化学生物学专业实验讲义

化学生物学专业实验讲义课程内容与学时：一、药用植物学实验24学时二、化生专业综合实验(1)34学时三、化生专业综合实验(2)84学时四、化生专业综合实验(3)30学时 中南民族大学药学院化学生物学与药学实验教学中心《药用植物学》实验讲义向梅先舒广文刘新桥编写适用专业：药学专业药物制剂化学生物学专业2012年3月101 目录实验室守则……………………………………………………………3实验一显微镜的构造使用与植物细胞的基本结构…………………4实验二植物组织的观察………………………………………………6实验三植物根外形、初生及次生结构的观察………………………10实验四植物根茎的外形、初生及次生结构的观察…………………14实验五叶的外形、内部构造及繁殖器官观察………………………17实验六植物标本的采集制作及植物检索表的编制与使用…………25101 实验室守则1．实验课是培养学生独立思考和理论联系实际、灵活应用能力的重要手段，也是进行科研工作的基础，必须严肃认真。2．准时上实验课，不得无故缺席，不得迟到早退，按指定座位就坐，使用相应的显微镜。3.实验前必须通过预习，明确实验的目的要求、内容、方法和步骤。实验时要认真观察，独立思考，做好记录，实验完毕后要按时交实验报告。4.老师讲解实验时，要专心听讲，并作必要的记录。实验中如有疑问请举手，不准大声喧哗。5．爱护实验室一切仪器设备，按操作规程使用显微镜，尽量节约水、电及擦镜纸、试剂等一切消耗物质．损坏仪器须登记，按规定赔偿。6．每次实验必须带教科书，绘图用具(HB、2H铅笔各一支，橡皮、尺子等)和实验记录本。7．保持实验室清洁整齐，一切实验用具用完后要擦洗干净，放回原处。每次实验完毕，要搞好室内清洁卫生．离开实验室时要关好水、电、门、窗。101 实验一显微镜的构造与使用植物细胞的基本结构及后含物的观察实验学时：4学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的要求1.熟悉光学显微镜的构造、使用2.掌握植物细胞的基本结构3.识别植物细胞的各种后含物4.掌握水合氯醛制片法、表面片制法5.掌握草酸钙晶体的类型和形态6.学习绘制植物显微图二、仪器用品及实验材料1.仪器用品显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、擦镜纸、稀碘液、酒精灯、培养皿、解剖针、水合氯醛液，蒸馏水等2.实验材料新鲜洋葱鳞茎、马铃薯、浙贝、半夏、黄柏、大黄、甘草、地骨皮、射干粉末；红萝卜，辣椒，叶片等。三、实验内容与步骤1.植物细胞的基本构造(1)洋葱表皮细胞制片（观察细胞结构）用镊子撕取2小片（3mm×3mm）洋葱内表皮，置载玻片上，蒸馏水装片。其中一片在盖玻片一侧加1滴1％的I-KI溶液，用吸水纸在另一侧吸去多余溶液。然后在显微镜下观察洋葱表皮的细胞壁、细胞核、液泡。(2)有色体的观察用刀片从红辣椒果肉上刮取少许，均匀涂在载玻片中央，加蒸馏水1滴，再加盖玻片观察。细胞内橙色颗粒即为有色体。2.植物细胞构造的观察101 将洋葱表皮临时装片放在低倍镜下观察，可看到许多无色透明的稍长形的细胞，彼此紧密相连，没有细胞间隙。在细胞中，可见到浸埋在细胞质中的圆形的细胞核，如不清晰，可由盖玻片一侧加稀碘液一滴，用吸水纸在另一侧稍吸，使碘液布满整个标本而染色，几分钟后观察，可见细胞质被染成浅黄色，细胞核被染成较深的黄色，细胞各部分显得较为清晰。移动装片，选择几个较清楚的细胞置于视野中央，换用高倍镜再仔细观察。注意识别下列各部分：(1)细胞壁：植物细胞所特有，为细胞的最外层。(2)细胞质：为无色透明的胶状物，紧贴在细胞壁以内，被中央大液泡挤成一薄层，仅细胞两端较明显。(3)细胞核：贴近细胞侧壁，呈类球形。(4)液泡：位于细胞中央，占细胞体积的大部分，由于液泡内充满细胞液，所以比细胞质更透明。3.植物细胞的后含物淀粉粒（1）切取一小块马铃薯块茎，用刀片刮取少许细胞，置载玻片上，加水一滴，搅匀，盖上盖玻片。先在低倍镜下观察淀粉粒，注意其形状。转换高倍镜继续观察，仔细、准确地分辨单粒，注意识别淀粉粒中的脐点和层纹，绘图记录。然后取下制片，加一滴稀碘液，观察有何变化，记录观察结果。（2）取少量半夏粉末置于滴加1～2滴蒸馏水的载玻片上，置酒精灯上加热透化后，置于镜下观察其复粒淀粉，半复粒淀粉。（3）按上述方法制成浙贝母粉末装片置镜下观察，与马铃薯淀粉粒进行比较，注意彼此间淀粉粒的大小、形状、层纹、脐点有何不同，找出各自淀粉粒的特征。结晶体(1)簇晶：取大黄根状茎粉末少许，置于滴加1～2滴水合氯醛试液的载玻片上，在酒精灯上慢慢加热透化，加稀甘油1滴，盖上盖玻片，用吸水纸拭净其周围的试剂，置镜下观察，可见到许多大型、形如星状的草酸钙簇晶。(2)针晶：取半夏粉末少许，按上述方法透化后制片观察，可见散在或成束的针状草酸钙晶体。偶尔可见到类圆形粘液细胞中含有排列整齐的针束。101 (3)方晶：取黄柏或甘草粉末少许，按上述方法制片，置镜下观察，在粉末中可见到一些方形、不规则形等形状的晶体。这些方晶常成行排列维旁边的薄壁细胞中，这种由一束纤维外侧包围着许多含有草酸钙方晶的薄壁细胞所组成的复合体，成为晶鞘纤维。(4)砂晶：取地骨皮或牛膝根粉末少许，按上述方法制片，在粉末中可见类圆形薄壁细胞中充满了细小三角形或箭头状的草酸钙砂晶。因砂晶存在于某些薄壁细胞中，将药材研成粉末后砂晶多分散在药材粉末中，而且数量很少，故难以与药材粉末区别。在观察时注意以下几点：①砂晶虽然很少，但大小非常均匀。②其形状为小的三角形颗粒，立体感较强。③在调节微调节器时砂晶常有忽明忽暗的现象，或略比周围粉末亮。若用地骨皮制成徒手切片，观察效果好于粉末制片。(5)柱晶：取射干粉末少许，按上述方法制片，置镜下观察，可见到棱角分明的长柱形晶体，晶体呈半透明状。四、实验报告与思考题1.绘洋葱鳞叶的内表皮细胞，注明细胞各部分。2．绘马铃薯、浙贝母、半夏淀粉粒的构造和类型图。3.绘制辣椒果肉细胞中的有色体。4.绘制各种材料、各种类型的草酸钙结晶。5．植物细胞的显微构造主要有哪几部分?6．质体有哪几种类型?它们的结构和功能之间有何关系?实验二植物组织的观察(分生、基本/薄壁、保护、机械组织、输导组织)实验学时：4学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.掌握分生组织、基本/薄壁的基本特征。2.掌握机械组织（厚角组织）的形态特征。101 3.掌握机械组织（厚壁组织：石细胞、纤维）的形态特征。4.掌握周皮(木栓组织)和表皮细胞及毛茸的形态特征，气孔的轴式(类型)5.掌握导管（管胞）的特征及类型，了解筛管和伴胞。二、仪器用品及实验材料1.仪器用品显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，刀片，镊子，水合氯醛试液，浓盐酸,间苯三酚试液,蒸馏水等。2.实验材料小麦或洋葱根尖永久纵切片；椴树茎永久横切片；薄荷茎横切面永久制片；大黄、甘草粉末；豆芽嫩茎；黄柏、厚朴、薄荷叶、金银花、石韦粉末；白英叶。三、实验内容和步骤1.顶端分生组织的观察取小麦根尖纵切片观察：先在低倍镜观察，首先确定根冠的位置，位于根冠之上是一团非常小，排列紧密的细胞，这些细胞就是顶端分生组织。转换高倍镜下观察可以清晰地看到较大的细胞核或正在进行细胞分裂的染色体形态。随着位置不断上下移动，细胞将逐渐增大，开始出现了细胞的分化，通过仔细观察，并比较细胞形态的变化，初步鉴定出原表皮层、基本分生组织和原形成层的大致位置。2.侧生分生组织的观察在显微镜下观察椴树茎横切片：首先在低倍镜可以明显地观察到微管组织呈环状排列，其中木质部被试剂染成红色，韧皮部被染成绿色，在木质部和韧皮部之间，可以看到几层扁平细胞呈环状排列，细胞略呈切向延长，这就是形成层。转换高倍镜下进一步观察可以清楚地看到，这几层切向延长的扁平细胞排列紧密，细胞壁薄。在大多数情况下，通常将这几层扁平细胞称为形成层，在这个区域不仅有形成层细胞，也包括了由形成层细胞刚刚分生出来的还未分化为木质部和韧皮部的组织，而这些细胞离形成层越近，两者就越难以区别。在茎的最外层有几层略呈扁平的被染成棕红色或红褐色的死亡细胞，细胞壁较厚，排列整齐，无胞间隙，这几层细胞为木栓层细胞。在木栓层内方有1～3101 层颜色淡而扁平的细胞就是木栓形成层，木栓形成层以及两侧刚刚分生出未成熟的组织有与维管形成层相似的特征。侧生分生组织细胞多为切线延长，并进行切向分生活动，沿器官的径向增加细胞的层数。可以说明，侧生分生组织活动的结果可以使植物体的轴状器官不断增粗，这种生长方式称为增粗生长。3.薄壁组织的观察观察薄荷茎的横切永久制片：在显微镜下可以看到许多大小不等的维管束呈环状排列于薄壁组织中，这些薄壁组织又可分为外部的皮层和中间的髓部，以及维管束之间的髓射线等。这类薄壁组织除了具有贮藏、输导作用外，还具有填充和使组织间彼此联系等功能，并具有转化为分生组织的可能。4.保护组织的观察（1）腺毛：是指可以分泌粘液、树脂、挥发油等物质的毛茸。取金银花花冠的一小片，经水合氯醛透化后制片观察；也可直接取金银花粉末制片观察。看到许多具有多细胞腺头的腺毛，有的腺头呈橄榄球状，有的腺头呈三角形状等，腺柄也由多细胞组成。腺鳞是一种特殊的腺毛，可选用薄荷叶（或唇形科的某一植物的叶）的表皮细胞制片观察，所看到的腺鳞的腺头是由8个分泌细胞呈辐射状排列组成，侧面观察为扁球形，具明显的角质层，极短的腺柄由单细胞组成，腺鳞周围的表皮多呈放射状排列。（2）非腺毛：是指没有腺头和腺柄区分，不能分泌物质的毛茸。非腺毛广泛存在于植物体的表面，种类极多，形态变化较大。金银花的非腺毛是由单细胞组成，较长，从基部向上逐渐变细，呈牛角弯曲状；薄荷叶表面的非腺毛是由多细胞组成，也呈牛角状歪曲。这些单细胞和多细胞组成的单列非腺毛是较为常见的类型，多种植物体表面都可以看到。此外也有多种形态和结构更为复杂的类型。取石韦叶片，用刀片刮取叶背面毛茸，加1滴蒸馏水制片观察，可以看到许多放射状星状毛。（3）气孔：植物体的表皮（除根表皮外）均有气孔，气孔由两个半月形的保卫细胞对合而成。在保卫细胞周围常有2至多个与表皮细胞形状不同的细胞，为副卫细胞；由于保卫细胞和副卫细胞之间不同的排列关系，双子叶植物的气孔有下列几种类型(撕取叶下表皮制成临时水装片观察)：a.平轴式气孔；b.直轴式气孔；c.环式；d.不等式气孔；e.不定式气孔101 5.机械组织的观察（1）厚角组织厚角组织可存在于植物的草质茎和叶柄内，特别是棱角处更为多见。厚角组织细胞多为生活细胞，它们的特点是细胞壁呈不均匀地增厚，这些细胞壁主要由纤维素组成，细胞壁具弹性而硬度不强。根据其增厚的位置不同，可分为真厚角组织、片状厚角组织和腔隙厚角组织。取新鲜的薄荷茎（或芹菜叶柄）为实验材料，作徒手横切片，因厚角组织分布在茎的四个角处，所以不用考虑切下的材料是否完整，只包括一个棱角即可，但要求所切下的材料一定要薄。将切下的材料放在载玻片上加稀碘液和66%硫酸，然后封片观察，可见茎的棱角处被染成淡蓝色的细胞壁，细胞的角处增厚明显，细胞腔略呈棱形。如高倍镜认真观察，细胞内可以看到原生质体存在，证明其为生活细胞。（2）厚璧组织厚壁组织细胞的特征是细胞壁全面显著地木质化增厚，常见层纹和纹孔，成熟的细胞腔小，是死细胞。根据其形态又可分为纤维和石细胞，纤维通常比石细胞要长很多，但也有许多中间类型。A.纤维纤维最显著的特征是细胞细长，细胞壁为纤维素或木质素增厚，通常成束存在。取黄柏粉末少许于载玻片上，加水合氯醛试液透化后再加间苯三酚和浓硫酸各一滴，然后封片在镜下观察。因粉末中许多纤维细胞均为木质化增厚，遇间苯三酚和浓硫酸后都可染成淡红色或樱红色。镜下观察到的纤维束周围的薄壁细胞中含有草酸钙方晶，成为晶纤维。B.石细胞石细胞广泛存地分布于植物体，并有各种各样的形状，这些细胞有较厚的次生璧并强烈地木质化，有许多的单纹孔或分枝的纹孔沟。因石细胞形态变化较大，分布较普遍，常作为中药鉴定的重要依据。取厚朴药材粉末少许，经水合氯醛试液透化后制片观察，可见石细胞成群或分散存在。石细胞多呈分枝状，细胞腔和纹孔沟清晰。因石细胞的细胞壁为木质素增厚，也可用间苯三酚和浓硫酸染色后观察。6.输导组织的观察（导管的观察）101 （1）取大黄粉末少许制片观察：其导管增厚部分为网状，网孔为未增厚部分，导管的直径较大，为典型的网纹导管，也可发现其他类型的导管如梯网纹导管。观察时要注意：先确认出导管类型，再进一步区分中间类型，找出彼此间的区别。（2）用甘草粉末少许制片观察：可看到很多导管碎片，细胞壁绝大多数增厚，仅留下一些未增厚的小孔，并可见两个同心圆，圆形或椭圆形，称具缘纹孔，有的分散排列，有的排列较为整齐。（3）取新鲜豆芽纵切面制片，观察其导管类型为环纹、螺纹、具缘纹孔等导管类型。四、实验报告与思考题1．绘各种类型气孔的简图。2．绘黄柏的纤维和石细胞图。3．腺毛和非腺毛有何区别?腺鳞有何形态特征?4．何谓周皮?它包括哪几部分?5．厚角组织和厚壁组织在形态和结构上有何不同?实验三　植物的分泌组织，植物根的外形、初生及次生结构的观察实验学时：4学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的和要求(一)掌握油细胞、油室、油管、树脂道、乳汁管等分泌组织（细胞）的形态特征。(二)掌握植物根的外部形态特征和根系的类型。(三)掌握根的初生构造及次生构造的特点。二、仪器用品及实验材料(一)仪器用品显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，刀片，水合氯醛试液，浓盐酸,间苯三酚试液,苏丹Ⅲ试液,蒸馏水等。(二)实验材料101 鲜姜（切片，观察油细胞）：小茴香横切面永久制片（观察油管）：丁香粗粉（观察裂生式油室）；桔梗（纵切片粉末）（观察乳汁管）。毛茛根横切面永久制片(观察根的初生构造)；直立百部根横切面永久制片；青木香根横切面永久制片（观察根的次生构造）。三、实验内容和步骤1.分泌组织（细胞）(1)分泌细胞油细胞取鲜姜作徒手切片，制成临时水装片，镜检，可见在薄壁细胞之间，杂有许多类圆形的油细胞，胞腔内含淡绿黄色挥发油滴。(2)油室丁香粉末装片观察，有大形腔穴即油室，内有挥发油。(3)油管观察小茴香横切面永久制片，可见有许多分泌细胞围绕成的大圆腔，即分泌道，因其内贮藏挥发油而称油管。(4)乳汁管观察桔梗纵切片，可见多细胞的有节乳汁管。2.根的外部形态特征和根系的类型主根：由胚根细胞的分裂和伸长所形成的向下垂直生长的根。侧根：主根生长达到一定的长度，在一定部位侧向生出的支根。不定根：在主根和侧根以外的部分，如茎、叶、老根或胚轴上生出的根。直根系：主根发达，主根和侧根界限非常明显的根系（裸子植物、双子叶植物的根系）。须根系：主根不发达，或早期死亡，由茎基部长出许多大小、粗细相仿的不定根，呈胡须状簇生的根系（单子叶植物、少数双子叶植物的根系）。3.根的初生构造(1)双子叶植物根的初生构造毛茛根横切片的观察取毛茛根横切片，在低倍镜下观察区分出表皮、皮层和维管柱三大部分，再转换高倍镜由外向里仔细观察表皮、皮层和维管柱的细胞构造特点。①表皮：为最外一层薄壁细胞，排列整齐紧密，没有细胞间隙。②皮层：位于表皮内，占根的相当大部分，由多层排列疏松的薄壁细胞组成。可以区分为三层。紧靠表皮下方的1~2101 层细胞，略呈切向延长，排列较紧密，称外皮层。位于外皮层以内为多层排列疏松的薄壁细胞，具明显的细胞间隙，称为皮层薄壁组织。皮层最内一层排列紧密的细胞称为内皮层。内皮层有些细胞的径向壁上，可见增厚的凯氏点。③维管柱：为内皮层以内的所有组织，占据根中央部分，细胞较小而密集，由中柱鞘、初生木质部和初生韧皮部组成。中柱鞘：为紧贴内皮层的1--2层薄壁细胞组成，细胞壁薄，排列紧密。侧根、木栓形成层和维管形成层的一部分均发生于中柱鞘。初生木质部：在中柱鞘内方部分，为四束（四原型）呈放射状。靠近中柱鞘一端的导管口径较小，是原生木质部；近根中心的导管分化较晚，口径大，为后生木质部，这是根的初生构造特征之一。由于初生木质部一直分化到根的中央，故无髓，这是典型的双子叶植物根的初生构造特征。初生韧皮部：位于两初生木质束部之间，与初生木质部束相间排列呈辐射状，构成辐射维管束，这也是根的初生构造的重要特征。初生韧皮部，束的数目与初生木质部束数相同。细胞大小不一，呈多角形。薄壁细胞：在初生木质部束和初生韧皮部束之间分布的很薄的细胞层，当根进行次生生长时，它将分化成维管形成层的一部分。(2)单子叶植物根的初生构造观察直立百部根的横切制片①根被：由最外层3--4层细胞组成，细胞壁具条纹状木栓化纹理。②皮层：紧靠根被内方，占根的大部分，由薄壁细胞组成。可区分为外皮层、皮层薄壁组织和内皮层。内皮层可见凯氏带。③维管柱：内皮层以内的全部组织。包括中柱鞘、初生木质部、初生韧皮部和髓。中柱鞘：紧贴内皮层，由1--2层小型薄壁细胞组成，细胞切向延长，略似内皮层细胞，但其侧壁没有增厚。初生木质部束和初生韧皮部束：各19--27个，相间排列成辐射维管束。韧皮部束内侧有单个或2--3成束的非木化纤维；木质部导管类似多角形，偶有单个或2--3个并列的导管分布于髓部外缘，作二轮列状。髓：位于维管柱的中心，散有单个或2--3个成束的细小纤维。4.根的次生构造观察青木香根横切制片101 先在低倍镜下从外向里逐层观察各部分组织所在的部位，然后转高倍镜仔细观察各部组织的细胞特点。(1)周皮为最外方的数层细胞，由木栓层、木栓形成层和栓内层组成。①木栓层：为最外几层排列紧密、整齐的扁平状细胞，细胞壁栓质化，是死细胞，常呈浅棕色。②木栓形成层：是由中柱鞘细胞恢复分生能力而产生的在木栓层内方一层扁长形的薄壁细胞，在切片中不易分辨。③栓内层：在木栓形成层的内方。狭窄，为2～3列呈切向延长的大型薄壁细胞。