第九章农药生物测定

第九章农药的生物测定1 一、生物测定的基本原理和内容2 概念农药生物测定是指用活体生物对农药的毒效、毒性进行的测定评价。是测定药剂有无生物活性的基本方法。农药生物测定与室内毒力测定一般没有严格区别，多半是指在室内进行的测定。3 包括利用标准供试生物对农药有效成分含量的测定农药在室内外对病虫草药的测定农药在动、植物体内残留量的测定对病虫草抗药性的测定。4 生物测定的基本原理利用生物体对农药的反应性质和程度来鉴别和测定农药的生物活性及其相关性，即对昆虫、病原菌杂草及高等动物毒性、作用方式、作用程度，用以比较毒力或药效。5 主要研究内容主要研究内容综合其在农药研究和植物化学保护应用中的作用，生物测定包括：室内毒力测定、田间药效试验和微量毒物的定量生物分析。6 A室内毒力测定1、活性化合物的筛选（初筛/复筛），主要研究大量化合物的活性筛选。2、有害生物的抗性研究研究农药的作用机理及生理效应，以及农药对植物的生理作用等。3、测定农药的有效含量及残留量。4、研究农药理化性质和剂型与毒效的关系。5、农药复配的共毒系数测定。7 B田间药效试验田间药效试验是在自然或一定的人为控制条件下进行的生物测定，是一种综合评价药剂使用价值的试验方法。是一种新化合物能否成为农药的关键性阶段。8 田间药效试验可分为：小区试验大区试验大面积示范试验其中小区和大区药效试验都是在有限的范围和面积内进行的，有一定的局限性，通常还要进行大面积示范试验以取得验证并迅速推广。9 田间药效试验包括以下内容（1）农药品种比较试验（2）不同剂型比较试验（3）农药应用技术试验（4）农药（剂型）的理化特征与药效的关系（5）对寄主植物的药害及对生物群落的影响，尤其是对害虫天敌的影响试验。10 二、试验设计原则和步骤11 （一）试验设计原则1．相对控制环境条件（1）室内生物测定多属单因子试验。如：控制施药剂量，靶标生物的死亡率，控制试验的温湿度条件等。（2）田间试验多因子试验设计，对于大面积的试验区难以形成人工控制的条件，仅能对土肥、病虫分布、长势等进行小区控制。加强田间管理，尽可能避免与试验无关因素的影响12 2．设立对照，消除试验中的偶然误差在农药试验中通常所设的对照有：（1）空白对照（2）溶剂和乳化剂试验（3）标准药剂试验13 3．各处理设立重复，减少误差从生物统计的理论上讲，重复次数越多，其平均值就越接近真实值，试验结果也越可靠，但工作量太大。通常在生物测定中，每处理设3～5个重复，每重复采样数因测定对象而定：如某种杀虫剂对小菜蛾的毒力测定，每处理可用30～50头3龄幼虫。14 4．统计分析试验结果运用生物统计分析原理，总结归纳实验数据，化繁为简，找出规律，科学地反映出农药与病虫害间的内在联系，给出结果。主要用显著性测定（方差分析，t值或F值测定）。15 （二）设计步骤1．选择合适的试验对象2．确定药剂的用量（浓度）及用法（点滴、浸渍、喷雾、药膜等）3．确定试验结果的观察方法，如LD50、ED50、LC50等指标4．确定试验设计方案5．试验的实施试验结果的生物统计分析16 第二节杀虫剂室内毒力测定17 杀虫剂的室内毒力测定是不断地开发新的有效杀虫剂，改善和提高现有杀虫剂的使用效果，减少环境污染的必要手段。测定所得结果是安全、合理、经济、有效的使用杀虫剂的依据；可有效监测害虫的抗性动态，有利于克服害虫抗药性以及保持自然环境的生态平衡。18 主要的研究内容包括：（1）测定杀虫剂对昆虫的效力。（2） 筛选新农药及探索新化合物的化学结构与毒效关系的规律（即构效关系的研究，较多地运用于计算机辅助开发新农药的过程）。如溴氰菊酯有8种异构体，但只有右旋顺式体对昆虫的毒效最高。六六六的8种异构体中，也只有丙体666的毒效最高。（3）研究杀虫剂的理化性状与毒效的关系及鉴定加工剂型的质量。（4）研究目标昆虫的生理状态及外界条件与药效的关系。（5）测定不同杀虫剂混用的效力以及寻找增效剂等。19 一、标准试虫的饲养杀虫药剂的室内毒力测定，需要虫态、龄期、营养及生活力状况良好和发育一致的大量昆虫作材料。而从田间采集的昆虫生理生化状态（虫龄、抗性水平等）往往差异较大，测得的结果误差很大，不符合试验要求。因此，必须在实验室内大量饲养标准化的试虫。20 常用的室内饲养的试验昆虫种类很多，可根据不同的试验目的，选择不同的虫种进行饲养。昆虫的室内饲养的环境应尽量满足该试虫的最适发育温度、湿度、光照等条件。饲养的饲料可分为天然饲料和人工饲料。