参丹smpap1基因的生物信息学分析大学论文.doc

摘要丹参（SalviamiltiorrhizaBunge），为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎皆可入药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。近年来随着丹参需求的日益扩大，野生资源的逐渐减少，人工种植品种退化及病虫灾害等一系列问题的产生，导致丹参产量和质量的逐年降低。因此，有效提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参现代化开发利用的必由之路。丹参中主要次生代谢产物分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物；另一类为脂溶性的丹参酮类物质。基于传统中药多以水煎服的用药方式，水溶性的酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的活性物质。研究报道丹参中主要的酚酸类活性成分生物主要源于酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径，多为咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些MYB和BHLH类转录因子的调控。鉴于此，本论文在已有研究的基础上，选取丹参------基因为研究对象，克隆其启动子序列并进行序列的生物信息学分析，探究其潜在的表达调控模式，为更好地研究丹参------基因的功能及在丹参酚酸类合成中的作用奠定基础。1.利用PCR的方法从丹参gDNA水平克隆得到了--------基因的启动子序列，该序列全长---------bp。2.利用启动子在线分析软件进行启动子顺式作用元件分析。分析结果显示，该基因启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如-----、-----、-----等，以及与激素响应相关的顺式作用元件------、-------等。关键词：丹参，-----基因,启动子，顺式作用元件。57 Abstract57 第1章引言第1章引言1.1丹参的研究概况丹参（SalviamiltiorrhizaBunge），又名赤参、逐乌、郁蝉草、奔马草等，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，产河北，山西，陕西，山东，河南，浙江，江苏，安徽，江西及湖南等地，生于海拔120～1300米的山坡、林下草丛或溪谷旁[1]。根和根茎可入药，味苦，微寒。归心，肝经。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功效。在临床上广泛用于用于月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等症的治疗[2]。丹参具有种植条件简单、繁殖周期短、即能杂交授粉又能自交授粉[3]、次生代谢产物丰富，主要化学成分明晰[4,5,6]，基因组相对小[7]、基因操作技术成熟简便[8-10]等优点。是研究药用植物次生代谢产物生物合成及调控的理想材料。因此具有“药用模式植物”之称[11-13]。丹参为我国十大大宗药材之首，年需求量超万吨，仅原药材生产销售额达数亿元人民币，现已上市的中成药和复方制剂达百余种，总产值超过100亿元[11]。1.1.1丹参主要化学成分及其药理作用对丹参活性成分的研究始于二十世纪三十年代。依据已分离化合物的特特够特征和理化性质，将其分为两类：脂溶性丹参酮类化合物与水溶性酚酸类化合物[4,5,6]。（见图1-1）。自1934开始，现已分离鉴定的丹参脂溶性化合物达40余种，主要包括丹参酮I、IIA、IIB、V、VI，异丹参酮I、II、IIB，隐丹参酮，异隐丹参酮，丹参新醌A、B、C、D，二氢异丹参酮、丹参酮二酚、丹参环庚三烯酚酮等[14]。其中，丹参酮ⅡA是丹参治疗冠心病的主要成分之一，具有扩张冠状动脉、、抗血小板凝集、清除氧自由基、改善记忆力障碍等作用，被2010年版《中华人民共和国药典》规定为丹参药材质量控制的指标成分之一；隐丹参酮具有强抗菌性，而且对治疗心肌缺血也有一定的疗效并对治疗心肌缺血也有一定的疗效，是丹参抗菌消炎类制剂的质量控制指标[2,15-17]。对丹参水溶性成分的相关研究始于20世纪70年代，至今已分离鉴定了咖啡酸、迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，丹酚酸A、B、C、D、E、F、G，57 第1章引言原儿茶醛，原儿茶酸，紫草酸，丹参素，异阿魏酸，紫草酸单甲酯，紫草酸二甲酯，紫草酸乙酯等20多种水溶性的酚酸类物质[4,18-19]（图1-1）。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用[20]。丹酚酸B是目前发现的抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高的酚酸类化合物，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用，被2010年版《中华人民共和国药典》规定为丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一；迷迭香酸具有抗炎镇痛作用；丹参素和原儿茶醛是治疗冠心病的有效成分[2,20-23]。