(2)次生维管组织在栓内层以内的全部组织，是由形成层活动所产生的。①次生韧皮部：为周皮以内，包括筛管、伴胞和韧皮薄壁细胞、韧皮纤维、韧皮射线。在横切面上韧皮薄壁细胞与筛管形态相似，常不易区分。韧皮射线多弯曲，由l～2列径向排列的薄壁细胞组成。②形成层：在次生韧皮部和次生木质部之间，由排列紧密、整齐的扁长方形薄壁细胞组成。形成层只有一列细胞，但由于它向内、向外分裂迅速，刚产生不久的衍生细胞，尚未分化成熟，故在横切面上看到是多列细胞组成的“形成层区”。③次生木质部：占整个根的大部分。位于形成层以内，包括导管、管胞和木薄壁细胞等。横切面上，导管最容易辨认，口径大小不一的类圆形或多边形的死细胞，作放射状排列。在次生木质部的内方，根的中心部位，为初生木质部。其导管口径细小。④维管射线：贯穿整个次生木质部和次生韧皮部中，沿径向延长，由1～2列薄壁细胞组成，在韧皮部内的叫韧皮射线，在木质部的叫木射线。维管射线也呈放射状排列。注意根次生构造的维管束已由辐射型转变成无限外韧型维管束，大多数双子叶植物的根中央没有髓部。四、实验报告与思考题1．绘制油细胞、油管、油室详图。2．绘制毛茛根横切、直立百部根横切面面、青木香根横切面详图、．3．溶生式油室与裂生式油室的区别在哪里?4．根的初生构造包括哪几部分，内皮层有何特点?101 实验四、植物茎（根茎）的外形、初生及次生结构的观察实验学时：4学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的和要求(一)掌握茎的形态和变态类型。(二)掌握茎的初生构造及次生构造特点。二、仪器用品及实验材料(一)仪器用品显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，刀片，水合氯醛试液，蒸馏水等。(二)实验材料1.向日葵幼茎横切面永久制片。2.３-４年生椴树茎横切面制片。3.薄荷茎横切面永久制片。4.玉蜀黍茎横切面永久制片。5.新鲜材料：白杨树幼嫩枝条，樟树幼嫩枝条三、实验内容和步骤1.茎的形态茎的形态特征：节和节间、顶芽、腋芽、叶痕和皮孔。2.茎的变态(1)地上茎变态①叶状枝茎扁化变态成绿色的叶状体。②枝刺由腋芽发育而成，不易剥落，可观察皂荚或枸橘的刺。③茎卷须由茎变态而来，呈卷须状。④小块茎和小鳞茎均由地上茎的腋芽变态而成，如薯蓣茎上叶腋的珠芽(小块茎)和半夏叶柄上的珠芽(小块茎)以及卷丹(小鳞茎)。(2)地下茎变态①根状茎101 多匍匐生长在土壤中，是很象根的一种地下茎。如姜、玉竹或黄精、白茅或莲藕的根状茎，②块茎如马铃薯或天麻，其上有顶芽，叶退化，脱落后留有叶痕，其腋部是凹陷的芽眼，每个芽眼内，可有l至多个腋芽萌发，注意其缩短的节间。③球茎如荸荠，球茎是由地下侧枝末端膨大而形成。有环状短的节间和膜质叶。④鳞茎如洋葱头，有鳞茎盘、鳞片叶、腋芽。有的植物鳞叶较肥厚。3.双子叶植物草质茎的初生结构观察向日葵幼茎横切制片在低倍镜下区分出表皮、皮层和维管柱三部分（维管束环状排列为一圈，束间有髓射线，中央为宽大的髓），然后转换高倍镜逐层观察：(1)表皮：为一层排列整齐、紧密的扁长方形的薄壁细胞组成，其外壁角质加厚，有时可见非腺毛。(2)皮层：为多层薄壁细胞，具细胞间隙。与根的初生构造相比，所占比例很小。靠近表皮的几层细胞较小，是厚角组织，细胞在角隅处加厚，其内为数层薄壁细胞，其中有小型分泌腔。皮层的最内一层细胞无凯氏带的分化。(3)维管柱：所占面积宽广，包括维管束、髓射线和髓。维管束：为数个大小不等的无限外韧维管束，排成一轮，每个维管束由初生韧皮部、束中形成层、初生木质部组成。初生韧皮部位于维管束外方，其外侧有韧皮纤维，横切面呈多角形，壁明显加厚。在初生韧皮纤维内方是筛管、伴胞和韧皮薄壁细胞。束中形成层为2～3列扁平长方形细胞，排列紧密、壁薄。初生木质部，导管横切面类圆形或多角形，根据导管分子口径的大小可以判断靠近茎中心的是原生木质部，导管口径小，发生早；而接近束中形成层的为后生木质部，导管口径大，发生较晚。髓射线：是两个维管束之间的薄壁细胞，它外连皮层，内接髓部。具横向运输，兼有贮藏的功能。髓：位于茎的中央，也是维管柱中心的薄壁细胞，排列疏松，常具贮藏功能。4.双子叶植物草质茎次生构造观察薄荷茎横切制片可见茎呈四方形，在显微镜下由外到里仔细观察以下部分：101 (1)表皮：为一层长方形表皮细胞组成，外被角质层，有时具毛(腺毛、非腺毛或腺鳞)。(2)皮层：较窄，为数层排列疏松的薄壁细胞组成。在四个棱角内方，各有10余层厚角细胞组成的厚角组织，其细胞角隅处加厚明显。内皮层明显，径向壁上可见。(3)维管柱：①维管束：由四个大的维管束(正对棱角)和其间较小维管束环状排列。韧皮部在外方，狭窄，形成层成环，束间形成层明显。木质部在棱角处较发达，导管单列，数行，纵向排列，在导管列之间为薄壁细胞组成的维管射线。②髓：发达，由大型薄壁细胞组成。③髓射线：为维管束间的薄壁细胞组成，宽窄不一。5.双子叶植物木质茎的次生结构观察3～4年生椴树茎的横切制片先在低倍镜下观察切面的整个轮廓，可见到分为两大部分：周皮和次生维管组织。转换高倍镜，自横切面的最外层向内依次观察。(1)周皮包括三部分：木栓层——位于最外层，由数层排列整齐的扁平状细胞组成。木栓形成层——位于木栓层之内为一层扁平状薄壁细胞组成，切片中不明显。栓内层——位于木栓形成层内方。由多层排列疏松的薄壁细胞组成。(2)次生韧皮部细胞排列成梯形(底部靠近形成层)，与排列成喇叭形的髓射线薄壁细胞相间分布。在切片中，占茎部横切比例较小，明显可见韧皮纤维与韧皮薄壁细胞、筛管和伴胞呈横条状相间排列。初生韧皮部已破坏。(3)形成层为形成层区，呈环状，由4～5层排列整齐的扁长细胞组成。(4)次生木质部在形成层内方，在横切面上占有最大面积。主要是次生木质部。由于其细胞直径的大小和壁的厚薄不同，可以看到数轮同心轮层，即年轮。注意观察早材和晚材在组织构造上的区别，紧靠髓部周围的一群小型导管即初生木质部。(5)髓位于茎的中央，多由薄壁细胞组成，有的含草酸钙簇晶，有的含粘液和单宁。(6)髓射线由髓部薄壁细胞向外辐射状发出，直达皮层经木质部时，为l～2列细胞，至韧皮部时则扩大成喇叭状。(7)维管射线101 在每个维管束之内，由木质部和韧皮部中的横向运输的薄壁细胞组成，一般短于髓射线。位于木质部的称木射线，位于韧皮部的称韧皮射线。6.单子叶植物茎的结构观察观察玉蜀黍茎横切面永久制片表皮：为一层长方形表皮细胞组成，具有角质层，其下常有厚壁细胞。基本组织：表皮内为大量基本组织。维管束：有限外韧型维管束或周木型维管束散在分布于基本组织中，无皮层与髓之分。四、实验报告与思考题1．绘制向日葵幼茎横切面、椴树茎横切面简图。2．绘制薄荷茎横切面、玉蜀黍茎横切面详图。3．茎的变态有哪些类型，各有什么特征?4．比较双子叶植物茎初生构造和单子叶植物茎显微构造的区别?实验五：叶的外形、内部构造及繁殖器官观察实验学时：4学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的（1）了解叶的外部形态，掌握签别叶的各部分包括叶脉、单叶及复叶的基本原则；（2）学习叶的徒手切片技术。掌握叶的显微结构的基本特征。（3）掌握花的外部形态与结构和花序的分类。（4）掌握花和果的结构的对应关系。（5）掌握果的分类。二、仪器用品及实验材料（一）仪器用品显微镜、载玻片、盖玻片、刀片、镊子、毛笔、蒸馏水等。（二）实验材料101 新鲜的叶片（包括单叶和复叶）、小麦和水稻的叶的永久制片。百合子房的永久制片、常见的果实。三、实验内容和步骤（一）植物叶的外形观察（1）叶的基本形态叶片：叶片的形状，即叶形，类型极多，就一个叶片而言，上端称为叶端，基部称为叶基，周边称为叶缘；贯穿于叶片内部的维管束则为叶脉，这些部分亦有很多变化。叶柄：为着生于茎上，以支持叶片的柄状物。托叶：为叶柄基部或叶柄两侧或腋部所着生的细小绿色或膜质片状物。托叶通常先于叶片长出，并于早期起着保护幼叶和芽的作用。托叶的有无，托叶的位置与形状，常随植物种属而有不同，因此亦为中草药鉴定时需要给予适当注意的形态特征之一。（二）单叶与复叶单叶(simpleleaf)一个叶柄上只生1张叶片的，如棉、油菜、桃等的叶。复叶(compoundleaf)一个叶柄上着生2～多数分离的叶片，如大豆、蚕豆、紫云英、七叶树等的叶。复叶的叶柄叫总叶柄(commonpetiole)，其延伸的部分称叶轴(rachis)；其上着生的叶片称小叶(leaflet)，小叶的柄称为小叶柄(petiolule)，小叶的托叶称小托叶(stipel)。复叶依小叶排列的形态不同，有以下几种类型：①羽状复叶(pinnatelycompoundleaf)3枚以上的小叶排列在叶轴的左右两侧，呈羽毛状，如蚕豆、月季等的叶。羽状复叶以小叶数目可为单数或双数，因此又分为：单（奇）数羽状复叶(odd-pinnatelycompoundleaf)，小叶的数目为单数，有一顶生小叶，如紫云英、月季的叶；双（偶）数羽状复叶(even-pinnatelycompoundleaf)，小叶的数目为双数，无顶生小叶，如花生、皂荚的叶。羽状复叶又因叶轴分枝的情况，可分为一回、二回、三回或多回羽状复叶：紫云英、蚕豆的复叶叶轴不分支，小叶直接生在叶轴上，属一回羽状复叶(simplecompoundleaf)；如叶轴分支一次，各分支也做羽状排列的，小叶生在叶轴的分支上，称二回羽状复叶(bipinnateleaf)，如合欢、云实的叶。此时叶轴的分枝叫做羽片(pinna,复数pinnae)；如叶轴羽状分枝二次，则为三回羽状复叶(bipinnateleaf)，如南天竹、楝的叶；以此类推。101 ②掌状复叶(palmatelycompoundleaf)3枚以上的小叶都着生在总叶柄的顶端，排列呈掌状，如大麻，木通的叶。③三出复叶(teratelycompoundleaf)仅有3片小叶着生在总叶柄的顶端。三出复叶又有：羽状三出复叶(ternatepinnateleaf)，顶端的小叶柄较长，如大豆、菜豆、苜蓿等的叶；掌状三出复叶(ternatepalmateleaf)，3小叶柄等长，如酢浆草、车轴草的叶。有些二回掌状复叶和三回掌状复叶实际上是二回三出复叶和三回三出复叶。前者如淫羊藿；后者如唐松草的叶。④单身复叶(unifoliatecompoundleaf)形似单叶，可能是三出复叶的一退化类型，其两侧的小叶退化不存在，顶生小叶的基部和叶轴交界处有一关节，叶轴向两侧延展，常成翅，如柑桔、金桔等的叶（三）制备叶的临时切片（1）选切叶片：选一片新鲜的菠菜叶片，平放在玻璃板上，用刀片切去叶片基部、叶片尖端以及叶片两侧的边缘。留下部分为宽约0.5cm左右、中央带有主脉的长方形小块叶片。（2）切取材料：用左手食指指尖压住材料一端，右手并排捏紧两个刀片，从另一端沿和主叶脉垂直方向多次切割材料，每切一次刀片要沾水一次，以便将切下的叶片薄片放入盛有清水的玻璃皿中。（3）选材制片：用镊子从水中选取较薄的叶片切片，放在洁净的载玻片上，制成临时切片。（四）观察双子叶植物叶的内部构造（1）表皮位于叶的上下表面，分别称为上表皮和下表皮。上下表皮均为一层细胞组成，横切面呈长方形，外壁有透明角质层。表皮上有棒状或椭圆形表皮毛或腺毛。在表皮细胞中有成对、较小的细胞即保卫细胞，两个保卫细胞之间的缝隙是气孔。在表皮上还可以见到表皮毛。注意观察细胞中是否有叶绿体，以及上下表皮气孔的数目的差异。气孔在上下表皮中均有分布，但下表皮为多，并能见到保卫细胞的横切面，在其内侧可看到有明显的气室。（2）叶肉位于上下表皮之间，细胞中含有大量叶绿体。靠近上表皮，与其垂直的一层（或2101 层）排列整齐的长圆柱形薄壁细胞称为栅栏组织，细胞内含叶绿体较多。在栅栏组织和下表皮之间，有许多形状不规则，排列疏松的薄壁细胞称为海绵组织，细胞内含叶绿体较少。主脉附近的叶肉中可见到分泌腔。注意观察栅栏组织和海绵组织的细胞特点，以及孔下室的分布位置。试想这些特点与植物的生存环境及叶的功能有什么关系?（3）叶脉叶肉中的维管组织，主脉较大，由主脉进行分支形成侧脉。主脉包埋在基本组织中，上方表皮下有厚角组织，下方基本组织中有厚壁细胞分布。叶脉维管束的木质部在近轴面，而韧皮部在远轴面。在较大叶脉的木质部与韧皮部之间有一层形成层细胞。侧脉维管束的组成趋于简单，木质部和韧皮部只有少数几个细胞，但一般具有薄壁细胞形成的维管束鞘。在切片中可以见到各种走向的叶脉，试想其原由。（五）观察单子叶植物叶的内部构造（1）表皮小麦叶表皮分上、下表皮，各为一层细胞组成。表皮由表皮细胞、表皮毛、气孔器、上表皮泡状细胞（或称运动细胞）构成。表皮细胞外壁角质层增厚，并高度硅化，形成一些硅质和栓质乳突及附属毛。泡状细胞位于两个维管束之间，呈扇形，外壁无角质层增厚。上、下表皮均有气孔分布，可见保卫细胞和副卫细胞的横切面。（2）叶肉叶肉无栅栏组织和海绵组织之分，属等面叶。叶肉细胞不规则，其细胞壁向内皱褶，形成具有“峰、谷、腰、环”结构的叶肉细胞。水稻叶中有发达的气腔。注意比较小麦与水稻叶的不同。（3）叶脉叶脉为平行脉，见到的只有横切面。维管束有大有小，维管束鞘为两层细胞，外层细胞较大、壁薄、含少量叶绿体，内层细胞小、壁厚，为C3植物。叶脉上下方都有机械组织将叶肉隔开而与表皮相连，属有限维管束。（六）花的外形观察（1）花的基本组成取备好的花一朵，用镊子由外向内剥离，观察其组成。花柄花下面所生的短柄，是花与茎相连的中间部分。花托花柄顶端凹陷成杯状的部分（实际是花筒），花的其它部分都着生在花筒的边缘上。花萼着生在杯状花托边缘的最外层，由五个绿色叶片状萼片组成，离生。花冠花萼里面一层，由五片粉红色花瓣组成的离生花冠。101 雄蕊雄蕊在花托边缘作轮状排列，数目多，不定数，每一雄蕊由花丝和花药两部分组成。花丝细长，花药呈囊状。雌蕊雌蕊着生于杯状花筒底部的花托上，顶端稍膨大的部分为柱头；基部膨大部分为子房；柱头和子房之间的细长部分为花柱。注意子房位置的变化：花朵中的各部位都是直接长在花托上的，如果花托的中部略微突起，将子房向上推，那萼片、花冠和雄蕊都长在子房之下，此种花就称“下位花”或称“子房上位”，如杜鹃花。反之，如果子房下陷，全住都被花托包住，花的其他不为著生在其上，就称为“上位花”或称“子房下位”，如：苹果。倘若子房并没有完全下陷，只有基部被花托包围，而萼片、花瓣和雄蕊，围绕著子房著生，此类的花就称“周位花”，如：梅、李。观察子房与胚珠的结构取百合子房横切（示胚珠结构）永久制片，置低倍镜下观察，可见百合子房由三个心皮联合构成，子房3室，每两个心皮边缘联合向中央延伸形成中轴，胚珠着生在中轴上，在整个子房中，共有胚珠六行，在横切面上可见每个室内有2个倒生的胚珠着生在中央上，称中央胎座。转换高倍镜观察子房壁的结构，可见子房壁的内外均有表皮，两层表皮之间为圆球形薄壁细胞组成的薄壁组织。再转换低倍镜，辨认背缝线、腹缝线、隔膜、中轴和子房室，然后选择一个通过胚珠正中的切面，用高倍镜仔细观察胚珠的结构。珠柄在心皮边缘所组成的中轴上，是胚珠与胎座相连接的部分。珠被胚珠最外面的两层薄壁细胞，外层为外珠被，内层为内珠被。两层珠被延伸生长到胚珠的顶端并不联合，留有一孔，即为珠孔。珠心胚珠中央部分为珠心，包在珠被里面。合点珠心、珠被和珠柄相联合的部分。胚囊珠心中间有一囊状结构，即为胚囊。（2）花序的形态观察无限花序(indefiniteinflorescence)无限花序也称总状花序，它的特点是花序的主轴在开花期间，可以继续生长，向上伸长，不断产生苞片和花芽，犹如单轴分枝，所以也称单轴花序。各花的开放顺序是花轴基部的花先开，然后向上方顺序推进，依次开放。如果花序轴缩短，各花密集呈一平面或球面时，开花顺序是先从边缘开始，然后向中央依次开放。无限花序又可以分为以下几种类型：101 1、总状花序(raceme)花轴单一，较长，自下而上依次着生有柄的花朵，各花的花柄大致长短相等，开花顺序由下而上，如紫藤、荠菜、油菜的花序。2、穗状花序(spike)花轴直立，其上着生许多无柄小花。小花为两性花。禾本科、莎草科、苋科和蓼种中许多植物都具有穗状花序。3、柔荑花序(catkin)花轴较软，其上着生多数无柄或具短柄的单性花（雄花或雌花），花无花被或有花被，花序柔韧，下垂或直立，开花后常整个花序一起脱落。如杨、柳的花序；栎、榛等的雄花序。4、伞房花序(corymb)或称平顶总状花序，是变形的总状花序，不同于总状花序之处在于花序上各花花柄的长短不一，下部花花柄最长，愈近花轴上部的花花柄愈短，结果使得整个花序上的花几乎排列在一个平面上。花有梗，排列在花序轴的近顶部，下边的花梗较长，向上渐短，花位于一近似平面上，如麻叶绣球、山楂等。如几个伞房花序排列在花序总轴的近顶部者称复伞房花序，如绣线菊。一种变形的总状花序。开花顺序由外向里。如梨、苹果、樱花等的花序。5、头状花序(capitulum)花轴极度缩短而膨大，扁形，铺展，各苞片叶常集成总苞，花无梗，多数花集生于一花托上，形成状如头的花序。如菊、蒲公英、向日葵等。6、隐头花序(hypanthodium)花序轴特别膨大而内陷成中空头状，许多无柄小花隐生于凹陷空腔的腔壁上，几乎全部隐没不见，整个花序仅留顶端一小孔与外方相通，为昆虫进出腔内传布花粉的通道。小花多单性，雄花分布内壁上部，雌花分布在下部，如无花果、薜荔等。7、伞形花序(umbel)花轴缩短，大多数花着生在花轴的顶端。每朵花有近于等长的花柄，从一个花序梗顶部伸出多个花梗近等长的花，整个花序形如伞，称伞形花序。每一小花梗称为伞梗。如报春、点地梅、人参、五加、常春藤等。8、肉穗花序(spadix)101 基本结构和穗状花序相同，所不同的是花轴粗短，肥厚而肉质化，上生多数单性无柄的小花，如玉米、香蒲的雌花序、有的肉穗花序外面还包有一片大型苞叶，称佛焰苞(spathe)，因而这类花序又称佛焰花序，如半夏、天南星、芋等。