一般以人工饲养来代替天然饲料，以便长期长期稳定的供给昆虫饲养的需要。21 棉铃虫的饲养棉铃虫（HelicoverpaarmigeraH.）属鳞翅目夜蛾科。食性杂，可长年饲养。但因幼虫在三龄期以后有相互残杀习性，须单头饲养。连续大量饲养可采用人工饲养。22 （1）人工饲料配方A．含大豆粉和玉米粉的饲料（a）饲料组成熟大豆粉（g）20.0玉米粉（g）30.0大麦粉（g）30.0抗坏血酸b）0干酵母（g）8.0琼脂（g）3.5苯甲酸钠（g）0.8棉油（ml）0.536％醋酸（ml）6.010％甲醛（ml）1.0水（ml）20023 （b）配制方法大豆粉蒸熟。将甲醛、棉油和苯甲酸钠放在占总水量10％的水中，再加入玉米粉等其他成分搅拌；加另外90％的热水，以溶解琼脂，冷至70℃时与上述组分混合搅拌；饲料均匀平铺在瓷盘上，厚度0.5—1.0cm，冷却后切成重5g左右小块，分装于养虫管中备用。24 B．含棉叶粉的饲料（a）饲料组成干棉叶粉（g）7.0尼泊金（g）0.25熟豆粉（g）7.5琼脂（g）1.5多维葡萄糖（g）1.9自来水（mL）600抗坏血酸（g）1.9酵母片（粉）（g）4.525 （b）配制方法将黄豆粉置高压灭菌锅内，经30分钟灭菌（15磅压力），取出凉干备用。把酵母片研成粉末，置紫外线灯下灭菌30分钟。将琼脂放入200ml水中加热熔化，再加入400ml水、熟豆粉、多维葡萄糖、抗坏血酸、尼泊金、干制棉叶粉，充分拌匀后，分装于指形管中，每管10g左右。26 （2）饲养方法将初孵幼虫移入装有人工饲料的指形管中，每管１头，管口盖上棉布，用橡皮筋扎好。幼虫在内取食，直至老熟，勿须再换饲料。幼虫进入预蛹期，即转移到盛有无菌细土的养虫缸内，泥土必须保持湿润，以利入土化蛹和蛹的存活。成虫羽化后，雌雄配对，放入马灯罩中，罩内放一个内有10％蜂蜜液的小瓶，瓶中插入一束上粗下细的脱脂棉条，以便蛾子从棉条上吸取蜜液。马灯罩下铺上纱布，并用橡皮筋扎好。蛾子在罩内交尾产卵，每日将产于纱布上的卵连同纱布取下，并换新纱布和蜜液。有卵纱布放入养虫缸中的饲料上，缸口糊白纸，以防幼虫外逃。或用黑布将缸口封住，布上压玻璃板，缸下部对着光源，孵化的幼虫可很快到饲料上取食。（3）饲养条件养虫室温度保持26～28℃，相对湿度60％～70％，10小时/天光照。幼虫历期22天左右。27 二、供试昆虫的准备为了使毒力测定的结果可靠稳定，除了严格控制每次试验过程中的条件外，杀虫剂毒力测定要求所用试虫群体质量的均匀一致，除饲养的试虫外，从野外采集的田间试虫，应进行分离和严格挑选，如虫期、龄期、性别等，使之达到群体质量均匀，尽可能地减少试验误差，保证获得满意的结果。移虫前应该净手及消毒，避免药剂或有害病菌污染虫体；操作时要细心，不要碰伤虫体。28 1移取试虫的方法毒力测定时，首先应将试虫从饲养缸（笼）中快速移出，且不能损伤虫体。根据毒力测定所用的昆虫种类、个体大小、生活习性和特点不同，以及移取的工具和方法的差异可分为机械法，化学法和趋光法。29 1.1机械法对于菜青虫、斜纹夜娥等活动能力不大或有假死性的试虫，可采用最简单的取虫工具，如镊子来移取。而一些体型小、体软或易碰伤的试虫，如蚜虫、红蜘蛛、小菜蛾等，可用毛笔移取。一些活动能力不大、微小或易受机械伤害的目标昆虫（如杂拟谷盗、米象、蚜虫和虫卵等）。此类试虫用上述方法移取困难，费时或易造成伤害，可用真空或喉管空气注射吸虫法移取，既方便又快速。30 1.2麻醉法移取飞翔或活动能力强的试虫时，常采用麻醉法处理，以达到试虫混匀移取的要求。但是麻醉处理对昆虫的生理状态有一定影响，因而要注意麻醉时间，以免对试虫造成伤害。1.2.1二氧化碳法用CO2或CO2与空气（3：1）混合气体麻醉法，可用于大多数试虫。可在一个密闭容器里放入试虫，然后通入二氧化碳即可进行麻醉。1.2.2挥发蒸气法在密闭广口玻璃容器（如干燥器）中，放入三氯甲烷与酒精（1：1）、三氯甲烷与乙醚（1：1）、乙醚与酒精（1：1）或乙醚等药品，进行麻醉。麻醉时间随各种试虫群体对麻醉剂的敏感性和所要求的麻醉程度不同而定，如家蝇的麻醉时间一般在4min以内。31 1.2.3乙醚低温麻醉法用试管扣试虫，再用棉花蘸少许乙醚并把乙醚挤干后，封住管口，然后把麻醉的试虫倒放在垫有冰块的器皿上，以保持虫体在冷冻状态，便于操作处理。此法具有麻醉时间短、见效快和无死亡等优点，此法使用于家蝇等飞翔能力强的试虫。1.2.4冷冻法适用于蜚螃、家蝇等试虫。一般分两步进行，先将试虫置于5℃条件下冷冻10min，然后移至0℃条件下冷冻2－3min取出。