鉴于传统yij中药以水煎服的用药方式，丹参水溶性化合物受到人们越来越多的关注。除以上所述化合物，丹参中还含有微量的鼠尾草酚、弥罗松酚、黄芩苷、熊果酸、柳杉酚、琥珀酸和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷等化学成分。图1-1丹参酚酸类化合物的结构Figure1-1StructuresofthephenolicacidsofS.miltiorrhiza1.1.2丹参资源利用的现状随着对丹参有效成分及药理作用的深入研究，近年来以丹参为主要原材料的产品不断被推出，丹参的需求量越来越多。伴随着丹参需求量的日益增加，对丹参野生资源的采挖力度加大，同时人工种植面积也在不断增加。但是，丹参作为异交植物，其种内变异非常大，性状也很复杂。因此只注重扩大栽培面积而忽略其优良品种选育导致了丹参品种严重退化，质量不均一，有效成分含量降低等诸多问题，从而影响了丹参作为高品质药用植物大规模进军国际市场[24-25]。另外，人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发等问题也严重影响了药材的产量和质量[26,27]。因此57 第1章引言为了提高丹参品质，更好的满足其市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良来筛选优异丹参资源细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良，筛选优异丹参资源，提高丹参药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。1.2丹参酚酸类物质的合成1.2.1丹参酚酸类成分生物合成途径的研究概况迷迭香酸在多种唇形科植物中均有发现，迷迭香酸生物合成相关酶基因已经研究的较为清楚。咖啡酸和丹参素等几种单苯环物质可由氨基酸直接氧化脱氨生成，而其余均可视为咖啡酸与丹参素酯化缩合反应得到产物。丹参素源于酪氨酸代谢途径，咖啡酸来自苯丙烷类代谢途径，迷迭香酸是由酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径共同参合成的。酪氨酸代谢途径中的羟基苯丙酮酸还原酶（HPPR）与酪氨酸氨基转移酶（TAT）参与了丹参素的合成；迷迭香酸合酶（RAS）、苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）以及酪氨酸代谢途径中的TAT和HPPR共同参与了迷迭香酸及丹酚酸B的生物合成过程[28-29]。丹参酚酸类化合物的生物合成途径分为三部分。第一部分：莽草酸途径，由葡萄糖经过多步酶促反应生成莽草酸，进而形成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，它们是连接初生代谢和次生代谢的关键。第二部分：酪氨酸代谢和苯丙烷主干代谢两条互相平行的途径，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL）催化作用下生成肉桂酸，肉桂酸在细胞色素P450单加氧酶CYP73亚家族的肉桂酸-4-羟化酶(C4H）和4-香豆素辅酶A连接酶(4CL)的催化下生成4-香豆酰CoA，是植物酚酸、黄酮类和木质素类物质合成的通用途径；酪氨酸经由酪氨酸氨基转移酶（TAT）和羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）的催化合成丹参素。第三部分：丹参酚酸类物质的特异合成途径，以4-香豆酰辅酶A和4-羟苯基乳酸为前体通过迷迭香酸合酶（RAS）催化苯丙烷类代谢途径来源的4-香豆酸CoA和酪氨酸途径来源的4-羟苯基乳酸缩合、羟化形成迷迭香酸，迷迭香酸再经多步缩合、还原反应合成丹酚酸B[28-29]。1.2.2丹参酚酸类物质的调控研究目前对于丹参酚酸类活性成分生物合成的骨架途径已研究的较为清楚。丹参酚酸类活性成分生物合成主体途径上的多数酶基因已被克隆，这些酶57 第1章引言基因的表达及调控与酚酸类化合物的累积密切相关。丹参中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）、酪氨酸氨基转移酶（TAT）、羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）以及迷迭香酸合酶（RAS）共同参与了酚酸类化合物主要成分-丹酚酸B的生物合成过程[30]。图1-2植物酚酸类物质的合成途径Figure1-2syntheticrouteofplantpheonlicsubstanve.1.3各自基因的介绍1.3.1-------基因概述重点阐述！1.3.2-------基因启动子的研究进展重点阐述！1.3.2-------基因的表达调控57 第1章引言重点阐述！