以上所列各种花序的花轴都不分枝，所以是简单花序。另有一些无限花序的花轴具分枝，每一分枝上又呈现上述的一种花序，这类花序称复合花序。常见有以下几种：1、圆椎花序(panicle)又称复总状花序。长花轴上分生许多小枝，每个分枝又自成一总状花序，如南天竺、稻、燕麦、丝兰等。2、复伞形花序(compoundumbel)花轴顶端丛生若干长短相等的分枝，各分枝又成为一个伞形花序，一分枝又自成一伞房花序，如胡萝卜、前胡、小茴香等。3、复伞房花序(compoundcorymb)花序轴的分枝成伞房状排列，每一分枝又自成一伞房花序，如花楸属。4、复穗状花序(compoundspike)花序轴有1或2次穗状分枝，每一分枝自成一穗状花序，也即小穗，如小麦、马唐等。5、复头状花序(compoundcapitulum)单头状花序上具分枝，各分枝又自成一头状花序，如合头菊。有限花序(definiteinflorecence)有限花序也称聚伞类花序，它的特点合无限花序相反，花轴顶端或最中心的花先开，因此主轴的生长受到限制，而由侧轴继续生长，但侧轴上也是顶花先开放，故其开花的顺序为由上而下或由内向外。又可以分为以下几种类型：1、单歧聚伞花序(monochasium)主轴顶端先生一花，然后在顶花的下面主轴的一侧形成一侧枝，同样在枝端生花，侧枝上有可分枝着生花朵如前，所以整个花序是一个合轴分枝。如果分枝时，各分枝成左、右间隔生出，而分枝与花不在同一平面上，这种聚伞花序称蝎尾状聚伞花序(scorpioidcyme)，如委陵菜、唐菖蒲的花序。如果各次分出的侧枝，都向着一个方向生长，则称螺状聚伞花序(helicoidcyme)，如勿忘草花序。2、二歧聚伞花序(dichasium)101 也称歧伞花序。顶花下的主轴向着两侧各分生一枝，枝的顶端生花，每枝再在两侧分枝，如此反复进行，如卷耳、繁缕、大叶黄杨等。3、多歧聚伞花序(pleiochasium)主轴顶端发育一花后，顶花下的主轴上右分出三数以上的分枝，各分枝又自成一小聚伞花序，如泽漆、益母草等的花序。泽漆短梗花密集，称密伞花序；益母草花无梗，数层对生，称轮伞花序。（七）果的外形观察（1）肉果：果皮肉质化，往往肥厚多汁。肉果按果皮来源和性质不同又可划分为以下几种类型。浆果：是由一个或几个心皮形成的果实。果皮除外面几层细胞外，一般柔嫩，肉质而多汁，内含多数种子，如葡萄、番茄、柿等。核果：由一心皮一室的单雌蕊发育而成的果实，通常含一枚种子。三层果皮明确可分，外果皮极薄；中果皮是发达的肉质食用部分；内果皮的细胞经木质化后，成为坚硬的核，包三种子外面，所以称为核果。如胡桃、樟科植物的果实。柑果：外果皮坚韧革质，有很多油囊分布。中果皮疏松髓质，有维管束分布其间，内果皮膜质，分为若干室，室内充满含汁的长形丝状细胞，原来子房内壁的毛茸发育而成为这类果实的食用部分。如常见的柑桔、柠檬等。梨果：果实由花筒和心皮部分愈合后共同形成，所以是一类假果。外面很厚的肉质部分是原来的花筒，肉质部分以内才是果皮。如梨、苹果等。瓠果：果实的肉质部分是子房和花托共同发育而成的。如葫芦科植物的果实。（2）干果：果实成熟后，果实干燥无汁的称干果。干果主要有以下几种。蓇葖果：由单心皮或离生心皮雌蕊发育而成，成熟时沿腹缝线或背缝线一侧开裂。如淫阳霍、杠柳。荚果：由单心皮发育而成。成熟时沿腹、背缝线同时开裂，为豆科植物特有的果实。如白扁豆、苦参。角果：由2心皮合生的子房发育而成，具假隔膜，种子生于假隔膜上，成熟时两侧腹缝线同时开裂，分为长角果和短果，如油菜、菘蓝。蒴果；合生心皮发育的果实，子房1至多室，成熟时有多种开裂方式：室间开裂、室背开裂、室轴开裂，孔裂，盖齿裂，如蓖麻、百合，曼佗罗。101 瘦果：单粒种子，成熟时果实易与种皮分离，如向日葵。颖果:单粒种子，成熟时果实与种皮愈合不易分离，如玉米。翅果：单粒种子，果皮向外延生成翅，如杜仲。四、实验报告与思考题1．绘制在实验中所观察到叶的横切面简图，注明各个结构。比较双子叶植物和单子叶植物的叶在形态结构上的差别。2．如何区分单叶和复叶的小叶。3．果实的基本结构有哪些(以桃为例)？它们分别是由花的哪些结构发育而来的？4．苹果、柑橘、菠萝和草莓的主要食用部分是由花的什么结构发育而来的？5．聚合果与聚花果的根本区别是什么？实验六植物标本的采集制作及植物检索表的编制与使用实验学时：4学时实验类型：综合性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、植物标本的采集和制作1．采集制作植物标本的目的植物标本采集后，应制作成腊叶标本（装订于台纸），供分类鉴定研究之用。发表新种时作为模式标本；进行有关科研时作为凭证标本。2．采集、压制植物标本的常用工具枝剪；小铲子；塑料袋；海拔仪/GPS定位仪（记录海拔高度及经纬度）；标本夹；吸水纸；采集记录本；号签。3．植物标本采集注意点（1）标本的完整性尽量完整：带繁殖器官（花、果；孢子叶球；孢子囊群）。雌雄异株植物：雌株与雄株均采。先花后叶的种类：应先后采花枝、带叶的枝条。草本植物：带地下部分（尤根茎等）。101 寄生植物：与寄主同采。（2）标本的代表性既要注意个体变异（生境等原因引起），又不要采极端个体（如最大、最小的植株）；多年生草本应注意生长年限。（3）标本的份数同种植物（在同一处采集）的同号标本可采2-3份。研究种群/居群内形态变异的标本应采多份。（4）采集记录应及时编号记录，记录内容：采集地点、日期；标本号；生境；花、果颜色；较大植株的体高；木本明确是乔木、灌木或木质藤本；草本记清直立、斜升、平卧或藤本。采集记录与号签上的编号须一致。同地点的同一植物编同一个标本号。同一植物在不同地点编不同的号。4．植物标本的压制与制作（1）修剪与整形：略小于台纸；较大者可折成“V”、“N”字形；枝叶太密可适当剪除，但须留下枝条、叶柄基部（以利鉴定）。（2）注意，标本号与采集记录编号同号；对口药材与标本同号。（3）压干：标本主要以正面叶朝上，又要有2~3片反面叶朝上；皱褶的叶片须展平；新采标本一日换纸一次，以后可1~2日换纸一次，直至标本干透；吸水纸晒干反复使用。（4）消毒防蛀：0.05%二氯化汞(升汞)酒精溶液浸泡1min，捞出晾干,或低温（－30℃）冷冻3~4日后，装订于台纸上。（5）装订：叶反面及同侧茎枝上涂胶水，粘贴于台纸上，左上方及右下方留空，以粘贴采集记录及鉴定标签。胶水干后用针线缝牢。二、植物检索表的编制与使用1．检索表简介查阅检索表是识别鉴定植物的常用方法（还有核对标本、核对图文等法可供参考）。检索表编制原则：先对待分类鉴定的全部植物的形态进行比较，选择相互对应的明显不同的特征，将植物按两类逐步分类，直至划分为不同的科、属、种。101 检索表类型：定距检索表（常见）；平行检索表。定距检索表：植物类群中相对应的特征编为相同的号码，并书写在距页面左边同等距离处；每对次一项的特征较上一项特征向右缩进一定距离（一个字符的宽度）。2．检索表的编制（1）编制之前，对全部植物类群的特征作一一比较。（2）检索表的每一编号下只能设2类性状相对应，互不包含。（3）选择稳定的、不同类群之间有明显间断的性状用于检索（避免使用连续的数量性状）。（4）器官名在句首，表示其特征的形容词或数词在后：如“花白色”、“雄蕊5”。（5）所有种类均应在在检索表中可查出。检索表举例：珙桐科（中国3属）分属检索表1．果为核果状2.核果大，有3-5种子；子房6-10室，花被缺，头状花序………………………………………………………………珙桐属Davidia2.核果小，常具1种子；子房1-2室，花被存在，花簇生………………………………………………………………兰果树属Nyssa1．果为翅果状，多集成头状果序……………………喜树属Camptotheca3．检索表的使用（1）熟练掌握植物形态结构专业术语含义（植物形态学基础知识）。（2）从检索表的第一项开始检索：同一编号有性状完全对立的两条，待检植物符合哪一条，就在该条下继续检索，直到检出结果。（3）如待检标本不完整（如仅有茎叶、无花果），在无法确定符合相互对立的哪一条时，可假设符合任一条试着检索。（4）检索到科、属或种后，还需与该科、属、种的具体形态特征描述逐句核对，相符时方可肯定其检索结果。（5）植物鉴定还须结合地理分布、生境、海拔高度等因素。101 中南民族大学药学院化学生物学与药学实验教学中心化生专业综合实验(1)—《天然药物化学》讲义李竣、刘新桥编写适用专业：药学专业药物制剂化学生物学专业2011年9月101 目录实验1~2大黄中大黄素的提取、分离和鉴定………………………30实验3~4补骨脂黄酮体的提取、分离及鉴定………………………33实验5汉防己生物碱的提取、分离和鉴别…………………………36101 实验1~2、大黄中大黄素的提取、分离和鉴定实验学时：12学时实验类型：综合性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1．掌握蒽醌苷元的提取方法—酸水解法。2．掌握pH梯度萃取法的原理及操作技术。3．学习硅胶柱色谱法。二、大黄中主要成分的物理性质大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheumpe1matumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exBalf．或药用大黄RheumofficinaleBail1．的干燥根及根茎。具泻下，健胃、清热解毒等功效，因炮制方法不同，功效各有所主。大黄的主要成分为蒽醌衍生物，总量约3％～5％，以部分游离，大部分与葡萄糖结合成带苷的形式存在。大黄的抗菌、抗感染有效成分为大黄酸、大黄素和芦荟大黄素，表现在对多种细菌有不同程度的抑菌作用。药理证明大黄能缩短凝血时间，止血的主要成分为大黄酚。大黄粗提物、大黄素或大黄酸对实验性肿瘤有抗癌活性。此外，结合型的蒽醌是泻下的有效成分，包括蒽醌苷和双蒽醌苷。另外，大黄还含有鞣酸类多元酚化合物，含量在10％～30％之间，具止泻作用，与蒽苷的泻下作用恰恰相反。大黄中主要成分的物理性质如下：1．大黄酸（rhein）：C15H8O6，黄色针状结晶，mp321℃～322℃，330℃分解。能溶于碱、吡啶，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚，不溶于水，（1gε）：222（4.40），249（4.18），272（4.18），293sh（4．14），437（4.02）。：1701，1637。2．大黄素（emodin）：，橙黄色针状结晶（乙醇），mp256℃～257℃（乙醇或冰乙酸），能升华。易溶于乙醇、碱液，微溶于乙醚、氯仿，不溶于水。（1gε）：220，225（4.31），265（4.29），290（4．30），439（4．14）。：101 3450，3000（宽），1669，1624，1580，1465，1380，1340，1270，1200，1160。成分名称R1R2大黄酚CH3H大黄素CH3OH大黄素甲醚CH3OCH3芦荟大黄素CH2OHH大黄酸COOHH3．芦荟大黄素（aloe-emodin）：，橙色针状结晶（甲苯），mp223℃～224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色。：3400（宽），1680，1630，1580。4．大黄酚（chrysopHanol）：，橙黄色六方形或单斜形结晶（乙醇或苯），mp196℃～197℃（乙醇或苯），能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，微溶于石油醚、冷乙醇，不溶于水。（1gε）：224（4.73），257（4.48），277（4.18）,287（4.18），429（4.14）。：1680，1630，1607，1560，1478。5.大黄素甲醚（pHyscion）：，砖红色单斜针状结晶，mp203℃～207℃（苯），溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及乙酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。（1gε）：226（4.45），255（4.22），267（4.25），288（4.22），440（4.02）。：3400，1668，1625，1570。6．羟基蒽醌苷类：大黄素甲醚葡萄糖苷（pHyscionmonog1ucoside），黄色针状结晶，mp235℃；芦荟大黄素葡萄糖苷（aloe-emodinmonog1ucoside），mp239℃；大黄素葡萄糖苷（emodinmonoglucoside），浅黄色针状结晶，mp190℃～191℃；大黄酸葡萄糖苷（rhein8-monoglucoside）,mp266℃～267℃；大黄酚葡萄糖苷（chrysopHano1monog1ucoside），mp245℃～246℃等。三、基本原理大黄中羟基蒽醌类化合物多数以苷的形式存在，故先用稀硫酸溶液把蒽醌苷水解成苷元，利用游离蒽醌可溶于热氯仿的性质，用氯仿将它们提取出来。由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离它们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差别，用硅胶色谱分离。101 四、提取分离流程五、操作方法（一）总蒽醌苷元的提取大黄粗粉10g，加20％硫酸溶液100m1润湿，再加二氯甲烷100m1，回流提取1.5h，稍冷后过滤，残渣弃去，二氯甲烷提取液于分液漏斗中，分出酸水层，20ml二氯甲烷萃取两次，合并得二氯甲烷提取液。(二)蒽醌苷元的分离和精制1大黄酸的分离和精制将含有总蒽醌苷元的二氯甲烷液置于250m1分液漏斗中，加5%NaHCO3溶液30m1振摇（注意防止乳化，下同），静置至彻底分层，分出碱水层置烧杯中，在搅拌下滴加盐酸至pH3，待沉淀析出完全后，抽滤，滤纸上沉淀甲醇溶解，薄层色谱检测。2大黄素的分离和精制5%NaHCO3溶液萃取过的二氯甲烷层，再加5％碳酸钠溶液30ml振摇萃取，静置至彻底分层后，分出碱水层，在搅拌下用盐酸酸化至pH3101 ，析出棕黄色沉淀，抽滤，滤纸放入250ml烧瓶中二氯甲烷回流提取15min，取出滤纸，二氯甲烷洗涤取出的滤纸，洗涤液合并至回流二氯甲烷液中，减压回收至干，加少量洗脱剂（石油醚:乙酸乙酯-7:3）溶解，柱层析硅胶15g湿法装柱，洗脱剂溶解的样品湿法上样，洗脱剂（石油醚:乙酸乙酯-7:3）洗脱，按馏分收集得到大黄素，（薄层色谱检测）六、大黄蒽醌苷元的薄层色谱鉴别薄层板：硅胶G-CMCNa板。点样：提取的大黄酸、大黄素的氯仿溶液及各对照品氯仿溶液。展开剂：石油醚（30℃～60℃）-乙酸乙酯（7:3）显色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏或喷5％醋酸镁甲醇溶液，斑点显红色。观察记录：记录图谱并计算Rf值。七、思考题1．大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？2．pH梯度法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？实验3~4、补骨脂黄酮体的提取、分离及鉴定实验学时：12学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.掌握补骨脂黄酮体的提取分离原理及操作2.溶剂法提取、聚酰胺柱色谱分离3.熟悉黄酮类化合物在聚酰胺上的吸附规律与结构的相互关系二、补骨脂的主要化学成分本品为豆科植物补骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果实。具有温肾助阳，纳气，止泻中的作用。用于阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝冷痛，肾虚作喘，五更泄泻；外用治白癜风，斑秃。果实、种子含香豆素类、黄酮类、单萜酚类以及挥发油、皂式、多糖、类脂等成分。101 香豆素类有：补骨脂素（psoralen），异补骨脂素（isopsorasen）即是白芷素（angelicin），花椒毒素（xanthotoxin）即是8-甲氧基补骨脂素（8-methoxypsoralen），补骨脂定（psoralidin），异补骨脂定（isopso-ralidin），补骨脂呋喃香豆精（bakuchicin），补骨脂定2’，3’-环氧化物（psoralidin2’，3’-oxide），双羟异补骨脂定（corylidin），补骨脂香豆雌烷（bavacoumestan）A及B槐属香豆雌烷（sophoracoumestan）A等。黄酮类有：紫云英甙（astragalin）。双氧黄酮类中有：补骨脂双氢黄酮（bavachin）即是补骨脂甲素（corylifolin），异补骨脂双红黄酮（islbavachin），补骨脂双氢黄酮甲醚（bavachinin）等；查耳酮类中有：补骨脂乙素（corylifolinin）即是异补骨脂查耳酮（isobavachalcone），补骨脂查耳酮（bavachalcone），补骨脂色烯查耳酮（bavachromene），新补骨脂查耳酮（neobavachalcone），异新补骨脂查耳酮（isoneobavachalcone），补骨脂呋喃查耳酮（bakuchalcone），补骨脂色酚酮（bavachromanol）等；异黄酮类中有：补骨脂异黄酮（corylin），新补骨脂异黄酮（neobavaisoflavone），补骨脂异黄酮醛（corylinal），补骨脂异黄酮醇（psoralenol）。