，在空气中自然干燥或者用吹风机的冷风将其吹干。3)镜检：先高倍后油镜的顺序观察染色样品，可以观察到红色的菌体以及不被着色的荚膜形态。2.2.4放线菌和真菌的插片、搭片的制备和培养1）插片培养放线菌和霉菌接种：每组准备厚高氏1号琼脂培养基或马铃薯培养基各1块（每皿约20mL），用接种环挑取少量实验一平板中霉菌或放线菌孢子，在平板培养基的上做连续划线接种（接种量可适当加大）。插片及培养：用无菌镊子取几片无菌盖玻片，依次在已接种平板上以30°角斜插入培养基内，插人深度约占盖玻片1/3长度（图1-2-6A）。将插片平板倒置于28℃，放线菌培养5~7天左右。霉菌一般培养不要超过5天，一旦孢子囊梗形成，及时取出至冰箱保存，或在较低温度23℃培养一周，否则孢子易散开，影响孢子梗形态结构观察。2）搭片培养霉菌霉菌培养也常采用搭片培养方法。将融化的PDA培养基，用无菌滴管取一滴置于无菌载玻片上。待其冷却凝固后，再将霉菌的孢子悬液接种在这少量培养基上。取一片无菌的盖玻片，轻轻放置在已凝固的培养基液滴上，使得载玻片和盖玻片之间留有空隙。将全班所制搭片集中摆放在带有盖子的托盘内，托盘内事先用湿纱布垫好，盖好盖子后置于28℃，培养3天。待菌体生长后，有许多菌丝与盖玻片接触，并在盖玻片上分化出菌丝、孢子囊梗等结构。2.3观察霉菌菌丝及子实体形态结构。利用显微镜目镜测微尺的校正及测定酵母细胞和芽殖细胞大小。利用血球计数板显微直接计数法测定酵母细胞的数量。2.41)取噬菌体12h增值液各1mL分装在两只灭菌小离心管内。8000rpm离心5min，去除大多数菌体和培养基残余物。2)将上清用0.22μm孔径的微孔滤膜进行过滤除菌，得到裂解液1mL。3)在一块制好的牛肉膏蛋白胨平板上滴加0.2mL的裂解液，无菌操作，用玻璃涂棒将样品均匀涂布，37℃培养，以检测过滤是否彻底。余下的滤液做后步处理。 4)将滤液在无菌小离心管中用无菌水进行10倍梯度稀释（10-1~10-6）；5)在四支离心管中分别加入0.1mL对数期大肠杆菌培养物以及10-3~10-6稀释度的噬菌体悬液各0.1mL，混匀后于37℃保温5-10min。待噬菌体吸附并侵入寄主细胞。6)将上述噬菌体和敏感菌的混合液加入9mL50℃左右的牛肉膏蛋白胨半固体培养基试管中，立即揉搓试管使培养基与菌液充分混匀，然后迅速倒入标有四个稀释度的底层琼脂平板上，铺平冷却待凝；7)四个稀释度的双层平板倒置培养于37℃24h，观察平板上的噬菌斑。3实验结果及分析3.13.2.1土壤10-3（PDA）多呈圆形，多数菌落较小，有部分较大的菌落，边缘整齐，表面呈隆起状，质地较疏松，颜色为乳白色或黄色，无光泽，湿润。库水10-2（牛膏膏）未见明显菌落库水10-2（高氏一号）呈圆形，菌落较小，较密集，边缘整齐，表面为隆起状，也有中心凹状，质地较软，颜色有黑蓝色、红色和乳白色，无光泽，有干燥的菌落也有湿润的菌落塘水10-3（牛肉膏）无明显菌落土壤10-3（牛肉膏）形状多呈圆形，也有不规则的形状，圆形的菌落较小，边缘整齐，不规则的菌落较大，边缘不整齐，圆形的菌落中间呈隆起状，不规则的菌落呈中心凹状，质地较软，多为白色或黄色，无光泽，干燥。标准革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）蓝紫色样品革兰氏阳性见下图革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）红色革兰氏染色结果 3.2.2荚膜的观察由于染色不成功，所以未能成功看到荚膜。3.3放线菌、霉菌的形态观察3.3.1放线菌AB气生菌丝有螺旋，螺旋方向向左呈带状，螺旋向右基内菌丝有螺旋，螺旋方向向左未见明显螺旋3.3.2霉菌A有无横隔有有无孢子囊未见有无孢囊梗未见有无孢子有（麦穗状孢子穗）（注：在培养皿中只培养出了一种霉菌见下图）3.3.3测定酵母菌细胞的大小标定的测微尺：(6/23)*10=2.6μm组数12345678910刻度数2.11.821.721.81.52.51.92.2 平均大小为：1.95*2.6≈5.1酵母菌显微直接计数（血球计数板）实验组别区域1区域2区域3区域4区域5平均值1282316391825.42272321302624.8平均数为：25每毫升酵母中细胞浓度为107个3.4噬菌体的扩增、培养与检测未见明显噬菌斑（可能原因：样品中噬菌体含量过少；过滤不彻底，混入细菌影响噬菌斑的产生；在稀释的过程中，未能充分振荡。）4结论通过本次试验，了解和掌握了采样并对环境微生物进行分离提纯等方法。掌握了观察微生物的形态特征和科学统计微生物的手段，充分认识到了微生物在生活生产中的广泛性和重要性。对细菌，霉菌，放线菌等微生物有了较全面的认识，并对病毒——噬菌体有了初步的概念。