这样冷冻的效果较好，对试虫的生活力无不良影响。该法所需时间较长、需要冷冻设备；在室温20℃以上时，经低温麻醉的试虫，恢复较快，不便对试虫进行分离操作。此外，冷冻处理时间过长，对试虫的生理状态和抗药力均有一定程度的影响，在使用时要注意掌握时间。32 1.3趋光法用强光照射时，家蝇、果蝇等试虫会向光源群集，利用昆虫的这种趋光性来移取试虫。如家蝇成虫，家蝇从饲养笼中向着阳光或灯光飞到移取笼中。该法移取的试虫均匀性较差，先移出的试虫多为生活力较强的个体，且易造成虫体损伤或飞逃。33 三、杀虫剂毒力的表示方法毒力即是农药的毒性程度。常用的杀虫剂毒力表示方式：致死中量(MedianLethalDose)，即杀死供试昆虫群体半数个体所需要的剂量，常以LD50表示；致死中浓度(MedianLathalConcentration)，即杀死供试昆虫群体一半个体所需要的药剂浓度，以LC50表示；致死中时(MedianLethalTime)或击倒中时(MedianKnockdownTime),即杀死或击倒供试昆虫群体一半个体所需的时间，单位示分钟，记做LT50或KT50。同时，在不同药剂间毒力比较时，还常常使用LD95或LC95来描述杀虫剂毒力,即杀死昆虫群体95％的个体所需的药剂剂量或浓度。34 四、杀虫剂毒力测定的常见方法杀虫剂对不同种类的害虫毒力程度各异，且致毒的方式也不一样，毒力测定的方法也很多，根据杀虫剂的作用方式可分为四种：胃毒作用、触杀作用、内吸作用和熏蒸作用的毒力测定。35 1．胃毒作用(stomachaction)的毒力测定利用害虫的贪食性，使杀虫剂随食物一起被目标昆虫吞食进入消化道而发挥毒杀作用。常用的有叶片夹毒法、液滴饲喂法和口腔注射法三种（1）   叶片夹毒法（sandwichmethod）此法适用于植食性、取食量大的咀嚼式口器的昆虫，如鳞翅目幼虫、蝗虫、玉米螟等。基本过程是用两张叶片，中间均匀地涂上一定量的药剂饲喂目标昆虫，然后由被吞服的叶片面积推算出吞服的药量。此法最大的优点是可以减少目标昆虫与药剂的接触，避免发生触杀作用，操作方便，结果比较精确，仍然是目前较理想的胃毒剂毒力测定方法。但是准备夹毒叶片、计算吞服面积等需大量的人力物力，每次处理的样品不能太多。36 a.夹毒叶片的准备将采回的植物叶片用水洗净，待表面水分挥发后，用打孔器制成2cm直径的圆叶片，其中一片的一面定量涂（喷）上药剂，另一片则涂上淀粉糊（或面粉糊），小心地将两片叶片对合制成夹毒叶片。将夹毒叶片按不同剂量饲喂已知体重的目标昆虫。叶片被食后，将剩余叶片移置于有方格纸的玻片上，在放大镜下计算所吞食叶的面积。37 b.饲喂方法为保证试虫有较大的取食量，在饲喂前应饥饿5~8小时。将试虫逐一称重编号，单独饲喂，取食一段时间后取出叶片，根据取食面积计算取食量。（取食时间一般为10分~2小时）单位体重目标昆虫吞食药量可按下式计算：38 c．结果记录昆虫取食后放入干净的容器中，放入新鲜的叶片，在24~72小时后检查死亡率d．计算致死中量39 （2）   液滴饲喂法（feedingofmeasureddrops）不宜用夹毒叶片法测定杀虫剂对舐吸式口器昆虫的毒力，如家蝇、果蝇、蜜蜂等昆虫喜食糖液，可将一定的杀虫剂加入到糖液中，用微量注射器形成一定大小的液滴（0.001~0.01ml），直接喂试虫；或将形成的液滴放在玻璃片上，让家蝇等目标昆虫自行舐食，试虫在舐食前后都称重，以确定其取食量。目标昆虫经药剂处理后，移入清洁干燥的器皿中，置于27℃的条件下定期观察反应情况，计算死亡率，求出致死中量（方法同前）。40 （3）   口腔注射法适用于个体较大的咀嚼式口器的昆虫，但该法从口腔注入药液时易刺破口腔内软组织，技术难以掌握，故目前很少使用。41 2．触杀作用（contactaction）的毒力测定通过昆虫体壁进入虫体而致死的杀虫剂称为触杀剂。在测定药剂的触杀毒力时，应尽量避免药剂从口器或气孔进入虫体。常用的有直接和间接两种方法：2.1直接滴加2.1.1点滴法（Topicalapplication）点滴法是将一定浓度的药液点滴于虫体上的某一部位，如幼虫的前胸背片上，溶剂迅速挥发，药剂在体壁形成药膜而侵入体内。此法是杀虫剂触杀毒力测定中使用最普遍的方法。除了螨类及小型昆虫外，可应用于大多数目标昆虫的触杀毒力测定，如二化螟、玉米螟、菜青虫、黏虫等。42 但是点滴法不能处理大批量的目标昆虫，测定结果准确性在很大程度上取决于试虫本身的生理状态。