酚类有：补骨脂酚（bakuchiol）。还含苯并呋喃类衍生物：补骨脂苯并呋喃酚（corylifonol），异补骨脂苯并呋喃酚（isocorylifonol）。又含对羟基苯甲酸（p-hydroxy-benzoicacid），豆甾醇（stigmasterol），β-谷甾醇-D-葡萄糖甙（β-sitosterol-D-glucoside），三十烷（triacontane）等。另含类脂化合物，内有三甘油酯，二甘油酯，单甘油酯，蜡酯，碳氢化合物，极性类脂等；还含补骨脂多糖和一种相对分子质量为55000、含12个氨基酸的胰蛋白酶抑制剂（trypsininhibi-tor）；又含钾、锰、钙、铁、铜、锌、砷、锑、铷、锶、硒等元素。油中的脂肪酸，主要有棕榈酸（palmiticacid），油酸（oleicacid）和亚油酸（linoleicacid），还有硬脂酸（stearicacid），亚麻酸（linolenicacid）和二十四酸（lignocericacid）。补骨脂甲素(coryfolin)：分子量324.36。无色针状结晶，mp.191～192℃。补骨脂乙素(isobavachalcone)：分子量324.36。黄色片状结晶，mp.166～167℃。101 coryfolinisobavachalcone三、实验原理聚酰胺具有“双重色谱”性能之故，即其分子中既有非极性的脂肪链，又有极性的酰胺基团，当用极性移动相（如含水溶剂系统）洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱行为类似反相分配色谱，因黄酮苷比游离黄酮极性大，所以苷比游离黄酮容易洗脱。当用有机溶剂（如氯仿-甲醇）洗脱时，聚酰胺作为极性固定相，其色谱行为类似正相分配色谱，因游离黄酮的极性比黄酮苷小，所以游离黄酮比黄酮苷容易洗脱。四、提取分离流程五、操作方法补骨脂粗粉30g，加二氯甲烷100m1，回流提取1.5h，稍冷后过滤，残渣弃去，二氯甲烷提取液于分液漏斗中，加入等体积5%碳酸钠溶液萃取3次，不振摇，碱水层放入500ml烧杯中，加HCl调酸至pH4-5，至分液漏斗中用二氯甲烷等体积萃取2次，每次50ml，剧烈振摇，合并二氯甲烷并回收至干，得到补骨脂甲素、乙素粗品。少量50%甲醇溶解，上聚酰胺柱，50%甲醇为洗脱溶剂冲洗，按馏分收集，薄层检测，至洗脱液呈现淡黄色后，换80%甲醇洗脱，薄层色谱检测，其中补骨脂甲素富集在50%甲醇溶液中，补骨脂乙素富集在80%甲醇溶液中。101 聚酰胺前处理方法：聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱。再依次用2-2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。六、补骨脂甲素、乙素的薄层色谱、定性鉴别薄层板：聚酰胺板点样：补骨脂甲素、乙素对照品及样品点样。展开剂：75%乙醇显色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，喷5％三氯化铁溶液，观察斑点显色情况。观察记录：记录图谱并计算Rf值盐酸-镁粉反应：取1ml样品，加少许镁粉，加2滴浓HCl观察颜色变化。四氢硼钠反应：取1ml样品，加入等体积2%四氢硼钠/甲醇溶液，1分钟后加盐酸1滴，摇匀，观察颜色变化。七、思考题1.黄酮化合物定性鉴别反应原理？2.黄酮化合物在聚酰胺上洗脱顺序？实验5汉防己生物碱的提取、分离和鉴别实验学时：10学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1．掌握生物碱的一般提取方法。2．掌握从总生物碱中分离酚性叔胺碱、非酚性叔胺碱的方法。3．巩固柱层析、薄层层析、纸层析、萃取、重结晶等基本操作。二、汉防己的主要化学成分汉防己（粉防己）是防己科千金藤属植物石蟾蜍StephaniatetrandraS．moore的根，具有解热镇痛作用，中医用于祛风、止痛、利尿、消肿及治疗毒蛇咬伤等。其有效成分是生物碱，总碱含量约为2101 ％，主要有汉防己甲素、汉防己乙素及轮环藤酚碱。汉防己甲素具有镇痛、消炎、降压、肌松、抗菌、抗肿瘤、抗矽肺、抗结核、抗心律失常（拮抗剂）、抑制血小板凝集等作用。汉防己乙素具有镇痛、消炎、降压、抗肿瘤、抗血小板凝集等作用。轮环藤酚碱具有松弛横纹肌。阻断神经节、降压、抑制胃收缩等作用。汉防己中主要成分的物理性质1．汉防己甲素（粉防己碱，tetrandrine）：，无色针状结晶（丙酮），有双熔点现象，结晶在126℃～127℃时熔融，153℃时固化，温度上升至217℃～218℃时复又熔化。为＋297°（c=1.00，），与碘甲烷反应生成碘化二甲基汉防己甲素（汉肌松，）。汉防己甲素不溶于水、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和苯中，亦溶于稀酸水溶液中。（1gε）：282.5（3.88）2．汉防己乙素（防己诺林碱，fangchinoline）：，本品为细棒状结晶（丙酮），有双熔点现象，熔点为134℃～136℃和238℃～240℃：为＋275°（c=0.57，CHCl3）。与溴甲烷反应生成溴化二甲基汉防己乙素（汉松敏，）。本品溶解度与汉防己甲素相似，但极性稍大，故在冷苯中的溶解度小于汉防己甲素，具有隐性酚羟基，不溶于NaOH溶液中。（1gε）：282（3．99）。3．轮环藤酚碱（汉己素，cyc1anoline）：，氯化物为无色八面体结晶，mp214℃～216℃，其碘化物为无色丝状结晶，mpl85℃，为-120°（c=0．67，MeOH）。易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于低极性有机溶剂中。（1gε）：232(4.11),284(3.83)MeO汉防己甲素:R=CH3汉防己乙素:R=H101 MeO轮环藤酚碱三、基本原理根据大多数生物碱或生物碱盐均能溶于乙醇的通性，用乙醇回流提取法提取总碱；利用季铵型生物碱易溶于水，不溶于亲脂性有机溶剂的性质，用溶剂萃取法分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱。四、提取分离流程防己粗粉30g85％乙醇150ml回流1.5h，过滤，滤液回收至干无水硫酸钠脱水，过滤（过滤装置用丙酮淋洗），旋转蒸干，丙酮溶解浸膏80ml1%HCl分三次于50℃水浴搅拌溶解，过滤滤液有几层汉防己甲、乙素浓氨水调节pH值至9,环己烷-乙酸乙酯（25：75）共60ml，分三次萃取五、操作方法（一）提取称取汉防己粗粉30g，置于500ml圆底烧瓶中，加85％乙醇150ml回流1.5h，过滤，滤液回收溶剂得浸膏。（二）纯化将浸膏用80ml1%HCl分三次于50℃边水浴搅拌溶解，过滤，滤液用浓氨水调节pH值至9，再用环己烷-乙酸乙酯（25：75）共60ml101 ，分三次萃取，取上层溶液，无水硫酸钠脱水，过滤（过滤装置用丙酮淋洗），回收溶剂，再用丙酮溶解（三）鉴定薄层色谱检测：薄层板：硅胶G-CMC-Na板；展开剂：环己烷：乙酸乙酯：二乙胺（6：2：1），显色剂：碘化铋钾试剂，甲、乙素不能完全分开，呈金葫芦状。六、思考题1．举例说明叔胺型生物碱与季胺型生物碱的极性与碱性差异？2．从混合物中分离出水溶性生物碱与脂溶性生物碱的常用方法有哪些？中南民族大学药学院化学生物学与药学实验教学中心化生专业综合实验(2)—《药物分析实验》讲义赵丹王少兵林亲雄编写适用专业：药学专业药物制剂化学生物学专业101 2011年9月目录实验一阿司匹林肠溶片的鉴别和含量测定………………………41实验二异烟肼的杂质检查和异烟肼片的含量测定………………44实验三葡萄糖注射液的分析………………………………………46实验四复方磺胺甲噁唑片的含量测定……………………………48实验五高效液相色谱法测定天麻药材的天麻素含量……………51101 实验一：阿司匹林肠溶片的鉴别和含量测定实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.掌握水杨酸类药物的鉴别反应实验原理。2.掌握比色法检查阿司匹林片剂中游离水杨酸的实验原理。3.掌握两步滴定法测定阿司匹林片剂中药物含量的实验原理。二、实验原理1.鉴别：阿司匹林加热水解后导致游离水杨酸产生，水杨酸及其盐在中性或弱酸性条件下（pH值4.0-6.0），可以用三氯化铁溶液鉴别。2.杂质检查：游离水杨酸含有酚羟基，可与高铁盐反应显紫堇色，因此，将适量阿司匹林供试品溶液与一定量水杨酸对照品溶液生成的色泽对比，即可控制阿司匹林中游离水杨酸的含量（比色法）。101 3.含量测定：通过两步滴定法完成，由于阿司匹林中存在酸性的稳定剂，所以不能用氢氧化钠直接滴定，必须使用两步滴定法。首先用氢氧化钠滴定液中和制剂中其它的酸性物质和阿司匹林上游离的羧酸：然后在加入过量的氢氧化钠滴定液，加热水解，氢氧化钠中和水解所产生的醋酸，然后用硫酸回滴，测得中和醋酸所消耗的氢氧化钠的量。该消耗量和阿司匹林的摩尔比为1:1。三、实验方法1.鉴别取本品的细粉适量（约相当于阿司匹林0.1g），加水10ml，煮沸，放冷，加三氯化铁试液1滴，即显紫堇色。2.检查（游离水杨酸）取本品5片，研细，用乙醇30ml分次研磨，并移入100ml量瓶中，充分振摇，用水稀释至刻度，摇匀，立即滤过，精密量取滤液6ml，置50ml纳氏比色管中，用水稀释至50ml，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液3ml（硫酸铁铵溶液配置：取1mol/L盐酸溶液1ml，加硫酸铁铵指示液2ml后再加水适量使成100ml），摇匀，30秒钟内如显色，与对照液（精密量取0.01％水杨酸溶液4.5ml，加乙醇3ml，0.05％酒石酸溶液1ml，用水稀释至50ml，再加上述新制的稀硫酸铁铵溶液3ml，摇匀）比较，不得更深(1.5％)。3.含量测定101 取本品40片，研细，用中性乙醇70ml，分数次研磨，并移入100ml量瓶中，充分振摇，再用水适量洗涤研钵数次，洗液合并于100ml量瓶中，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液10ml（相当于阿司匹林0.3g），置锥形瓶中，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20ml，振摇，使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至溶液显粉红色，再精密加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）40ml，置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L)相当于18.02mgC9H8O4。四、计算片剂按标示量计算的百分含量定义是：上式中，V0和V分别为空白试验和样品试验时消耗硫酸滴定液的体积（ml），F为硫酸滴定液浓度（0.05mol/L）校正因数；T为氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的滴定度；W为供试品片粉的称取量（g），为平均片重（g），标示量为片剂“规格”项下的标示值（mg）。五、实验结果与讨论记录鉴别、检查和含量测定的结果，并对其讨论。六、思考题1）请写出阿司匹林肠溶片含量测定中含量的计算公式。2）含量测定中为什么要在水浴上加热。附录：滴定液的标定氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g,精密称定，加新沸过的冷水50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示液2滴,用本液滴定；在接近终点时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1ml氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。101 硫酸滴定液(0.05mol/L)：取在270～300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约0.25g，精密称定，加水50ml使溶解，加甲基红－溴甲酚绿混合指示液10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为紫红色时，煮沸2分钟,冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于5.30mg的无水碳酸钠。实验二：异烟肼的杂质检查和异烟肼片的含量测定实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.掌握薄层色谱检查杂质的实验原理和操作技能。2.掌握溴酸钾法测定异烟肼含量测定原理和操作方法。二、实验原理1.游离肼的检查异烟肼是一种不稳定的药物，可能会在制备时由原料引入游离肼，或在贮藏过程中降解产生游离肼，肼是一种诱变剂和致癌物质，因此应对其进行限量检查。本实验采用薄层色谱法检查，利用药物与杂质用异丙醇-丙酮（3:2）展开后，肼能与对二甲氨基苯甲醛反应生成腙显色，进行比较检查。2.片剂的含量测定异烟肼结构中的酰肼基团具有还原性，在强酸性介质中可与溴酸钾定量反应，反应式如下：101 三、实验方法1.异烟肼中游离肼杂质检查取本品，加水制成50mg/ml的异烟肼水溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中约含有0.20mg（相当于游离肼50μg）的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法，吸取供试品溶液10μl和对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-丙酮（3:2）为展开剂，展开，晾干，喷以乙醇制的对-二甲氨基苯甲醛试液，放置15分钟后检视。在供试品溶液主斑点前方与对照品溶液主斑点相应位置，不得显黄色斑点。2.异烟肼片的含量测定取异烟肼片20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于异烟肼0.2g），置于100ml容量瓶中，加水适量，振摇使异烟肼溶解并稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液25ml，加水50ml，稀盐酸20ml与甲基橙指示剂1滴，溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）缓缓滴定（温度保持在18~25℃）至粉红色消失，每1ml溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）相当于3.429mg的C6H7N3O。滴定结果用空白实验校正。中国药典（2010版）规定，本品含异烟肼（C6H7N3O）应为标示量的95.0-105.0%。四、计算异烟肼片剂的标示量百分含量计算公式为：上式中，F为浓度校正因数，本实验中指溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）的浓度校正因数；T为溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）对异烟肼的滴定度；V为供试品消耗滴定液的校正体积数；标示量为片剂“规格”项下的标示值。五、实验结果和讨论1）绘制薄层检查结果示意图，并进行讨论.2）计算标示量百分含量并进行讨论。附注：101 1.乙醇制的对-二甲氨基苯甲醛试液的配制：取对-二甲氨基苯甲醛1g，加乙醇9.0ml与盐酸2.3ml使之溶解，再加乙醇至100ml，即得。2.溴酸钾滴定液(0.01667mol/L)的配制：取溴酸钾2.8g，加水溶解成1000ml，摇匀。3.溴酸钾滴定液（约0.01667mol/L）的标定：精密量取本液25ml，置于碘瓶中，加入碘化钾2.0g与稀硫酸5ml，密塞，摇匀，暗处放置5分钟，加水100ml（18~25℃）然后用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，临近终点时加入淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白实验校正，根据硫代硫酸钠滴定液消耗的体积计算本液的实际浓度。实验三：葡萄糖注射液的分析实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.掌握注射液性状，杂质检查以及含量测定的方法。2.掌握剩余碘量法测定含量的方法。二、实验原理1.鉴别（Fehling反应）葡萄糖分子中的醛基可以将Fehling试剂（碱性酒石酸铜试液）还原，生成了氧化亚铜红色沉淀，用于葡萄糖的定性鉴别。101 2.含量测定（碘量法）碘在碱性溶液中可将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，剩余的碘液用硫代硫酸钠滴定液滴定。碘与NaOH作用可生成次碘酸钠(NaIO)，葡萄糖(C6H12O6)能定量地被次碘酸钠(NaIO)氧化成葡萄糖酸(C6H12O7)。在酸性条件下，未与葡萄糖作用的次碘酸钠可转变成碘(I2)析出，因此只要用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2，便可计算出C6H12O6的含量。