1.4本研究的目的意义缩略词表英文缩写英文名称中文名称---57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析第2章丹参-----基因启动子序列的克隆2.1实验材料、试剂及主要实验仪器2.1.1实验所用植物材料丹参（SalviamiltiorrhizaBunge）种子从购自陕西道地药材有限公司，种于蛭石与营养土(体积比约为3：1)混合的培养土的盛有蛭石的培养盆中于人工气候箱中培养，每隔两天浇一次水。当幼苗长出第二对真叶时栽至含蛭石的营养钵中，每个营养钵种3棵幼苗。人工气候箱培养条件：光周期16/8h（day/night），光照强度2000lx216µmol·m2·s-1，温度25±2℃，湿度60~80%。本章实验材料为人工气候箱中培养30d后的丹参实生苗。将丹参种子种在蛭石与营养土(体积比约为3：1)混合的培养土中，幼苗在第二对真叶长出时移至营养钵中培养，培养条件：温度25±2°C，湿度60~80%，光周期16/8h（day/night），光照强度2000lx。2.1.2实验试剂LAEXTaq®Polymerase、dNTPmix,T4DNALigase,PrimeScript®RTreagentKitEmeraldAmp®PCRMasterMix,DL2000DNAMarker,pMD®19-TSimpleVector（购自TaKaRa公司）；BDGenomeWalker™UniversalKit（购自Clontech公司）；DNA胶回收试剂盒（AXYGEN公司）；氨苄青霉素钠（Ampicillinsodium，Amp）Amresco公司引物序列合成，克隆片段测序均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。附：实验所用缓冲液和培养基配方，及本章实验中所用到但未列出的各种试剂配制方法参考《分子克隆实验指南》[104]。（1）实验所用抗生素及植物激素的配制：Amp储备液（100mg/mL）：无菌水溶解10.0g氨苄青霉素钠，定容至100mL，0.22μm无菌滤头过滤除菌，1mL分装置于-20℃贮存。以100μg/mL的使用终浓度添加于LB培养基；57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析（2）CTAB提取液(1L)CTAB10.0g；PVP25.0g；NaCl40.908g；EDTA3.7224g；Tris:6.057g；调PH8.0。（3）TAE缓冲液（50×）（使用的时侯稀释至1×）：Tris242.0g；EDTA18.612g；冰乙酸57.1mL；加H2O定容至1000mL，室温保存。（4）LB(Luria-Bertani)培养基（1L）：NaCl10.0g；Tryptone10.0g；Yeastextract5.0g，调pH7.0；固体LB培养基再附加15.0g琼脂粉。2.1.3实验仪器恒温培养箱上海智新苗实验设备有限公司紫外-可见分光光度计UNICAMUV-300HH-6B数显恒温水浴锅国华电器有限公司摇床上海智诚实验设备有限公司电泳仪北京六一仪器厂DY-8型超净工作台AIRTECH苏州净化设备有限公司玻璃仪器气流烘干机郑州长城科工贸有限公司涡旋器姜堰市康健医疗器具有限公司XH-BPCR仪美国BIO-RAD公司NanoDrop2000核酸仪美国ThermoScientific公司凝胶成像系统美国MediaCybernetics公司UVPGDS-8000型超纯水仪美国Millipore公司超低温-80℃冰箱美国ThermoFisherScientific公司冷冻台式离心机德国Eppendorf公司Centrifuge5802REppendorf微量移液器德国Eppendorf公司电子天平德国Sartorius公司57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析4℃/-20℃冰箱德国SIEMENS公司高压灭菌锅日本SANY公司MLS-3750型2.2实验方法2.2.1丹参基因组DNA的提取丹参基因组DNA的提取采用CTAB法。（1）将CTAB在水浴锅中预热至65℃，研钵、研磨棒在液氮中预冷。（2）取新鲜的丹参叶片于研钵中，加入液氮迅速研磨使其成粉末。（3）称取0.2～0.3g研磨样于EP管中，每管中分别加入CTAB600μL,和Lβ-巯基乙醇12μ，颠倒混匀数次。（4）65℃水浴约60min，这一过程中每10min颠倒混匀一次；（5）每管加入4μL的RNA酶，37℃水浴约30min；（6）5,500rpm离心15min，取上清；（7）加入氯仿/异戊醇（24:1）480μL，20μL抽提一次。；（8）12,000rpm离心5min，取上清；（9）重复步骤7、8两次；（10）加样品二倍体积的无水乙醇，1/10提及的NaOAC；（11）-20℃放置1h以上，用枪头将DNA挑至EP管中。；（12）加750μL的无水乙醇和250μLElutionBuffer，12,000rpm离心5min，洗脱两次，去上清，干燥；（13）加0.1～0.5mLElutionBuffer，65℃水浴，使DNA完全溶解。