因此，试验时须选用生理状态一致的目标昆虫，否则会大大影响其准确性。其次是点滴部位、滴点大小以及目标昆虫处理前的麻醉方式等都有影响，操作技术难掌握。且需专门的点滴设备，如千分尺微品点滴器、电动（不动）微量点滴器、手动微量点滴器、毛细管微量点滴器(图)和微量进样器等。所以，点滴法测杀虫剂毒力时应注意选择适宜的溶剂配制药液，应虫而异确定点滴的药量及部位，控制环境条件及时饲喂，适时检查结果。43 在正式试验前，可设计一个预备试验，明确需设药剂的最佳浓度梯度，使每一个处理的试虫死亡率在10—90％之间，这需用大量试虫。而该浓度范围并非先知，因此在正式测定前必须进行预备试验，一般可将待出药剂设三个浓度，其梯度间差可适当加大，如按10、100及1000ppm配制药液，每一浓度处理试虫10—20头，不设重复，其他条件同正式测定。根据预备试验中药剂浓度与死亡率的相关现象再正式设计试验。44 测定实例点滴法测定毒死蜱对小菜蛾的毒力测定①试虫准备：用毛笔仔细地将3龄期小菜蛾幼虫从甘蓝叶上挑下，置于一片事先准备好的园叶片上（直径5cm）。②配制药剂：用丙酮将毒死蜱原药（新安化工，含量97.5％）稀释成2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625微克/微升等5种浓度，每浓度取3毫升装在小瓶中。③点滴对照组小菜蛾：用手动微量点滴器（上海昆虫研究所制）0.1微升，将针头对准小菜蛾背部，轻轻转动手柄，丙酮即在幼虫上展布。注意针头不能压在幼虫身上，否则极易伤害虫体。④从低浓度开始点滴毒死蜱丙酮溶液。每点滴完一个浓度，用下一个浓度的药液洗点滴器数次，再开始点滴。⑤处理完24小时后检查死亡率。用毛笔轻触幼虫，无假死现象，或虫体翻转视作死亡。45 2.1.2喷雾（喷粉）法喷雾（喷粉）是使杀虫剂直接附着于昆虫体表，通过表皮侵入昆虫体内致毒。为了试虫个体间所接受的药量一直，除了试虫本身的因素外，还跟所采用的喷雾装置有关，目前有很多相关的设备被使用。如Potter喷雾器，适合于鳞翅目幼虫、飞翔昆虫蝇等的毒力测定；E.J.Gerberg设计的气雾风道则尤其适用于蚊子、家蝇、蜚蠊等卫生害虫的毒力测定。其优点在于简单易行，实验操作较接近于田间的实际情况，是目前最为常用的触杀性杀虫剂毒力测定的方法。喷雾（喷粉）法的基本操作于点滴法相似。46 2.2药膜法（间接法）药膜法的基本原理是将一定量的杀虫药剂施于物体表面，形成一个均匀的药膜，然后放人一定数量的供试目标昆虫，让其爬行接触一定时间后，再移至正常的环境条件下，于规定时间内观察试虫的中毒死亡反应，计算击倒率或死亡率。药膜法的优点是比较接近实际防治情况，方法简单，操作方便，应用范围广，几乎一切爬行的昆虫都适用，而且结果比较准确，是目前常用的一种方法。但药膜法有一定的局限性，当昆虫的足部表皮是杀虫药剂穿透的主要部位时，采用药膜法测得的毒效就偏高，如家蝇用药膜法测得的毒效高干点滴法。对于某些目标昆虫，足部表皮不是杀虫剂穿透的主要部位或不能穿透的，采用此法测得的结果就偏低。其次是昆虫的活动、习性对试验结果的影响较大，药膜法测得的结果不能用准确的剂量表示，即不能表示单位昆虫体重接受的药量，只能用单位面积的药量来表示，而单位面积的药量并不等于药剂进人虫体的剂量，相对较难定量。47 2.2.1滤纸药膜法液体药剂采用此法较好。方法是将直径为9cm的滤纸悬空平放，用移液管吸取0.8ml的丙酮药液．从滤纸边缘逐渐向内滴加，使丙酮药液均匀分布在滤纸上。也可用喷雾法向滤纸喷雾。用2张经过药剂同样处理过的滤纸，放人培养皿底和皿盖各1张，使药膜相对。（图8）最好在培养皿内侧壁涂上拒避剂，避免昆虫进人无药的侧避。随即放入目标昆虫，任其爬行接触一定时间（30～60min）后，再将目标昆虫移出放入干净的器皿内，置于正常环境条件下，定时观察试虫的击倒率。48 2.2.2容器药膜法采用干燥的三角瓶或其他容器，放人一定量的丙酮药液（0.3～0.5ml），然后均匀地转动容器，使药液在容器中形成一层药膜，待药液干燥后（或丙酮挥发后），放人定量的目标昆虫，任其爬行接触一定时间（40～60min）后，再将试虫移至正常环境条件下，在规定时间内观察试虫击倒中毒反应。49 2.2.3蜡纸粉膜法将蜡纸裁成一定面积的纸片，把药粉撒在蜡纸的正面中央，两手执纸边使药粉在中间来回移动数次，均匀地分布在一定范围内，倒去多余的药，再轻轻弹动背面1～2次，即成蜡纸粉膜，然后称重，计算单位面积药量。