其反应如下：⒈I2与NaOH作用：I2＋2NaOH=NaIO＋NaI＋H2O⒉C6H12O6和NaIO定量作用：C6H12O6＋NaIO=C6H12O7＋NaI⒊总反应式：I2＋C6H12O6＋2NaOH=C6H12O7＋2NaI＋H2O⒋C6H12O6作用完后，剩下未作用的NaIO在碱性条件下发生歧化反应：3NaIO=NaIO3＋2NaI⒌在酸性条件下：NaIO3＋5NaI＋3H2SO4=3I2＋3Na2SO4＋3H2O⒍析出过量的I2可用标准Na2S2O3溶液滴定：I2＋2Na2S2O3=Na2S4O6＋2NaI三、实验方法1.鉴别：取本品缓缓滴入温热的碱性酒石酸铜试液中，即生成氧化亚铜的红色沉淀。2.检查（1）pH值应为3.2~5.5。（2）5-羟甲基糠醛精密量取本品适量（约相当于葡萄糖1.0g），置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，在284nm的波长处测定，吸收度不得大于0.32。3.含量测定（剩余碘量法）精密量取本品适量0.5ml(约相当于葡萄糖50mg)，置碘瓶中，加蒸馏水10ml，精密加入碘滴定液（0.05mol/L）10ml，分四次加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液20ml，每次5ml，每次加入时密塞振摇约10s，加完后密塞，暗处放置10min，加稀硫酸2ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定至近终点（呈微黄色），加淀粉指示剂1ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1m1碘滴定液（0.05mol/L）相当于9.908mg的葡萄糖(C6H12O6.H2O)。中国药典（2010版）规定，本品为葡萄糖或无水葡萄糖的灭菌水溶液，含葡萄糖（C6H12O6.H2O）应为标示量的95.0~105.0%。101 四、实验结果与讨论记录各项实验结果，并针对实验结果和实验过程中的特殊现象进行讨论。0.5ml的10%葡萄糖注射液相当于50mg的葡萄糖（C6H12O6.H2O），应消耗碘滴定液（0.05mol/L）体积为：允许5％的误差，碘消耗体积应该为5.05ml±5%，即为4.80~5.30ml。五、思考题1）写出剩余碘量法的化学方程式。附注：1.硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）取硫代硫酸钠约26g与无水碳酸钠（Na2CO3）0.20g，加新沸过的冷水适量定容成1000ml，摇匀，放置１个月后滤过。2.硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）标定取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15g，精密称定，置碘量瓶中，加水50ml使溶解，加碘化钾2g，轻轻振摇使溶解，加稀硫酸40ml，摇匀，密塞，暗处放置10分钟，用水250ml稀释，用本液滴定至近终点时，加淀粉指示液3ml，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）相当于4.903mg的重铬酸钾，根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量算出本液的浓度，即得。实验四复方磺胺甲噁唑片的含量测定实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.掌握双波长分光光度法的基本原理。2.掌握利用双波长分光光度法测定药物含量的操作方法。二、实验原理101 双波长分光光度法（又称等吸光度双波长消去法）：是在两个不同波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度，以两波长处吸光度的差值（ΔA）作为定量依据来测定药物含量的方法。双波长的选定原则：一般选择待测组分的最大吸收波长作为测定波长（λ2），选择参比波长（λ1）使干扰组分在λ2和λ1处具有相等吸光度，从而采用ΔA计算消除干扰组分的影响。其示意图如下：假设样品在λ2和λ1处的吸光度分别为A2和A1，测定组分（以X表示）在λ2和λ1处的吸光度分别为和；干扰组分（以Y表示）在λ2和λ1处的吸光度分别为和：在相同测定条件下，ΔE为一常数，因此ΔA和浓度C有线性关系，因此可以用对照品比较法测定药物的含量。三、实验方法供试品溶液的制备：取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于磺胺甲噁唑50mg与甲氧苄啶10mg），置100ml量瓶中，加乙醇适量，振摇15分钟使磺胺甲噁唑与甲氧苄啶溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；对照品溶液A：精密称取干燥至恒重的磺胺甲噁唑50mg，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液A。101 对照品溶液B：精密称取干燥至恒重的甲氧苄啶10mg，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液B。磺胺甲噁唑的含量测定：1供试品及对照品A、B测定液的配制：精密量取供试品溶液和对照品溶液A、B各2ml，分别置于100ml量瓶中，加0.4%NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。同时配制空白参比溶液。2磺胺甲噁唑含量测定参比波长的确定(磺胺甲噁唑的含量测定波长为257nm)：1）基线描扫：设置描扫参数，描扫波长范围200~320nm；描扫波长间隔0.2nm；对空白参比溶液进行基线描扫，扣除溶剂系统的光吸收。2）对照品B(甲氧苄啶)测定液描扫：以上述设置的描扫参数对照品B测定液进行光吸收描扫，得到描扫曲线与各设定波长处的光吸收强度，在波长304nm附近找出与A257光吸收强度相同（相差小于5‰）的测定参比波长，即ΔA＝A测定－A参比＝0。3测定供试品、对照品A测定液在测定波长与参比波长处的光吸收强度：以上述设置的描扫参数对测定供试品、对照品A测定液进行描扫，得到两者在测定波长与参比波长处的光吸收强度。甲氧苄啶的含量测定：1供试品及对照品A、B测定液的配制：精密量取供试品溶液和对照品溶液A、B各5ml，分别置于100ml量瓶中，加HCl-KCl溶液稀释至刻度，摇匀。同时配制空白参比溶液。2甲氧苄啶含量测定参比波长的确定(甲氧苄啶的含量测定波长为239nm)：1）基线描扫：设置描扫参数，描扫波长范围200~320nm；描扫波长间隔0.2nm；对空白参比溶液进行基线描扫，扣除溶剂系统的光吸收。2）对照品A(磺胺甲噁唑)测定液描扫：以上述设置的描扫参数对照品B测定液进行光吸收描扫，得到描扫曲线与各设定波长处的光吸收强度，在波长295nm附近找出与A239光吸收强度相同（相差小于5‰）的测定参比波长，即ΔA＝A测定－A参比＝0。3测定供试品、对照品B测定液在测定波长与参比波长处的光吸收强度：101 以上述设置的描扫参数对测定供试品、对照品B测定液进行描扫，得到两者在测定波长与参比波长处的光吸收强度。四、计算采用测定ΔA值，利用对照品对照法来进行含量计算：；因为对照品和供试品配置的体积相等，所以；药物每片测定的标示含量为：五、实验结果与讨论1测定原始数据；2磺胺甲噁唑标示量百分数的计算；3甲氧苄啶标示量百分数的计算；4对测定结果的讨论与分析；附注：HCl-KCl溶液配制：13.0ml0.2mol/LHCl与25.0ml0.2mol/LKCl混合均匀后，加水稀释至100ml。实验五高效液相色谱法测定天麻药材的天麻素含量实验学时：6学时实验类型：设计性实验教学方式：集中授课，分小组设计实验一、实验目的1.了解高效液相色谱仪的基本结构、工作原理和操作方法。2.熟悉样品制备对高效液相色谱法测定物质含量的影响。3.掌握高效液相色谱测定天麻素含量的定量方法（外标法）。二、实验原理高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱。当试样随着流动相进入色谱柱中后，由于样品中的不同组分在色谱柱中的流动相101 和固定相间的分配系数不同，各组分在两相间经过反复多次的分配（吸附－脱附－放出），经过一定的柱长后，便彼此分离，先后从色谱柱上洗脱下来，离开色谱柱进入检测器，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。在确定的色谱条件下，特定物质成分在色谱柱上有固定的保留时间，即特定的出峰时间，并且在一定浓度范围内，特定物质成分的含量与其色谱峰面积成正比，通过测定特定物质成分与其标准品的色谱峰面积，便可计算出试样中特定物质成分的绝对含量。高效液相色谱法由于简便、准确、重现性好，在药典中广泛应用于药物含量测定。本实验通过设计不同的天麻素提取方法，获得天麻药材天麻素含量测定的样品，再用药典采用的HPLC法测定各样品的天麻素含量，考察样品制备方法对天麻药材中天麻素含测定的影响。三、学生设计实验方案的要点与要求实验设计不同提取溶剂与超声提取方法制备测试样品，考察溶剂与超声方法对天麻药材中天麻素含量测定的影响。实验过程中将学生分为不同的组别，每组采用不同的天麻素提取方法制备测定样品，再用中国药典的HPLC法进行麻素含量测定。使学生明确样品制备方法与条件对HPLC法测定药材或药物中特定成分含量的影响，引导学生通过优化条件达到更好的测定效果，培养学生的科学思维能力与探索精神。四、实验方法1.对照品溶液的制备：将天麻素标准品在真空干燥箱中80℃干燥1h，精密称取天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含50μg的溶液，即得。2.供试品溶液的制备：设计1：采用稀乙醇作为提取溶剂制备供试品溶液(2010版药典方法)：见附件。设计2：采用60%甲醇作为提取溶剂制备供试品溶液：制备方法同药典方法，仅提取溶剂不同。设计3：取本品粉末(过三号筛，50目)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml密封，在70℃温度条件下，分别用400w的功率超声提取30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干，添加乙腈—水(3:97)混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中。用乙腈—水(3:97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。101 设计4：取本品粉末(过三号筛，50目)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%的甲醇25ml密封，在70℃温度条件下，分别用400w的功率超声提取30min，放冷，再称定重量，用60%的甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干，添加乙腈—水(3:97)混合溶液溶解，转移至25ml量瓶中。用乙腈—水(3:97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。3.天麻样品天麻素含量的测定：2012年药典方法：见附件。五、实验结果与讨论1列出测定数据，计算本小组供试药材天麻素的含量；2附上其它设计组的供试药材天麻素含量测定结果，进行比较分析；3附本小组天麻素含量测定的HPLC图谱；六、思考题1.简述高效液相色谱使用的注意事项。2.影响高效液相色谱法对药材中特定成分含量测定的主要因素有哪些？附件：2010版中国药典天麻素含量测定方法：【含量测定】照《高效液相色谱法检验标准操作程序》测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—0.05％磷酸溶液(3：97)为流动相；检测波长为220nm。理论板数按天麻素峰计算应不低于5000。对天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含50μg天麻素的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛,50目)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50m1.称定重量，加热回流3小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干，渣加乙腈—水(3:97)混合溶液溶解，转移至25ml容量瓶中。用乙腈—水(3:97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液l0μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。101 本品按干燥品计算，含天麻素(C13H18O7)不得少于0.20％。稀乙醇：无水乙醇529ml加到1000毫升水中即得。20℃时浓度49.5-50.5%。中南民族大学药学院化学生物学与药学实验教学中心化生专业综合实验(2)—《药物化学实验》讲义杨光忠戴康王强编写适用专业：药学专业药物制剂化学生物学专业101 2011年2月目录实验室基本知识………………………………………………………56实验一苯妥英锌（Phenytoin-Zn）的合成………………………59实验二磺胺醋酰钠（SulfacetamideSodium）的合成…………61实验三苯佐卡因（Benzocaine）的合成…………………………63实验四香豆素—3—羧酸的合成……………………………………66选做实验相转移催化方法合成苦杏仁酸(MandelicAcid)……68附录：药物化学实验仪器简图………………………………………71101 101 实验室基本知识一、实验室安全药物化学和有机化学一样是一门实践性很强的学科，因此，在进入实验室工作之前，希望参加实验者必须对实验课程的内容，要有充分的准备，而且要通晓实验室的一些基本规则，遵守实验室安全操作须知，才能避免可能发生的一些危险情况。(一)眼睛安全防护在实验室中，眼睛是最容易受到伤害的。飞溅出的腐蚀性化学药品和化学试剂，进入眼睛会引起灼伤和烧伤；在操作过程中，溅出的碎玻璃片或某些固体颗粒，也会使眼睛受到伤害。为了安全起见，在某些实验中，需戴防护目镜。倘若有化学药品或酸、碱液溅入眼睛，应赶快用大量的水冲洗眼睛和脸部，并赶快到最近的医院进行治疗。若有固体颗粒或碎玻璃粒进入眼睛内，请切记不要揉眼睛，并赶快到最近的医院进行诊治。(二)预防火灾有机药物合成实验室中，由于经常使用挥发性的，易燃性的各种有机试剂或溶剂，最容易发生的危险就是火灾。因此在实验中应严格遵守实验室的各项规章制度，从而可以预防火灾的发生。在实验室内禁止吸烟。实验室中使用明火时应考虑周围的环境，如周围有人使用易燃易爆溶剂时，应禁用明火。一旦发生火灾，不要惊慌，须迅速切断电源、熄灭火源，并移开易燃物品，就近寻找灭火的器材，扑灭着火。如容器中少量溶剂起火，可用石棉网、湿抹布或玻璃盖住容器口，扑灭着火；其他着火，采用灭火器进行扑灭，并立即报告有关部门或打119火警电话报警。在实验中，万一衣服着火了，切勿奔跑，否则火借风势会越烧越烈，可就近找到灭火喷淋器或自来水龙头，用水冲淋使火熄灭。(三)割伤，烫伤和试剂灼伤处理1.割伤101 遇到割伤时，如无特定的要求，应用水充分清洗伤口，并取出伤口中碎玻璃或残留固体，用无菌的绷带或创口贴进行包扎、保护。大伤口应注意压紧伤口或主血管，进行止血，并急送医疗部门进行处理。2．烫伤因火焰或因触及灼热物体所致的小范围的轻度烫伤、烧伤，可通过立即将受伤部位浸入冷水或冰水中约5min以减轻疼痛。重度的大范围的烫伤或烧伤应立即去医疗部门进行救治。3．化学试剂灼伤对于不同的化学试剂灼伤，处理方法不一样。(1)酸立即用大量水冲洗，再用3％一5％碳酸氢钠溶液淋洗，最后水洗10—15min。严重者将灼伤部位拭干包扎好，到医院治疗。(2)碱立即用大量水冲洗，再用2％醋酸溶液25％醋酸溶液或1％硼酸溶液淋洗，以中和碱，最后再水洗10—15min。(3)有机物用酒精擦洗可以除去大部分有机物。然后再用肥皂和温水洗涤即可。如果皮肤被酸等有机物灼伤，将灼伤处浸在水中至少3h，然后请医生处置。二、化学药品使用中注意的事项易燃的有机溶剂(特别是低沸点易燃溶剂)在室温时有较大的蒸气压，当空气中混杂易燃有机溶剂的蒸气达到某一极限时，遇有明火会即发生燃烧爆炸。而且有机溶剂蒸气都较空气的密度大，会沿着桌面或地面飘移至较远处，或沉积在低洼处。因此，在实验室中用剩的火柴梗切勿乱丢，以免引起火灾。也不要将易燃溶剂倒入废物缸中，更不能用开口容器盛放易燃溶剂。三、废品的销毁碎玻璃和其他锐角的废物不要丢人废纸篓或类似的盛器中，应该使用专门的废物箱。不要把任何用剩的试剂倒回到试剂瓶中，因为其一会对试剂造成污染，影响其他人的实验；其二由于操作疏忽导致错误引入异物，有时会发生剧烈的化学反应甚至会引起爆炸。危险的废品，如会放出毒气或能够自燃的废品(活性镍、磷、碱金属等)101 ，决不能丢弃在废物箱或水槽中。不稳定的化学品和不溶于水或与水不混溶的溶液也禁止倒入下水道。应将它们分类集中后处理。对倒掉后能与水混溶，或能被水分解或腐蚀性液体，必须用大量的水冲洗。