------基因启动子片段的PCR扩增在NCBI查到注册号为GU218694.1的-----基因，根据其序列特征，利用PrimierPrimier5软件设计一对引物，ORF采用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性的引物，引物序列见表2-1分别以丹参cDNA和gDNA为模板，分别扩增SmPAP1基因的ORF和DNA全长，扩增体系（50μL）如下：TemplateDNA1μLPrimerF(10μM)0.5μLPrimerR(10μM)0.5μL2×TaqMasterMix10μL57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析ddH2Oaddto20μL扩增条件：94℃，10min；（94℃，30s；57℃，1min；72℃，50s）33Cycles72℃，10minPCR扩增产物经胶回收分别与pMD®19-TSimpleVector连接转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α，经菌落PCR检测的阳性克隆送至上海桑尼生物有限公司测序。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化方法（热激转化法）参照《分子克隆实验指南》[104]PCR产物纯化及克隆的方法与步骤：（1）PCR产物凝胶回收及纯化采用DNAGelExtractionKitⅡ(U-gene,Hefei)进行：①用手术刀片在紫外灯下切含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶块，用滤纸吸干凝胶表面残余液体，切碎。②加入400μL的BufferDE-A，混合均匀后于75℃水浴加热约7min，至凝胶块完全熔化，其间每3min左右轻轻震荡混匀反应管。③加200μLBufferDE-A并混合。（分离的DNA片段长度<1000bp时，另外加入100μL异丙醇。）混合物颜色变为黄色后，充分混匀保证形成均一颜色。④吸取上述混合液，移至DNA制备管（置于2mL，嵌套在试剂盒附带的2mL离心管中，离心（12,000×g1min）。弃滤液。⑤将制备管放回2mL离心管中，加500μLBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液。⑥将制备管置回2mL离心管，加入700μLBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。⑦重复步骤6一次。⑧将制备管置回2mL离心管中，12,000×g离心2min。⑨将制备管放于试剂盒所带的1.5mLEP管中，在膜中央加28μL提前已加热至65℃的Eluent。室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱。⑩重复步骤9一次，其中的室温静置时间延长到3min。（2）连接体系（10μL）：胶回收片段5μLpMD®19-TSimpleVector*10.5μLSolution14.5μL连接条件：4℃过夜。57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析（3）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化①感受态细胞的制备（CaCl2法）[104]加5mLLB液体培养基于无菌的50mL离心管中，用灭过菌的牙签从平板上挑取生长良好的DH5α单菌落接种于该离心管中，37℃恒温180rpm培养过夜。次日取2mL过夜培养物接种到含100mLLB液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温180rpm快速培养至OD600为0.3～0.4。无菌条件下将菌液转移至两只经高压灭菌的50mL离心管中，立即冰浴30min。4℃，5,000rpm离心8min收集细胞；弃上清，将管倒置使残留培养液流尽；加10mL预冷的0.1MCaCl2溶液温和重悬菌体，冰浴20min；4℃，5,000rpm离心7min，弃上清，沉淀用5mL甘油（75%甘油用0.1MCaCl2稀释至浓度为15%）悬浮，100µl分装。液氮速冻，-80℃保存。②转化（热激法）冻存于-80℃的感受态细胞置冰上溶化，将连接产物加入溶化后的感受态细胞中，冰浴40min，42℃热激85s，不要摇动试管，立即冰浴静置2min。加入400µlLB液体培养基，37℃100rpm恢复培养1h后，将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素（100mgl-1）的LB固体培养基上。于37℃的恒温培养箱中倒置培养10～14h。（4）菌落PCR检测挑取单克隆至10mLLB液体培养基（含100mg/L氨苄青霉素），37℃150rpm下振荡培养过夜。待菌液浑浊后进行菌落PCR检测。20μl）反应体系如下：菌液2μLPrimerF(10μM)0.5μLPrimerR(10μM)0.5μL2×TaqMasterMix10μLddH2Oaddto20μL扩增条件为94℃，10min；（94℃，30s；57℃，1min；72℃，50s）33Cycles72℃，10min（5）菌株的保存：将活化好的菌液于10,000rpm离心3min，收集菌体，保存于终浓度为15％的甘油中，-20℃存放。