放人一定数量的目标昆虫于粉膜上，用直径为9.0cm的培养皿盖扣在药膜上，待试虫爬行接触一定时间后，取出移至正常环境中，定时观察试虫击倒中毒反应。50 杀菌剂的生物测定方法51 根据杀菌剂生物测定方法的基本原理，可将其归纳为三大基本类型：离体法活体法组织筛选法52 1离体法离体法是利用药剂和病原菌直接接触，以测定药剂杀菌作用的方法。此测定体系不包括寄主植物。常见的离体测定方法有：孢子萌发法、生长速率法、琼脂扩散法、琼脂稀释法、对持培养法、菌丝干重法、定氮法等。53 离体法具有操作简单，条件比较容易控制，试验材料易于获得，测定所需的时间周期短等优点。在一定程度上反应了药剂的生物活性，但此法最大的缺点是可能使一些具有防病作用的化合物漏筛。例如，以抑制孢子萌发作为指标的杀菌剂生物活性测定，会使许多现代的杀菌剂被判断为没有活性，因为这些药剂对孢子萌发没有抑制作用。54 如三环唑，离体测定时对菌体没有活性，但是可能会抑制真菌侵入寄主所需的黑色素等物质的合成。另外，还有一些是调节、诱导植物抗病性的药剂，如果只用离体法测定它们的活性，这些药剂就有可能被漏筛。55 2活体法人们已逐渐认识到离体实验方法存在很多不足之处。于是采用“活体优先”的原则来进行生物测定。实际上，几乎所有的农用杀菌剂，都是在病原菌与寄主共存的情况下发挥药效。不言而喻，在以实验为目的进行试验时，最好是在病原菌与寄主共存的条件下进行实验。同时人们对生物测定进行了大量的研究，孢子、菌丝的获得和培养，接种方法，施药方法，病害分级标准等方面技术的进一步成熟，为活体生物测定创造了条件，促进了活体生物测定技术的发展。56 活体法测定是在杀菌剂、病原物和寄主共存的条件下进行的，其实验结果与田间效果具有很高的相关性，对生产实际有较大的参考价值。常用的方法有：种子杀菌剂药效测定、幼苗接种实验方法、叶片接种实验方法，果实防腐剂生物测定、定殖法等。57 现在研究开发农药，平均10万个化合物中才能筛选出1个有前途的化合物。如果将大量的化合物完全采用活体法进行筛选，事实上很难实现，因为活体测定需要的寄主多，占用空间大，测定周期长，实验条件难以控制，这样将会耗费更多的人力、物力和财力，当然更谈不上效率。为此，人们将实验方法简化，建立了“组织筛选法”。58 3组织筛选法组织筛选法是利用植物部分组织、器官或替代物作为实验材料评价化合物杀菌活性的方法，是一种介于活体和离体的方法。由于它既具有离体的快速、简便和微量等优点，又具有与活体植株效果相关性高的特点。因此，近年来备受重视，以植物叶片、根、茎等组织为实验材料，适于多种病害杀菌剂的生物测定。59 目前比较成熟的组织筛选法有：适用于水稻纹枯病、蔬菜菌核病的“蚕豆叶片法”适用于稻瘟病的“叶鞘内侧接种法”适用于玉米弯孢霉叶斑病的“玉米叶段法”用来观察药剂对真菌各生长阶段作用的“洋葱鳞片法”60 针对黄瓜灰霉病新药剂筛选的“子叶筛选法”适用于霜霉病的“叶片漂浮法”适用于稻白叶枯病的“喷菌法”针对细菌性白菜软腐病的“萝卜块根法”适用于柑橘树脂病的“离体叶片法”适用于抗病毒剂筛选的“局部病斑法”及“叶片漂浮法”61 不管是离体法、活体法还是组织筛选法都有各自的优缺点，要针对病菌的侵染特点加以选择，必要时还要结合使用，综合各种方法的优势。如日本三共农药研究所在采用活体法筛选出有效的化合物后，往往又采用离体的方法来寻找毒力更强的化合物，这是一种活体－离体－活体的筛选模式。62 实验杀菌剂的生物测定--生长速率法63 一、实验目的学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一--生长速率法二、实验原理生长速率法是杀菌剂毒力测定的常规方法之一，适用于不长孢子而菌丝生长较快的真菌，是通过菌落生长的速度快慢来衡量药剂的毒力大小生长速率法又叫含毒介质法，它是将供试药剂与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量化合物的毒力大小。