金属钾或钠的残渣应分批小量地加到大量的醇中予以分解(操作时须戴防护目镜)。四、实验的预习、记录和报告在实验前，对所做的实验应充分做好预习工作。预习工作包括反应的原理，可能发生的副反应、反应机制、实验操作的原理和方法，产物提纯的原理和方法，注意事项及实验中可能出现的危险及处置办法，应给出详细的报告。同时还要了解反应中化学试剂的化学计量学用量，对化学试剂和溶剂的理化常数等要记录在案，以便查询。做好实验记录和实验报告是每一个科研人员必备的基本素质。实验记录应记在专门的实验记录本上，实验记录应有连续的页码。所有观察到的现象、实验时间、原始数据、操作和后处理方法、步骤均应及时、准确、详细地记录在实验记录本上，并签名，以保证实验记录的完整性、连续性和原始性。常见实验报告的格式实验题目实验人：实验日期：天气：室温：一、实验目的二、反应原理（包括反应方程和可能发生的副反应）三、化学试剂产地（含生产公司名称）、规格及用量四、实验仪器及安装方法五、实验操作及实验现象（详细记录）六、收率计算七、结果讨论和实验心得八、思考题101 实验一苯妥英锌（Phenytoin-Zn）的合成实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.学习二苯羟乙酸重排反应机理。2.掌握用三氯化铁氧化的实验方法。二、实验原理苯妥英锌可作为抗癫痫药，用于治疗癫痫大发作，也可用于三叉神经痛。苯妥英锌化学名为5,5-二苯基乙内酰脲锌，化学结构式为：苯妥英锌为白色粉末，mp.222~227℃（分解），微溶于水，不溶于乙醇、氯仿、乙醚。合成路线如下：三、实验方法（一）联苯甲酰的制备在装有球形冷凝器的250mL圆底烧瓶中，依次加入FeCl3.6H2O101 14g，冰醋酸15mL，水6mL及沸石一粒，在石棉网上直火加热沸腾5min。稍冷，加入安息香2.5g及沸石一粒，加热回流50min。稍冷，加水50mL及沸石一粒，再加热至沸腾后，将反应液倾入250mL烧杯中，搅拌，放冷，析出黄色固体，抽滤。结晶用少量水洗，干燥，得粗品，测熔点，mp.88~90℃，计算收率。（二）苯妥英的制备在装有球形冷凝器的100mL圆底烧瓶中，依次加入联苯甲酰2g，尿素0.7g，20%氢氧化钠6mL，50%乙醇10mL及沸石一粒，直火加热，回流反应30min，然后加入沸水60mL，活性碳0.3g，煮沸脱色10min，放冷过滤。滤液用10%盐酸调pH6，析出结晶，抽滤。结晶用少量水洗，干燥，得粗品，计算收率。（三）苯妥英锌的制备将苯妥英0.5g置于50mL烧杯中，加入氨水（15mLNH3.H2O+10mLH2O），尽量使苯妥英溶解，如有不溶物抽滤除去。另取0.3gZnSO4.7H2O加3mL水溶解，然后加到苯妥英铵水溶液中，析出白色沉淀，抽滤，结晶用少量水洗，干燥，得苯妥英锌，称重，测分解点，计算收率。四、思考题1.试述二苯羟乙酸重排的反应机理。2.为何不利用第二步反应中已生成的苯妥英钠，直接同硫酸锌反应制备苯妥英锌，而是把已生成的苯妥英钠制成苯妥英后，再与氨水和硫酸锌作用制备苯妥英锌？附录1.制备联苯甲酰时，直火加热至中沸，通过测其熔点控制质量。2.苯妥英锌的分解点较高，测时应注意观察。101 实验二磺胺醋酰钠（SulfacetamideSodium）的合成实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.通过磺胺醋酰钠的合成，了解用控制pH、温度等反应条件和纯化产品的方法。2.加深对磺胺类药物一般理化性质的认识。二、实验原理磺胺醋酰钠用于治疗结膜炎、沙眼及其它眼部感染。磺胺醋酰钠化学名为N-[（4-氨基苯基）-磺酰基]-乙酰胺钠-水合物，化学结构式为：磺胺醋酰钠为白色结晶性粉末；无臭味，微苦。易溶于水，微溶于乙醇、丙酮。合成路线如下：三、实验方法（一）磺胺醋酰的制备在装有搅拌棒及温度计的100mL三颈瓶中，加入磺胺17.2g，22.5%氢氧化钠22mL，开动搅拌，于水浴上加热至50℃左右。待磺胺溶解后，分次加入醋酐13.6mL，77%氢氧化钠12.5mL（首先，加入醋酐3.6mL，77%氢氧化钠2.5mL101 ；随后，每次间隔5min，将剩余的77%氢氧化钠和醋酐分5次交替加入）。加料期间反应温度维持在50~55℃；加料完毕继续保持此温度反应30min。反应完毕，停止搅拌，将反应液倾入250mL烧杯中，加水20mL稀释，于冷水浴中用36%盐酸调至pH7，放置30min，并不时搅拌析出固体，抽滤除去。滤液用36%盐酸调至pH4~5，抽滤，得白色粉末。用3倍量（3mL/g）10%盐酸溶解得到的白色粉末，不时搅拌，尽量使单乙酰物成盐酸盐溶解，抽滤除不溶物。滤液加少量活性碳室温脱色10min，抽滤。滤液用40%氢氧化钠调至pH5，析出磺胺醋酰，抽滤，压干。干燥，测熔点（mp.179~184℃）。若产品不和格，可用热水（1:5）精制。（二）磺胺醋酰钠的制备将磺胺醋酰置于50mL烧杯中，于90℃热水浴上滴加计算量的20%氢氧化钠至固体恰好溶解，放冷，析出结晶，抽滤（用丙酮转移），压干，干燥，计算收率。四、思考题1.酰化液处理的过程中，pH7时析出的固体是什么？pH5时析出的固体是什么？10%盐酸中的不溶物是什么？2.反应碱性过强其结果磺胺较多，磺胺醋酰次之，双乙酰物较少；碱性过弱其结果双乙酰物较多，磺胺醋酰次之，磺胺较少，为什么？附录1.在反应过程中交替加料很重要，以使反应液始终保持一定的pH值（pH12~13）。2.将磺胺醋酰制成钠盐时，应严格控制20%NaOH溶液的用量，按计算量滴加。由计算可知需2.3gNaOH，即滴加20%NaOH11.5mL便可。因磺胺醋酰钠水溶性大，由磺胺醋酰制备其钠盐时若20%NaOH的量多于计算量，则损失很大。必要时可加少量丙酮，以使磺胺醋酰钠析出。101 3.按实验步骤严格控制每步反应的pH值，以利于除去杂质。实验三苯佐卡因（Benzocaine）的合成实验学时：12学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1.通过苯佐卡因的合成，了解药物合成的基本过程。2.掌握苯环上氧化、酯化和还原反应的原理及基本操作。二、实验原理苯佐卡因为局部麻醉药，外用为撒布剂，用于手术后创伤止痛，溃疡痛，一般性痒等。苯佐卡因化学名为对氨基苯甲酸乙酯，化学结构式为：101 苯佐卡因为白色结晶性粉末，味微苦而麻；mp.88~90℃；易溶于乙醇，极微溶于水。合成路线如下：三、实验方法（一）对硝基苯甲酸的制备（氧化）在装有搅拌棒和球型冷凝器的250mL三颈瓶中，加入重铬酸钠（含两个结晶水）23.6g，水50mL，开动搅拌，待重铬酸钠溶解后，加入对硝基甲苯8g，用滴液漏斗滴加32mL浓硫酸。滴加完毕，直火加热，保持反应液微沸60-90min（反应中，球型冷凝器中可能有白色针状的对硝基甲苯析出，可适当关小冷凝水，使其熔融）。冷却后，将反应液倾入80mL冷水中，抽滤。残渣用45mL水分三次洗涤。将滤渣转移到烧杯中，加入5%硫酸35mL，在沸水浴上加热10min，并不时搅拌，冷却后抽滤，滤渣溶于温热的5%氢氧化钠溶液70mL中，在50℃左右抽滤，滤液加入活性碳0.5g脱色（5~10min），趁热抽滤。冷却，在充分搅拌下，将滤液慢慢倒入15%硫酸50mL中，抽滤，洗涤，干燥得本品，计算收率。（二）对硝基苯甲酸乙酯的制备（酯化）在干燥的100mL圆底瓶中加入对硝基苯甲酸6g，无水乙醇24mL，逐渐加入浓硫酸2mL，振摇使混合均匀，装上附有氯化钙干燥管的球型冷凝器，油浴加热回流80min（油浴温度控制在100~120℃）；稍冷，将反应液倾入到100mL水中，抽滤；滤渣移至乳钵中，研细，加入5%碳酸钠溶液10mL（由0.5g碳酸钠和10mL101 水配成），研磨5min，测pH值（检查反应物是否呈碱性），抽滤，用少量水洗涤，干燥，计算收率。（三）对氨基苯甲酸乙酯的制备（还原）A法：在装有搅拌棒及球型冷凝器的250mL三颈瓶中，加入35mL水，2.5mL冰醋酸和已经处理过的铁粉8.6g，开动搅拌，加热至95~98℃反应5min，稍冷，加入对硝基苯甲酸乙酯6g和95%乙醇35mL，在激烈搅拌下，回流反应90min。稍冷，在搅拌下，分次加入温热的碳酸钠饱和溶液（由碳酸钠3g和水30mL配成），搅拌片刻，立即抽滤（布氏漏斗需预热），滤液冷却后析出结晶，抽滤，产品用稀乙醇洗涤，干燥得粗品。（采用）B法：在装有搅拌棒及球型冷凝器的100mL三颈瓶中，加入水25mL，氯化铵0.7g，铁粉4.3g，直火加热至微沸，活化5min。稍冷，慢慢加入对硝基苯甲酸乙酯5g，充分激烈搅拌，回流反应90min。待反应液冷至40℃左右，加入少量碳酸钠饱和溶液调至pH7~8，加入30mL氯仿，搅拌3~5min，抽滤；用10mL氯仿洗三颈瓶及滤渣，抽滤，合并滤液，倾入100mL分液漏斗中，静置分层，弃去水层，氯仿层用5%盐酸90mL分三次萃取，合并萃取液（氯仿回收），用40%氢氧化钠调至pH8，析出结晶，抽滤，得苯佐卡因粗品，计算收率。（四）精制将粗品置于装有球形冷凝器的100mL圆底瓶中，加入10~15倍（mL/g）50%乙醇，在水浴上加热溶解。稍冷，加活性碳脱色（活性碳用量视粗品颜色而定），加热回流20min，趁热抽滤（布氏漏斗、抽滤瓶应预热）。将滤液趁热转移至烧杯中，自然冷却，待结晶完全析出后，抽滤，用少量50%乙醇洗涤两次，压干，干燥，测熔点，计算收率。四、思考题1.氧化反应完毕，将对硝基苯甲酸从混合物中分离出来的原理是什么？2.酯化反应为什么需要无水操作？3.铁酸还原反应的机理是什么？附录1.氧化反应一步在用5%氢氧化钠处理滤渣时，温度应保持在50℃左右，若温度过低，对硝基苯甲酸钠会析出而被滤去。2.101 酯化反应须在无水条件下进行，如有水进入反应系统中，收率将降低。无水操作的要点是：原料干燥无水；所用仪器、量具干燥无水；反应期间避免水进入反应瓶。3.对硝基苯甲酸乙酯及少量未反应的对硝基苯甲酸均溶于乙醇，但均不溶于水。反应完毕，将反应液倾入水中，乙醇的浓度降低，对硝基苯甲酸乙酯及对硝基苯甲酸便会析出。这种分离产物的方法称为稀释法。4.还原反应中，因铁粉比重大，沉于瓶底，必须将其搅拌起来，才能使反应顺利进行，故充分激烈搅拌是铁酸还原反应的重要因素。A法中所用的铁粉需预处理，方法为：称取铁粉10g置于烧杯中，加入2%盐酸25mL，在石棉网上加热至微沸，抽滤，水洗至pH5~6，烘干，备用。实验四香豆素—3—羧酸的合成实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1．学习诺文葛耳(Knoevenagel)缩合反应；2．了解酯水解法制羧酸。3、了解天然产物结构修饰合成反应的特点二、实验原理水杨醛和丙二酸二乙酯在六氢吡啶存在下发生诺文葛耳缩合反应制得香豆素—3—羧酸酯，然后在碱性下水解成酸。101 三、实验方法（一）香豆素—3—羧酸酯的制备100ml圆底烧瓶中加入4.2ml(5g,0.041mol)水杨醛和6.8ml(0.045mol)丙二酸二乙酯和25mL无水乙醇和0.5ml六氢吡啶和10滴冰乙酸．装上带有无水氯化钙干燥管的冷凝管。在水浴上回流搅拌1．5h，稍冷后拿掉干燥管，从冷凝管顶端加入约30ml冷水，待结晶析出后抽滤并用4ml冰水浴冷却过的50％乙醇洗二次，粗产品可用25％乙醇重结晶，干燥后得产品约4-5g纯香豆素—3—羧酸乙酯的熔点为93℃。（二）．香豆索—3—羧酸的制备在10mL圆底烧瓶中加入4g香豆素—3—羧酸乙酯，3g氢氧化钾，20ml乙醇和10ml水，装上冷凝管加热回流约15min。得到皂化产物。趋热将皂化产物加入到100ml浓盐酸和50ml水混合物，立即有白色结晶析出．冰浴冷却后过滤，用少量冰水洗涤滤饼，抽干，干燥，租产品约2-3g。粗产品可用水重结晶。纯香豆素—3—羧酸熔点190℃(分解)。四、思考题1．试写出用水杨醛制备香豆素—3—羧酸的反应机理。2．按酸盐在酸化得羧醉沉淀析出的操作中应如何避免酸的损失，如何提高酸的纯度。附录1、实验中除加入有机碱六氢吡啶外，还加入少量冰乙酸。反应很可能是水杨醛与六氢吡啶在酸催化下形成亚胺基化合物，然后再与丙二酸二乙酯的碳负离子发生反应。2、用50％乙醇洗涤可减少酯在乙醇中的溶解。101 选做实验相转移催化方法合成苦杏仁酸(MandelicAcid)实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的1、掌握相转移催化剂的制备方法。2、掌握相转移催化反应的原理和方法。3、了解相转移催化反应在药物合成中的应用二、实验原理苦杏仁酸(MandelicAcid)属于第一代果酸，分子量为152.14，由于其化学结构式类似抗生素，对于大肠杆菌、链球菌、厌氧杆菌都有良好的抗菌效果，因此在早期苦杏仁酸主要被应用于治疗泌尿道感染的问题上。苦杏仁酸是目前唯一的亲脂性果酸，与皮肤的亲和力高，容易渗透角质层并深入皮肤发挥作用，不仅针对油性肤质和青春痘肤质能达到抗菌、改善阻塞等良好效果，对于日旋光性老化、尤其是黑色素沉着亦有明显之疗效。此外，其抗菌效果在国外亦被应用于美容雷射术后，以预防革兰氏阴性菌产生与色素沉淀等并发症。根据医学文献中的实验结果，以苦杏仁酸作为换肤材料可以有效解决青春痘的困扰，尤其是伴随产生的发炎性脓疱、丘疹等症状，通常在使用苦杏仁酸后都有明显的改善。同时，对于松弛、皱纹、日旋光性老化等皮肤问题，苦杏仁酸亦有不错的效果。值得注意的是，苦杏仁酸在面对一些黑色素问题，包括肤色不均、暗沉、黑斑、雀斑、发炎后色素沉淀等等，均有明显的疗效，这是其它果酸所无法达到的效果。在本实验中主要通过二氯苯乙酮的水解反应获得，其机理如下：101 TEBA为其中氯化苄基三乙铵，作为相转移催化剂，其催化机理如下：三、实验方法（一）TEBA的制备在装有搅拌器、回流冷凝管的三颈烧瓶中，加入5.5ml（6.4g，0.05mol）苄基氯，7ml（0.05mol）三乙胺和19ml的1，2－二氯乙烷，回流搅拌1.5h。将反应物冷却，析出结晶，抽滤，用少量二氯甲烷或无水乙醚洗涤，干燥后产量约10g。季铵盐易吸潮，干燥后产品应置于干燥器中保存。（二）苦杏仁酸的制备在250ml装有回流冷凝管，温度计和电动搅拌器的三口烧瓶中，加入13.6ml（0.134mol）的苯甲醛，1.4gTEBA和24ml氯仿。开动搅拌，待水浴温度上升至50-60度时，加入自冷凝管口滴加50％氢氧化钠溶液（26g氢氧化钠溶解于26ml101 水中），约45分钟到1小时滴加完成，然后，在剧烈搅拌下反应约一个小时，检查反应体系的pH值应为中性，如不为中性，则须延长反应时间，直至反应体系到达中性为止。反应液倒入280ml水中稀释，用乙醚30ml萃取两次，乙醚倒入回收瓶中，然后用50％的硫酸酸化至pH为1～2，用60ml的乙醚萃取两次，合并乙醚层，并用无水硫酸钠干燥，用减压蒸馏蒸干乙醚，可获得粗产物12-14g。粗产物用甲苯－无水乙醇（8：1）重结晶（每克粗产物加3ml溶剂），趁热抽滤，在室温下慢慢析出结晶，冷却后抽滤，并用少量石油醚洗涤以促使其干燥。产品为白色结晶，熔点为118～119℃。四、思考题1、为什么在第二步合成反应中需要剧烈搅拌。2、在苦杏仁酸的合成中，两步乙醚萃取的步骤各有什么作用？3、请你说出苦杏仁酸的反应过程中pH变化的趋势。附录1、TEBA的合成中，溶剂可能很快蒸干，留下的白色结晶就是。2、TEBA的合成中尽量避免接触水，合成完了以后放入干燥箱中保存。3、TEBA的合成中，结晶过程步骤很慢，要有耐心。4、苦杏仁酸的合成过程中，加入碱后，温度会上升，要注意控制温度。5、浓碱液腐蚀很强，要注意安全。101 附录：药物化学实验仪器简图101 101 101 中南民族大学药学院化学生物学与药学实验教学中心化生专业综合实验(2)—《药理学实验》讲义黄先菊编写适用专业：化学生物学专业2011年9月101 目录实验一常用动物基本操………………………………………………76实验二不同给药途径对药物作用的影响……………………………77实验三传出神经系统药物对麻醉家兔血压的影响…………………78实验四药物的镇痛作用………………………………………………81实验五药物对胃肠蠕动的影响………………………………………84实验六利尿药对小鼠的利尿作用……………………………………85101 实验一常用动物基本操实验学时：3学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的：学习大、小鼠捉拿、给药和取血方法。二、实验材料【器材】1ml和5ml注射器、灌胃针头，胃管、注射针头(4号、5号和6号)、天平、电子秤、磅秤、鼠固定筒、大鼠固定筒、家兔固定箱、兔开口器、75%酒精棉球、试管数根、剪刀、小镊子、止血钳、帆布手套、动脉夹、结扎线、硅胶管。【药品】生理盐水，20%碳素墨水或伊文氏兰，2%戊巴比妥钠。【动物】小鼠4只，体重18～22g，雌雄各半；大鼠1只，体重180～220g，雌雄各半；家兔1只，2～3kg，雌雄各半。三、实验方法1.捉拿方法2.标记方法3.性别鉴定4.不同途径给药方法：经口灌胃腹腔注射皮下注射肌肉注射小鼠尾静脉注射家兔耳缘静脉注射5.小鼠处死方法101 实验二不同给药途径对药物作用的影响实验学时：3学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的观察不同给药途径对药物作用的影响。二、实验材料【器材】1ml注射器，灌胃针头，天平。【药品】10%硫酸镁，0.5%戊巴比妥钠。【动物】小鼠5只三、实验方法1.硫酸镁不同给药途径对药物作用的影响取体重接近的小鼠2只，称重并标记，1号鼠腹腔注射10%硫酸镁溶液0.2ml/10g（2.0g/kg），2号鼠口服(灌胃)同样剂量的硫酸镁溶液。