-57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切去其中>1000bp的片段进行胶回收，纯化产物克隆连接到pMD®19-TSimpleVector，送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。------基因启动子的5’侧翼序列的序列分析分析PCR产物序列的结果，我们得到了一条长-----bp的5’侧翼序列，其A+T含量符合启动子区高A+T含量的特征。利用PlantCAREdatabase分析表明，在------基因转录起始位点的上游总共有38个可能的TATAbox。我们认为，------基因最可能的TATAbox位于-65~-57bases处，其序列为：TCTATATATA。在SmPAP1基因转录起始位点上游共找到11个可能的CAATbox序列，这些序列被认为对转录效率具有非常重要的作用。分析结果显示，在-----基格式因的启动子区，分布着多种类型的顺式作用元件，分别是与生物源或非生物源胁迫相关的顺式作用元件(表3-1)表3-1预测的启动子区順式作用元件Tabel3-1Cis-actingelementanalysisofpromotesequences位点名称Factorofsitename信号序列Signalsequnce位置Location位点功能FuctionofsiteCIACADIANLELHCCAANNNNATC-1172光响应元件，生理节律相关元件GT1CONSENSUSGRWAAW-708，-679，-637，-549，-548，-344-343，-219光响应元件，SA诱导相关元件HDZIP2ATATHB2TAATMATTA-1023,-677光响应元件IBOXCOREGATAA-679,-219光诱导响应元件INRNTPSADBYTCANTYY-1113光响应元件SORLIP1ATGCCAC-286光响应元件Box4ATTAAT-1118,-264,-1026,-209,-1029,-913光响应元件Box1TTTCAAA-573,-527光响应元件G-BOXCACGTA-1131,-1037光响应元件G-boxTACGTG-158,-231,-157,-230光响应元件WBOXNTERF3TGACY-667,-400创伤诱导响应元件MBSCAACTG-581MYB结合位点，干旱响应元件ABRELATERD1ACGTG-229,-156ABA、干旱响应元件ACGTATERD1ACGT-1130,-1036,-719,-229,-156脱水相关元件MYB1ATWAACCA-660ABA、脱水诱导元件MYB2CONSENSUSATYAACKG-581,-372脱水相关元件MYCCONSENSUSATCANNTG-1075,-581,-554,-538,-524-502,-472,-439干旱、ABA诱导响应元件DPBFCOREDCDC3ACACNNG-1076ABA诱导元件MYB2CONSENSUSATYAACKG-581,-372ABA诱导元件RYREPEATBNNAPACATGCA-1105ABA诱导元件ABRETACGTG-230,-157ABA诱导元件GAREATTAACAAR-364,-334GA诱导响应元件MYBGAHVTAACAAA-364GA响应元件TATCCACHVAL21TATCCAC-1002GA响应元件WRKY71OSTGAC-667,-565,-541,-678,-498,-400,-380MYB结合位点，GA、病程相关响应元件ATGCAAATmotifATACAAAT-505,-615順式调控元件Box-W1TTGACC-668真菌诱导响应元件CAAT-boxCAAT-685,-641,-629,-612,-524,-502,-439,RNA聚合酶Ⅱ转录的上游元件57 第3章丹参SmPAP1基因的生物信息学分析-377,-361,-271,-43CCAAT-boxCAACGG-372MYB结合位点Skn-1_motifGTCAT-474胚乳特异性响应位点TA-richregionTATATATATATATATATATATA-320转录增强元件TATABOX-57转录起始核心元件TC-richrepeatsATTTTCTTCA-1049,-192防御与胁迫相关元件TGA-elementAACGAC-238生长激素响应CircadianCAANNNNATC-1172生理调控响应元件57 第2章丹参SmPAP1基因的克隆2.3.实验结果分析1）：基因组DNA的提取质量检测2）-----基因启动子序列的扩增3）-----基因启动子序列的生物信息学分析图片模版！57 第2章丹参SmPAP1基因的克隆图2-1丹参SmPAP1基因PCR电泳图M：DL2,000Marker；B：空白对照;1：以DNA为模板扩增；;2:以cDNA为模板扩增；Fig.2-1ThePCRamplificationofSmPAP1genefromS.miltiorrhiza.M,DL2,000Marker;B,notemplatecontrol;1,PCRamplificationfromgDNA2,PCRamplificationfromcDNA57 第6章结果与讨论讨论着重写！57 攻读硕士学位期间的研究成果参考文献57