一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌64 菌落生长速率的表示方法菌落达到一个给定的大小所需要的时间（天或小时）在单位时间内菌落直径的大小生长速率法常用的菌种棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporium）苹果腐烂病菌（Valsamali）小麦纹枯病菌（Rhzoctoniasolani）葡萄白腐病菌（Coniothyriumdiplodiella）小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminis）辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）65 三、试剂和仪器设备高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、接种针、纱布、吸管、消毒培养皿、打孔器、无菌小烧杯PDA培养基病原菌（苹果腐烂病菌）供试杀菌剂(多菌灵)66 四、实验步骤将培养基加热溶化，冷却至45-50℃，加入供试药液制成含药液的培养基，并分别倒入培养皿中冷却以无菌操作手续，用打孔器打取圆形菌块后用接种针挑至培养皿中央，然后将培养皿置于培养箱（27℃）中培养即可于处理后不同时间观察测定菌丝的生长情况67 68 五、实验数据及其处理纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径抑菌率（%）=[(对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量/对照纯生长量]×100%69 药剂浓度（mg/L）浓度对数菌落直径（mm）抑制（%）机率值ⅠⅡⅢⅣ平均50%多菌灵对苹果腐烂病菌的抑制作用(生长速率法)70 71 六、问题讨论根据实验结果比较各种供试药剂之间对病原菌菌丝生长的抑制作用72 除草剂生物测定方法73 除草剂的生物测定广义的包括了实验室、温室和大田三个试验层次,而狭义的仅主要指前两者,后者则为田间药效评价。74 除草剂生物测定应用的范围(1)除草活性的确定。新合成的化学除草剂要判定其是否对杂草有活性,就必须采用生物测定的方法。(2)杀草谱的确定。新的除草剂对哪些种类的杂草有明显的作用,必须通过生物测定来确定。75 (3)最佳用药浓度和用药时期的确定。除草剂对特定杂草的生长抑制是在适当的剂量下和特定的生长时期,如果用药量和用药时期不当,就起不到预期的效果,还会造成经济损失。因此对特定的杂草,最佳的用药浓度和时期非常重要。76 (4)对作物安全性的研究。包括两方面含义,一是对当茬作物的安全性,也就是除草剂的选择性。二是对后茬作物的安全性,即是否存在残留药害。(5)除草剂复配后联合效果的判别。除草剂复配后联合作用效果的判别一般采用生物测定的方法。(6)环境条件对除草剂活性的影响。这些环境条件包括温度、光照、土壤湿度等。77 (7)除草剂在水体、土壤中的残留活性和在土壤中的淋溶性。(8)抗药性和耐药性杂草的鉴定。除以上提到的应用范围外,只要和除草剂活性相关的研究都可以采用生物测定的方法。78 供试的生物除草剂生物测定的供试生物以植物为主,也可以是其他生物。植物中根据测定目的不同可以选择作物和杂草。具体选用哪种植物,应根据试验需要来确定。如测定除草剂对特定作物和杂草的生物活性,即以这些植物为材料。如果需要测定土壤或水体中除草剂的残留活性,则需要进行敏感植物的筛选,经过预备实验后才能确定选用哪种植物。79 供试植物的选择应遵循如下原则(1)供试植物的来源充分(2)供试植物个体一致(3)在一定的剂量范围内,供试植物对除草剂的反应随着剂量的增加而有规律的提高(4)在环境条件相同或相似的条件下,这种成比例的伤害关系是可以重现的。80 生物测定的材料与相应程序常规生物测定一般是利用生物活体作靶标,通过观察除草剂对靶标生物的生长发育、形态特征、生理生化等方面的反应来判断除草剂的生物活性。除草剂的作用方式很多,如抑制光合作用、呼吸作用、细胞分裂,干扰蛋白质、脂类、叶绿素等的生物合成以及生长的激素控制等,因此在进行除草剂生物测定时,应根据除草剂的不同作用方式选择不同的靶标生物和相应的测定方法。81 测定方法整株水平测定组织或器官水平测定细胞或细胞器水平测定酶水平测定82 整株水平测定一般是在温室用盆钵、培养皿或小杯如玻璃杯或一次性塑料杯培养供试的指示植物,根据不同要求用供试除草剂处理,待药害症状明显后进行观察评价。评价的指标包括出苗率、株高、地上部重量和地下部重量等,还可对植物受害症状进行分级,再计算综合药害指数。植株个体大的供试材料用大盆钵培养,采用测定株高或重量的方法以及分级方法进行评价都可以取得好的结果。83 组织或器官水平测定小杯法可以采用惰性材料沙子、蛭石或玻璃珠,也可以是土壤。