置于笼中，观察两鼠的表现，并记录结果。【结果】将所观察的实验结果填入下表：表2-1硫酸镁不同给药途径对药物作用的影响鼠号体重（g）药量（ml）给药途径给药前表现给药后表现122.戊巴比妥钠不同给药途径对药物作用的影响取体重接近的小白鼠3只，称重并标记，观察正常活动情况及翻正反射，然后用0.5%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g，分别从不同的途径(灌胃、皮下注射和腹腔注射)给药，观察三只小白鼠入睡时间及觉醒时间。四、结果将所观察的实验结果填入下表：101 表2-2戊巴比妥钠不同给药途径对小鼠睡眠的影响鼠号体重（g）药量（ml）给药途径给药时间入睡时间觉醒时间123五、思考题以硫酸镁和戊巴比妥钠为例，同一药物以不同给药途径给予对药物作用会产生哪些不同影响？实验三传出神经系统药物对麻醉家兔血压的影响实验学时：6学时实验类型：设计性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的与要求学习急性麻醉动物血压实验的装置和方法；观察传出神经系统药物对其血压的影响，加深对这类药物相互作用关系的理解；掌握血压的记录方法和传出神经系统药物对血压的作用。二、实验材料【器材】手术台，手术器械，多道生理记录仪，电脑系统，三通管压力换能器，输液滴定管，1ml、5ml注射器，测瞳尺，50ml烧杯，滤纸，磅秤。【药品】生理盐水，3％戊巴比妥溶液，肝素注射液，实验所需药物见方法部分。【动物】家兔2～3kg，雌雄不限。三、实验原理101 传出神经系统中的植物神经系统有以乙酰胆碱为递质的副交感神经系统和以去甲肾上腺素为递质的交感神经系统，它们相互作用，相互对抗，维持机体的生理机能平衡。药物影响副交感神经系统和交感神经系统的作用部位主要是递质和受体。通过相应受体的激动剂和拮抗剂对动物血压的影响，间接地定性分析不同组织、不同部位受体的类型和功能。四、实验方法（一）取家兔一只，称重，前肢皮下静脉注射3％戊巴比妥30mg/kg(即1ml)使之麻醉，背位固定于手术台上。（二）手术1．颈部剪去颈部的毛，正中切开颈部皮肤，分离气管，在气管上做一T型切口，插入气管插管，结扎固定。分离一侧颈总动脉，插入与压力换能器相连的动脉插管（内充满肝素溶液），打开动脉夹，将电脑系统调试好以后，记录正常血压。2、腹股沟在任一侧的腹股沟部位，用手触得股动脉搏动处，剪去毛，纵切皮肤3～4cm，分离出股静脉，结扎远心端，向近心端插入与输液相连的静脉插管，检查静脉插管是否畅通。（三）实验软件设置打开电脑，点击菜单“实验/药理学实验”，选择“药物对兔血压的作用”。（四）观察项目1．描记正常血压曲线，观察收缩压和舒张压的变化及血压的呼吸波。2．依次注射下述药物，每次给药后立即由输液管滴入生理盐水2ml，将药物冲入静脉，观察平均动脉压变化情况及脉压差的变化。待上述情况恢复正常或平稳后，再给下一药物。（1）观察拟肾上腺素药对血压的影响①盐酸肾上腺素10µg/kg（10-4溶液0.1ml）。②重酒石酸去甲肾上腺素10µg/kg（10-4溶液0.1ml）。③盐酸异丙肾上腺素50µg/kg（5×10-4溶液0.1ml）。（2）观察α受体阻断药对拟肾上腺素药作用的影响①盐酸酚妥拉明5mg/kg（2.5×10-2溶液0.2ml）。②重复（1）—①。③重复（1）—②。④重复（1）—③。101 （3）观察β受体阻断药对拟肾上腺素药作用的影响①普乃洛尔0.1mg/kg（2.5×10-3溶液0.1ml）。②重复（1）—①。③重复（1）—②。④重复（1）—③。复制血压曲线，标明血压值，所给药物的名称和剂量，分析各药的相互作用，解释给药前后出现的各种生理现象的变化，记录实验结果。（五）注意事项：颈部手术部位不宜靠近甲状腺部位，否则易出血，切勿损伤颈部迷走神经和交感神经。五、实验结果将实验结果填入下表。表3-1传出神经系统药物对麻醉家兔血压的影响药物（浓度）剂量血压（mmHg）用药前用药前肾上腺素10-410µg/kg（0.1ml）去甲肾上腺素10-410µg/kg（0.1ml）异丙肾上腺素5×10-420µg/kg（0.1ml）酚妥拉明2.5×10-220µg/kg（0.1ml）肾上腺素10-410µg/kg（0.1ml）去甲肾上腺素10-410µg/kg（0.1ml）异丙肾上腺素5×10-420µg/kg（0.1ml）普萘洛尔10-30.1mg/kg（0.1ml）肾上腺素10-410µg/kg（0.1ml）去甲肾上腺素10-410µg/kg（0.1ml）异丙肾上腺素5×10-420µg/kg（0.1ml）六、思考题1、试讨论肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素对心血管作用的异同点。2、酚妥拉明为何能够翻转肾上腺素的升压作用？101 实验四药物的镇痛作用实验学时：6学时实验类型：设计性实验教学方式：集中授课，分小组实验（一）化学刺激法（扭体法）一、目的与要求学习镇痛实验化学刺激法；观察阿司匹林、吗啡(或哌替啶)的镇痛作用。二、实验材料【器材】鼠笼，小动物电子秤(或天平)，注射器，秒表。【药品】0.1%盐酸吗啡或0.4%盐酸哌替啶，1%阿司匹林，0.6%冰醋酸(或1%酒石酸锑钾)，生理盐水。【动物】小鼠，体重18～22g。三、实验原理小鼠腹腔注射化学刺激剂(如酒石酸锑钠、醋酸溶液等)可诱导疼痛，动物表现出特征性的躯体伸缩行为称之为扭体反应(表现为腹部收缩内陷、躯干扭曲与后腿伸展及蠕行等)。镇痛药物可以抑制这种反应。将给药组与对照组相比，若使扭体反应发生率减少50%以上的，可认为有镇痛作用。四、实验方法取小鼠6只，称重，均分为3组，分别为吗啡组、阿司匹林组和生理盐水组。观察每组动物的正常活动情况，1组小鼠腹腔注射0.1%吗啡0.1ml/10g，2组腹腔注射1%阿司匹林0.1ml/10g，3组注射等容量的生理盐水。30min后，三组小鼠分别腹腔注射0.6%醋酸(或1%酒石酸锑钾)0.1ml/10g，观察20min内各组出现扭体反应动物数及其平均扭体次数。五、实验结果汇总各组实验结果，记于下表内，并依照下列公式计算药物镇痛百分率或抑制百分率。101 表4-1药物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响分组动物数(n)发生反应动物数(%)扭体次数(次)吗啡组阿司匹林组生理盐水组镇痛百分率＝×100%抑制百分率＝×100%【注意事项】1.酒石酸锑钾溶液或冰醋酸溶液应临时配制，放置过久，其作用明显减弱。2．致痛剂腹腔注射的部位和操作技术应力求一致。3.将给药组与对照组相比，若药物使小鼠扭体反应发生率减少50%以上的，才能认为其有镇痛作用。（二）热板法一、目的与要求学习镇痛实验热板法；观察阿司匹林、吗啡(或哌替啶)的镇痛作用。二、实验材料【器材】鼠笼，小动物电子秤(或天平)，小鼠热板测痛仪，注射器，秒表。【药品】0.1%盐酸吗啡或0.4%盐酸哌替啶，1%阿司匹林，0.6%冰醋酸(或1%酒石酸锑钾)，生理盐水。【动物】小鼠，雌性，体重18～22g。三、实验原理把小鼠放在事先加热至55℃±0.5℃的热板测痛仪的金属板上，以舔后足作为“疼痛”反应指标。观察给药前、后痛阈值的变化。四、实验方法把小鼠放在事先加热至55℃±0.5℃的热板测痛仪的金属板上，热板作为热刺激，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间（S）作为该鼠的101 痛阈值。给药前先测定每只小鼠的痛阈值（共测定两次，以平均值不超过30s者为合格）。取合格小鼠6只，称重，均分为3组，分别为吗啡组、阿司匹林组和生理盐水组。1组小鼠腹腔注射0.1%吗啡0.1ml/10g，2组腹腔注射1%阿司匹林0.1ml/10g，3组注射等容量的生理盐水。30min后，三组小鼠分别腹腔注射0.6%醋酸(或1%酒石酸锑钾)0.1ml/10g，给药后，每隔1/2～1h测定一次痛阈值，连续数次，如痛阈值超过60s，即停止测试而按60s计。五、实验结果汇总各组实验结果，记于下表内，按所测之痛阈平均值并依照下列公式计算药物对小鼠的痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝×100%以时间为横坐标，痛阈提高百分率为纵坐标，绘出镇痛作用时程曲线，以分析药物的作用强度，开始作用时间和持续时间。表4-2药物对小鼠痛阈值的影响分组动物数(n)平均痛阈值(s)痛阈提高百分率(%)用药前用药后吗啡组阿司匹林组生理盐水组【注意事项】1.动物体重对结果有影响，小鼠体重以18～22g为宜。2．小鼠个体差异大，应挑选痛阈值在5～30s以内者为合格，不到5s或超过30s或喜跳跃者均剔除。3.小鼠以雌性为好，雄性因为阴囊受热后易松弛，与热板接触而致反应过敏。4．室温对实验有影响，过低小鼠反应迟钝，过高则敏感，易引起跳跃。13～18℃范围内，小鼠反应波动较小。六、思考题1.阐述吗啡镇痛作用的机制及其用途。2.比较阿司匹林与吗啡在镇痛作用上的异同点？101 实验五药物对胃肠蠕动的影响实验学时：3学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的观察各种药物对胃肠道运动的影响，分析药物的作用机理。二、实验材料【器材】手术剪，镊子，天平，小鼠灌胃器，注射器、秒表，皮尺。【药品】10%硫酸镁溶液，5%碳末混悬液（5%活性碳末+10%阿拉伯胶+水），硫酸新斯的明，多潘立酮。【动物】小鼠4只（实验前禁食6~8h），体重18~22g。三、实验原理胃肠蠕动的意义在于将食糜向前推动，不同药物作用部位不同，作用机理也不同。利用碳末作为指示剂，观察碳末在肠道的推进距离，以此反映肠蠕动情况。四、实验方法取小鼠4只，称重并标记，分为四组：对照组、多潘立酮组、硫酸镁组、新斯的明组。对照组灌胃自来水，多潘立酮组灌胃给予0.1mg/ml的多潘立酮，硫酸镁组灌胃给与硫酸镁，新斯的明组皮下注射给与0.12mg/ml的硫酸新斯的明0.1ml/10g，30min后，每鼠灌胃给与碳末混悬液0.2ml，20min后，脱颈椎处死，立即剖开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠端，轻轻将其拉直，测量碳末末端至幽门距离及幽门至小肠回盲端距离，求出二者比值。五、结果整理将实验结果填入下表表5-1药物对胃肠蠕动的影响观察项目对照组多潘立酮组硫酸镁组新斯的明组体重（g）药量（ml）幽门至碳末距（cm）小肠总长度（cm）碳末推进率（%）101 碳末推进率（%）=【注意事项】1.实验操作时间要尽量一致，以免时间不同造成实验误差。2.分离肠系膜及测量时应细心，以免影响肠内容物的观察。六、思考题根据实验现象，分析并说明硫酸镁、多潘立酮和新斯的明对胃肠蠕动的影响及作用机制。实验六利尿药对小鼠的利尿作用实验学时：3学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、目的观察利尿药对小鼠的利尿作用；比较几种利尿药的利尿强度及特点有何不同。二、实验材料【器材】2ml注射器，玻璃漏斗，表面皿，50ml量筒。【药品】生理盐水，呋塞米（速尿）20mg/2ml，氢氯噻嗪20mg/2ml。【动物】小鼠18-22g。三、实验方法1、取18-22g小鼠3只，标记，称重，分别灌胃注射生理盐水、20mg/2ml呋塞米（速尿）及20mg/2ml氢氯噻嗪各0.5ml。2、10-15min后，每只小鼠腹腔注射生理盐水0.2ml/10g。置于玻璃漏斗中收集尿液。每5min记录一次尿量。四、实验结果将实验结果填入下表。101 表6-1利尿药物的利尿作用组别给药后尿量（ml）5min10min15min20min25min30min正常组呋塞米氢氯噻嗪【注意事项】1.小鼠好动，易从漏斗爬出，需加盖预防并全程监控。2.部分小鼠尿液粘在身体上，造成损耗，可能会影响到实验结果。五、思考题1.呋塞米及氢氯噻嗪的利尿作用有何不同？2.利尿药常见的不良反应有哪些？101 中南民族大学药学院化学生物学与药学实验教学中心化生专业综合实验(3)—《化学生物学实验》讲义徐婧帅丽程寒赵丹编写适用专业：化学生物学专业2012年2月101 目录实验一生物素—半乳糖（BG）偶联物的合成………………………90实验二酪氨酸酶的提取及其催化活性研究…………………………93实验三食品中维生素C和维生素E的测定…………………………95实验四绿色植物色素的提取及色谱分离……………………………97实验五尼龙固定化木瓜蛋白酶………………………………………99101 实验一生物素—半乳糖（BG）偶联物的合成实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的了解生物素与D-半乳糖偶联的机理；掌握糖类的生物素化技术；掌握葡聚糖凝胶法分离技术。二、实验原理生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。生物素与亲和素间存在着高度专一性的结合反应。且两者的结合具有极高的亲和力，而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。生物素容易与各种蛋白质(包括抗体、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、荧光素、胶体金等结合，形成的生物素偶联物。这不仅保持了生物分子原有活性，而且利用生物素与亲和素间稳定、特异性的反应，进行免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究。生物素偶联物的合成，是生物素－亲和素体系实际应用中的基础和关键环节。本实验以生物素与D－半乳糖的偶联为例，介绍生物素偶联的一般方法及纯化技术。生物素的分子式为C10H16O3N2S，分子量为244.31，结构如图1所示。生物素分子有两个环状结构，其中上环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；下环为噻吩环，环上有一戊酸侧链。半乳糖(CH2OH(CHOH)4CHO)是单糖的一种，由六个碳和一个醛组成的单糖，归类为醛糖和己糖，可在奶类产品或甜菜中找到。它常以D-半乳糖苷的形式存在于大脑和神经组织中，也是某些糖蛋白的重要成分。D-半乳糖的结构如图2所示。生物素需预先活化，生成生物素衍生物后，才能用于生物分子的偶联。常用的生物素衍生物有生物素N—羟基丁二酰亚胺酯和生物素酰肼。本实验是利用生物素酰肼(BHZ)中的氨基与D－半乳糖的醛基结合，形成稳定的生物素—半乳糖偶联物。由于在偶联反应中，原料可能未反应完全，且体系中加入了一些盐类化合物。反应混合物，需用葡聚糖凝胶层析法进行分离，以得到纯化的生物素—半乳糖结合物。101 图1：生物素的结构图图2：D-半乳糖的结构图葡聚糖凝胶是由天然高分子—葡聚糖与其他交联剂交联而成的凝胶，它是具有多孔性三度空间网状结构的高分子分离材料。葡聚糖凝胶SephadexG-10为白色珠状颗粒，它是由葡聚糖与3－氯－1，2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成的。G1－10是表示G类凝胶吸水量的型号，可将G后的数字除以10即为该凝胶每克干重所吸水分的毫升数。SephadexG-10稳定工作的pH值一般为2－10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免SephadexG-10与强酸和氧化剂接触。SephadexG-10在高温下稳定，可以煮沸消毒。SephadexG-10常用来脱盐、及分离纯化分子量小于700的多肽,球蛋白及多糖。本实验用SephadexG-10使生物素—半乳糖结合物与未反应的半乳糖和生物素分离。三、实验试剂与仪器D-半乳糖、高碘酸钠、亚硫酸钠、生物素酰肼、葡聚糖凝胶（SephadexG-10）、冰、缓冲液A：含0.15mol/LNaCl的磷酸盐缓冲溶液（PBS），pH7.4、含0.15mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.4：0.01mol/L（1.36g/L）KH2PO419.7mL；0.01mol/L（1.78g/L）Na2HPO4·2H2O80.3mL；0.15mol/L（8.776g/L）NaCl、加热套、天平、摇床、葡聚糖凝胶柱、大烧杯（100mL）、小烧杯（50mL）、小PE管（2mL）、大PE管（10mL）、玻璃棒。四、实验步骤（1）将D-半乳糖（0.28mmol，10.0mg）溶于缓冲溶液A（1.8mL），加入高碘酸钠（0.10mmol，4.3mg），0℃避光放置30min使其氧化。（2）加亚硫酸钠（0.20mmol，5.7mg），混匀后室温下放置5min终止反应。（3）向氧化后的半乳糖中加入生物素酰肼溶液（0.16mmol，8.0mg，溶于3.2mL缓冲液A），摇匀后室温下振荡温育2h。101 （4）反应混合物上葡聚糖凝胶SephadexG-10柱，用缓冲液A洗脱，使生物素半乳糖结合物与未反应的半乳糖和生物素分离。五、思考题（1）简要写出生物素—半乳糖偶联物合成的实验原理和涉及的主要化学反应？（2）葡聚糖凝胶层析法的工作原理是什么及其主要应用有哪些？（3）使用葡聚糖凝胶法分离纯化生物素—半乳糖偶联物时，有哪些注意事项？附：葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1)预处理：称取葡聚糖凝胶SephadexG-10约7g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。