测定的指标可以是主根长或地上部鲜重或株高,具体采用哪种指标应根据预备实验结果确定,实验数据经分析后选择稳定性和相关性较好,以及容易测定的指标。应用较多的是主根长生测法。例如利用玉米或油菜主根长法测定磺酰脲类除草剂的残留活性。在利用种子作为生测材料时,供试的种子一定要有较高的发芽率和发芽势,否则会影响测定结果,造成实验结果不可靠。84 细胞或细胞器水平测定一般是针对特定作用机制的除草剂,常用的细胞器有叶绿体和线粒体。根据叶绿体和线粒体中一些特定的生理生化反应测定生理指标。在离体线粒体条件下,用瓦氏呼吸装置测定氧的吸收和磷氧比,从而确定呼吸作用抑制剂活性。85 酶水平测定因为草甘膦作用于芳香族氨基酸合成过程中的一种重要酶—EPSP合成酶,导致莽草酸积累,因此测定植物体内莽草酸的累积量可以得知草甘膦活性的大小。磺酰脲类除草剂抑制乙酰乳酸合成酶活性,因此可以用乙酰乳酸合成酶活性的变化测定植物对磺酰脲类除草剂的敏感程度。86 农药田间药效试验87 农药田间药效试验是在田间进行的农药对有害生物施药效果的试验，这是确定新的农药品种能否在农业生产上大面积推广应用很重要的方法。田间药效试验可分为小区、大区与大面积示范等几种。88 这是在自然条件下研究比较几种不同的农药，采用几种不同的即时条件和要求，从中鉴定出最有效、最有经济效果的农药品种，同时确定其大田使用范围、防治对象、最低有效使用剂量、浓度及其他技术条件等。一般农药经室内实验证明有效，需先进行小区试验，获得较好试验结果的项目，再进行大区试验。在正式推广之前，常常还要进行大面积示范，以便取得广泛经验。89 进行农药田间药效试验之前，必须制定试验计划和方案，明确试验的目的、要求、方法以及各项技术措施的规格要求，以便试验的各项工作按计划进行，也便于在进行过程中检查执行情况，保证试验任务的完成。90 田间试验设计的主要目的是减少试验误差，提高试验的精确度，使试验人员能从试验结果中获得无偏差的处理平均值及试验误差的估计值，从而能进行正确而有效的比较。在药效试验中要减少试验误差，就必须对试验误差来源，通过试验设计加以克服。91 在试验过程中如何减少试验误差应注意以下几个方面：1.试验地的选择选择有代表性的试验地是使土壤差异减少至最少限度的一个重要措施，对提高试验准确度有很大作用。选择试验地要考虑到：a、试验地的地势应平坦，肥力水平均匀一致。b、试验地的作物生长整齐、树势一致，而且防治对象常年发生较重且为害程度比较均匀，且每小区的害虫虫口密度和病害的发病情况大致相同。特别是杀菌剂试验，要选择高度感染供试对象病害的品种进行试验。92 c、试验地的田间管理水平相对一致，并符合当地的实际情况。d、试验地应选择离房屋、道路、水塘稍远的开阔农田，以保证人、畜安全和免受外来因素的偶然影响。e、试验地周围最好种植相同的作物，以免试验地孤立而易遭受其它因素为害。93 2.试验药剂处理供试农药和对照农药的剂型和含量要合乎规格，无变质、失效现象，并有详细的标签和说明书，标明生产厂家、出厂日期等。评价一种农药产品不同剂量的药效试验，至少要有供试产品的3个浓度梯度、1个常规标准农药的常用浓度和1个空白对照等5个处理。如供试的农药产品是混配制剂，而且各个单剂已登记过，除设混剂本身3个浓度梯度和1个空白对照外，还应设混剂中各个单剂的常规处理浓度，共6个处理。94 3.设置重复次数试验设置重复次数越多，试验误差越少。但在实际应用中，并不是重复次数越多就越好。因为多于一定的重复次数，误差的减少很慢，而人力、物力的花费也大大增加，是不值得的。重复次数的多少，一般应根据试验所要求的精确度、试验地土壤差异的大小、供试作物的数量、试验地面积、小区的大小等具体决定。对试验精确度要求高、试验地土壤差异大、小区面积小的试验，重复次数可多些，否则可少些。通常情况下，要求把试验误差的自由度控制在10以上，即（处理数-1）*（重复数-1）>10。一般每个处理的重复次数以3-5次为宜。大区试验和大面积示范可不设重复。95 4.采用随机区组排列为使各种偶然因素作用于每小区机会均等，那么在每重复内设置的各种处理只有用“随机排列”才能符合这种要求，反映实际误差。例如某种药剂药效好坏究竟是由于其所在小区病、虫密度不均匀，还是药剂本身的原因，就不容易判别了。为了解决这一问题，可将试验地按重复次数划分为数量相同的区组（即重复），再将每一区组按处理数目划分小区（包含药剂处理和对照区），然后将每种药剂在区组中随机排列，即每种药剂在区组中仅出现一次。用随机区组和重复组合，试验就能提供无偏的试验误差估计值。96 5.小区面积与形状小区面积的大小和形状对于减少土壤差异的影响和提高试验的精确度是相当重要的。小区面积的大小，应根据土壤条件、作物种类、病虫草害的生物学特性和试验目的而定。一般要求：a、差异较大的田块，小区面积宜大一些。b、凡植株高大、株行距较大的作物，单位面积上株数较少的作物，种植密度小的作物小区面积可大些，反之可小些。c、活动性强的害虫，小区面积宜大些；活动性较差的如蚜虫等，小区面积可小些。d、测产的试验，小区面积宜大些，否则可小些。e、田间药效试验的小区面积一般为15-50m2，果树每小区不少于3株。产量试验至少为25m2。97 小区的形状一般以长方形尤其是狭长形为好，采用狭长小区能较全面地包括不同肥力的土壤，相应减少小区间的土壤差异，提高精确度，其试验误差比方形小区小。小区的长宽比可依试验地形状与面积、土壤肥力梯度、栽培方式、株行距的大小、小区的多少和大小等决定。如已知试验地的肥力梯度时，小区的方向须使长的一边与肥力变化最大的方向平行，以提高精确度。一般长宽比可在3-10范围内。但小区的宽度应考虑到喷雾器喷施的幅度范围。98 6.施药时间施药适期掌握不好会使试验前功尽弃，施药时间的不同也会影响试验的准确度。试验田的施药时间应根据不同的防治对象、种群密度消长情况和为害特性及作物和杂草的生育期、药剂的性能等来准确掌握。如杀虫剂试验中，对一些食叶性害虫可以在害虫种群密度较明显上升，尚未造成较大危害之前开始喷药。对钻蛀性害虫或为害隐蔽的害虫，应在害虫种群密度开始上升和为害形成之前喷药，也可用卵量消长作为指示，密度大时可以从卵盛期开始，卵密度低时可在卵峰期或幼虫初孵期施药。病害防治一般以预防为主，应考虑作物的发病程度、作物的感病期、常年的发生时间及气候条件（主要为雨量和湿度）等来确定施药适期，一般掌握发病初期施药为宜。杂草的防除适期主要决定于施药的方法和杂草的生育期和药剂的性能。99 7.施药方法施药方法不当，施药不均也会影响试验的准确度。农药的使用效果好坏不仅取决于药剂的分散度，也取决于适当的施药方法。农药的田间使用方法以喷雾法、喷法粉、颗粒撒施法等应用最广泛。此外，还有土壤处理、拌种、浸种、浇灌、包扎、涂抹、注射、点滴、熏蒸、烟雾，以及近年来发展的结合地膜覆盖的除草剂使用方法。100 按照目前农药使用时的药剂形态及主要使用对象，其相应的使用方法参见下表：使用对象液态药剂固态药剂气态药剂气溶胶植物叶喷雾喷粉熏蒸（帐幕法）烟雾法茎杆涂抹、包扎、注射涂抹（悬液）熏蒸（帐幕法）烟雾法根浇灌土壤处理土壤熏蒸—种子浸种拌种熏蒸—土壤浇灌土壤处理土壤熏蒸—储藏场所喷雾消毒粮食拌药、撒粉仓库熏蒸烟雾法101 8.施药设备施药设备是否完好无损，也关系到试验结果的准确度。在试验前要认真检查施药机械是否完好无损、性能良好、不漏水、无堵塞等现象；试验前要认真清洗施药机械；喷雾器的喷头和喷片孔径是否适合，喷头的型号、孔径的大小要记载；配制药液和称量用的吸管、量杯、天平等要用标准品，称量要准确，使用前要作适当测定。102 9.调查方法药效试验的调查是农药试验中的一个重要环节。其取样方法和取样多少是影响试验结果的重要因子。限于人力和时间，不可能将试验区的供试对象进行逐一调查，也很难全部调查。因此，只能通过抽取有代表性的样点对总体进行评估。由于各种病、虫、草、鼠和生物学特性不同、被害作物在田间的分布也不同，在取样调查时，必须明确调查的对象、项目和内容，根据调查对象在田间的分布型，采用适当的取样方法和足够的样本数，使调查得到的数据更能反映出客观真实的情况。在田间调查观察病虫草对作物的为害情况，取样通常有以下5种方法：五点取样法、对角线取样法、棋盘式取样法、平行线取样法、“Z”字型取样法。在进行田间药效试验时，田间调查采用哪种取样方法，应根据该种病虫及其被害作物在田间的空间分布型来确定。103 在田间药效试验调查中还应注意三点是：一、同一试验要专人调查记载，以减少人为误差。二、在试验地防治其它病虫草害时，各小区使用的农药产品及剂型要一致，且应为同一厂家生产的产品，同时使用剂量、兑水量要相同，并采用相同喷洒工具均匀喷施。三、由于试验地有限，这次试验结束后，最好不要在这块试验地进行下一个试验，因为上次试验时，处理区与空白对照区受害不一致，造成作物的生长也不一致，进行下一个试验常常会出现低剂量防效高于高剂量防效的现象，这样就难以反映药剂的真实效果。104 ThankYou!105