(2)装柱：凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时打开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须倒出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。(3)加样：加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加入样品，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。(4)洗脱与收集：洗脱时，用缓冲溶液作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集。(5)凝胶的再生和回收：凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。葡聚糖凝胶在强酸中糖苷分解。在湿空气中易长霉。可用氯仿、甲苯、叠氮钠等作防腐剂。101 实验二酪氨酸酶的提取及其催化活性研究实验学时：6学时实验类型：综合性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的了解生物体系中在酶存在下的生物化学过程的特殊性掌握生物活性物质的提取和保存方法掌握利用仪器分析研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。二、实验原理在实验室里，复杂的有机物合成与分解往往要求在高温、强酸、强碱、减压等剧烈条件下才能进行。而在生物体内，虽然条件温和（常温、常压和接近中性的溶液等），许多复杂的化学反应却进行的十分顺利和迅速，而且基本没有副产物，其根本原因就是由于生物催化剂-酶的存在。酶是具有催化作用的蛋白质。按照酶的组成，可将其分为两类：（1）简单蛋白质-其活性仅决定于它的蛋白质结构。如脲酶、淀粉酶等；（2）结合蛋白质-这种酶需要加入非蛋白质组分（称之为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶就是以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶。辅助因子虽然本身无催化作用，但参与氧化还原或起运载酰基载体的作用。若将全酶中的辅助因子除去，则酶的活性就失去了。通常把被酶作用的物质称为该酶的底物。一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起了广大分析工作者的兴趣。目前，酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是在生化、医学方面。例如一些生命物质和液体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。本实验拟通过从土豆中提取酪氨酸酶并测定其活性，使同学们对酶有个初步的了解。我们都见过，当土豆、苹果、香蕉、蘑菇受损伤时显棕色的现象，这是由于土豆、苹果等含有酪氨酸和酪氨酸酶。酶存于物质内部，当内部物质暴露出来后，在空气中的氧参与下，发生了如下所示的一系列反应，生成黑色素。101 酪氨酸酶可用比色法测定。由于多巴转变成多巴红速率很快，再转到下一步产物速率慢得多，故可在酶存在下，测定多巴转变为多巴红的速率而测定酶的活性。（可用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性）。酶的活性计算：一般定义在优化条件下（pH值、离子强度等），25℃时在1min内转化1μmol底物所需要的量为酶的活性单位。通过下式可计算出所用的酶的活性：。式中：为所用溶液的酶的活性，△A为最大吸收处吸光度的变化，t为时间，为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入的酶体积。进而计算出所用原料中的酶的活性：A=式中：A为原料中酶的活性，Vo为原料所得的酶溶液的总体积，为原料总质量。三、实验试剂与仪器0.10mol•L-1磷酸缓冲溶液（pH=7.2）、0.10mol•L-1磷酸缓冲溶液（pH=6.0）、0.010mol•L-1多巴溶液、土豆、盐酸、分光光度计，离心机，水浴，秒表。四、实验步骤（1）酶的提取在研钵中放入10g切碎了的土豆，加入7.5mLpH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压。用两层纱布滤出提取液，立即离心分离（约3000rpm,5min）。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。（2）多巴红溶液的吸收光谱取0.4mL已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲液。加2mL多巴溶液，摇匀。反应约10min后，使用1cm比色池于扫描分光光度计上进行重复扫描，即可获得多巴红的吸收光谱。若使用自动扫描分光光度计，可从混合开始以时间间隔为1min进行连续扫描，可以观察到吸光度随时间增加的现象。（3）酶的活性测量101 取2.5mL上述提取液用pH=7.2的缓冲液稀释至10mL比色管中，摇匀。取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入2.9mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入2mL多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读1个数，以后隔2min读1个数，直至吸光度变化不大为止。取0.2mL，0.3mL，0.4mL已稀释过的提取液重复上述实验，（注意总体积为5mL，每次换溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次。）以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。（4）实验结果与数据处理①不同酶加入量的动力学曲线以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下，多巴的转换动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即为酶的活性。依次得出不同提取液的活性，比较不同体积的提取液加入后相同量的多巴转换速率。②酶的活性计算将不同体积提取液的实验结果绘制表格，计算出原料中酶的活性。③影响酶的活性的因素研究取0.40mL稀释过的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。取0.40mL稀释过的提取液，加少量固体Na2S2O3配成测定溶液观察现象。取0.40mL稀释过的提取液，加少量固体Na2EDTA振动混合，反应一段时间后，配成测定溶液观察现象。五、思考题（1）酶的活性受何种条件影响？（2）提取物在放置过程中为何会变黑？（3）经热处理后酶的活性为何显著降低？掌握薄层色谱检查杂质的实验原理和操作技能。实验三食品中维生素C和维生素E的测定实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验101 一、实验目的掌握碘标准溶液的配制及标定了解直接碘量法测定Vc的原理及操作过程学习在紫外光谱区同时测定维生素C和维生素E含量的方法。二、实验原理抗坏血酸又称维生素C(Vc)，分子式为C6H8O6，由于分子中的烯二醇基具有还原性，能被I2氧化成二酮基，维生素C的半反应式为：1mol维生素C与1molI2定量反应，该反应可以用于测定药片、注射液及果蔬中的Vc含量。由于维生素C的还原性很强，在空气中极易被氧化，尤其是在碱性介质中，测定时加HAc使溶液呈弱酸性，减少维生素C的副反应。维生素C的测定在医药和化学上应用非常广泛。在分析化学中常用在光度法和络合滴定法中作为还原剂，如使Fe3+还原为Fe2+，Cu2+还原为Cu+，Se3+还原为Se等。测定体系的组成常用分光光度法，对一化学反应平衡体系，分光光度计测得的吸光度包括各物质的贡献，根据郎伯-比尔定律，用紫外分光光度法同时测定维生素C和维生素E含量时，系统在最大吸收l1，l2处的总吸光度分别为：A1，A2分别为Vc和VE在最大吸收波长处所测得的总吸光度。分别为在波长l1，l2下的摩尔吸光系数，它们可由作图法求得。即配制Vc溶液，在波长l1下分别测定各溶液的吸光度，对A1~cVc作图，得一直线，由直线斜率可求得，其余各摩尔吸光系数的求法类同。抗坏血酸是水溶性的，α-生育酚是脂溶性的，但它们都能溶于无水乙醇，因此，能用在同一溶液中测定双组分的原理来测定它们。三、实验试剂及仪器I2溶液、I2标准溶液(0.020mol•L-1)、As2O3基准物质、Na2S2O3标准溶液(0.01101 mol•L-1)、淀粉溶液(0.5%)、HAc(2mol•L-1)、NaHCO3(s)、NaOH(6mol•L-1)、取水果可食部分捣碎为果浆，抗坏血酸(7.5010-5mol·L-1)、α-生育酚(1.1310-4mol·L-1)、无水乙醇、紫外—可见分光光度计、四、实验步骤(1)配制标准溶液：分别取抗坏血酸贮备液4.00、6.00、8.00、10.00mL于4只50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。分别取α-生育酚贮备液4.00、6.00、8.00、10.00mL于4只50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。（2）绘制吸收光谱：以无水乙醇为参比，在320～220nm范围测绘出抗坏血酸和α-生育酚的吸收光谱，并确定λ1和λ2。（3）绘制标准曲线：以无水乙醇为参比，在波长λ1和λ2分别测定步骤1配制的8个标准溶液的吸光度。（4）食品中维生素C和维生素E的测定：准确称取10～20g的样品量(固体样品用剪刀切细或用研钵研成粉碎)，加50％的偏磷酸溶液溶解(必要时过滤)，定容至200mL，取未知液5.00mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。在λ1和λ2处分别测其吸光度。（5）数据处理：绘制抗坏血酸和α-生育酚的吸收光谱，确定λ1和λ2。分别绘制抗坏血酸和α-生育酚在λ1和λ2时的4条标准曲线，求出4条直线的斜率，即,。计算食品未知液中抗坏血酸和α-生育酚的浓度。五、思考题（1）写出抗坏血酸和α-生育酚的结构式，并解释一个是“水溶性”，一个是“脂溶性”的原因。（2）使用本方法测定抗坏血酸和α-生育酚是否灵敏?解释其原因。实验四绿色植物色素的提取及色谱分离实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验101 一、实验目的掌握色谱柱分离和提纯天然产物的原理掌握层分析和柱层析两种分离、鉴定技术。二、实验原理绿色植物的茎、叶中含有胡萝卜素、叶黄素和叶绿素等色素。植物色素中的胡萝卜素C40H56有三种异构体，即α-、β-和γ-胡萝卜素。其中β-体含量较多，也最重要。β-体具有维生素A的生理活性，其结构是两分子的维生素A在链端失去两分子水结合而成的，在生物体内β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-体亦可工业生产，可作为维生素A使用，同时也作为食品工业中的色素。它们的结构如下：叶黄素C40H56O2最早是从蛋黄中析离。叶绿素有两个异构体：叶绿素a：C55H72MgN4O5；叶绿素b：C55H70MgN4O6。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物光合作用所必需的催化剂。三、实验试剂及器材绿色植物叶，95％乙醇，石油醚(60～90℃)，丙酮，正丁醇，苯，硅胶G，中性氧化铝，1％羧甲基纤维素钠水溶液，CH2Cl2四、实验步骤(1)色素的萃取：取5.0g新鲜的绿色植物叶子于研钵中捣烂，用30mL2：1的石油醚-乙醇分几次浸取。把浸取液过滤，滤液转移到分液漏斗中，加等体积的水洗一次。洗涤时要轻轻振荡，以防乳化。弃去下层的水-乙醇层，石油醚层再用等体积的水洗二次，以除去乙醇和其他水溶性物质；有机相用无水硫酸钠干燥后转移到另一锥形瓶中保存。取一半做柱层析分离，其余留作薄层分析。(2)柱层析分离：用25mL酸式滴定管，20g中性氧化铝装柱。先用9：1的石油醚—丙酮洗脱，当第一个橙黄色色带流出时，换一接收瓶接收，它是胡萝卜素，约用洗脱剂50mL(若流速慢，可用水泵稍减压)。换用7：3的石油醚—101 丙酮洗脱，当第二个棕黄色色带流出时，换一接收瓶接收，它是叶黄素，约用洗脱剂200mL。再换用2：1：1的正丁醇—乙醇—水洗脱，分别接收叶绿素a(绿色)和叶绿素b(黄绿色)，约用洗脱剂30mL。(3)TLC分析：在10cm~4cm的硅胶板上，用分离后的胡萝卜素点样，7：3的石油醚—丙酮展开，可出现1～3个黄色斑点。用分离后的叶黄素点样，7：3的石油醚-丙酮展开，一般可呈现1~4个点。取4块板，一边点色素提取液样点，另一边分别点柱层分离后的4个试液，用8：2的苯—丙酮展开，或用石油醚展开，观察斑点的位置，并依Rf由大到小的次序将胡萝卜素、叶绿素和叶黄素排列出来。注意事项(1)植物叶的萃取处理要充分，否则影响实验结果。(2)色谱柱要装紧，不要断层。五、思考题(1)在色谱柱洗脱过程中，色带不整齐而成斜带，对分离效果有何影响？应如何避免？(2)色谱柱中有气泡会对色谱分离有何影响，怎样除去气泡？实验五尼龙固定化木瓜蛋白酶实验学时：6学时实验类型：验证性实验教学方式：集中授课，分小组实验一、实验目的学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。二、实验原理通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。固定化酶的特性主要表现在：①101 稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。三、实验试剂及仪器18.6%CaCl2溶液、甲醇溶液、3.65mol/LHCl溶液、0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)、5%戊二醛溶液、0.1mol/L硼酸缓冲液(pH值7.8)、1mg/mL木瓜蛋白酶溶液、0.1mol/L磷酸缓冲液(含3%NaCl)(pH值7.2)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)、激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，内含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液、1%酪蛋白溶液、10%三氯乙酸(TCA)溶液、尼龙布(86或66)、吸水纸、恒温水浴锅四、实验步骤1、固定化酶的制备(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入10mL混合液（取1.86mL18.6%CaCl2溶液加入8.14mL甲醇溶液中，注意要现配现用），在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。(2)尼龙布用3.65mol/LHCl溶液在室温下水解45min，用蒸馏水冲洗三次至pH中性。(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。(4)取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.5～1mg/mL)在4℃下固定3.5h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL)。(5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用0.5mol/LNaCl溶液(用0.1mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。2、酶活力测定(1)溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入2.3mL激活剂，于37℃下预热10min，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5mL终止酶反应。对照管先加入10%101 三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定吸光度。在上述条件下，每10min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)(以下同)。(2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。注意事项(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。五、思考题为做好本实验应注意哪些关键环节？为什么？101