新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的

　　新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的陈钟，陈瑞新，丁义涛，田鹏鹏，周卉【摘要】目的：探讨猪肝细胞为基础的新型生物人工肝（BAL）系统体外灌流后及治疗急性肝衰竭（ALF）犬后猪内源性逆转录病毒（PERV）的传播。方法：构建新型BAL，应用BAL进行体外灌流6h。采用门腔分流及胆总管结扎切断术建立犬ALF模型，应用BAL治疗ALF犬6h。采用PCR检测灌流前猪细胞中PERV原病毒DNA和猪mtDNA，采用RT-PCR检测灌流前后中空纤维管内腔循环液和治疗前后犬血清PERVRNA。结果：猪细胞可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA，灌流前后中空纤维管内腔循环液和犬血清PERVRNA均为阴性。结论：猪肝细胞为基础的新型BAL体外灌流和用于ALF犬治疗6h后未发现PERV传播。【关键词】肝功能衰竭；生物人工肝系统；猪内源性逆转录病毒；逆转录-聚合酶链反应[Abstract]Objective:Tostudythetransmissionofporcineendogenousretrovirusafterperfusioninvitroandtreatmentforacuteliverfailurecaninesusingbioartificialliversystembasedonporcinehepatocytes.Methods：Thenovelbioartificialliversystem(BAL)for6h.ALFonbileductligationandtransection.BALofcaninespre-circulationtopost-circulation.Results：Theresultsshoentof6hforALFcaninesusingthenovelBALsystembasedonporcinehepatocyte.[Keyent;Bioartificialliversystem;Porcineendogenousretrovirus;Reveretranscriptasepolymerasechainreaction近年来生物人工肝（Bioartificalliver,BAL）成为人工肝研究的重点，有望成为急性肝衰竭治疗的有效手段[1]。由于人肝细胞的短缺，猪肝细胞因其来源广泛、功能与人肝细胞相近，成为BAL较理想的肝细胞来源[2]。但猪基因组中整合的内源性逆转录病毒（porcineendogenousretrovirus,PERV）的释放致人体细胞的感染可能性是猪肝细胞应用中面临的一大问题。我们在成功构建新型BAL后，通过体内外循环灌流研究PERV传播的可能性，为猪肝细胞为基础的BAL应用的安全性提供依据。1材料与方法1.1主要试剂与仪器BIOLIVA3A中空纤维管生物反应器（购自香港细胞生物有限公司）。RPMI1640培养基、新生牛血清购自Gibco公司。PCR主要试剂：蛋白酶K、RNAPCRKit(AMV)Ver2.1和MarkerDL2000均购自TaKaRa公司；扩增仪为GeneAmpPCRSystem2400（Perkin Elmer）；凝胶成像仪为上海四星生物技术有限公司生产，型号SX-100。1.2方法1.2.1猪肝细胞的制备及活率检测中国实验用小型猪（n=5），雌雄不限，体重2～4kg。采用原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞[2]。台盼蓝法检测细胞活率。取肝细胞以5×106个/ml接种到含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中以5×107/ml进行限制贴壁、旋转培养12h，制备球形聚集体肝细胞循环液。1.2.2急性肝衰竭（acuteliverfailure,ALF）犬模型的制作中国杂种犬5只，体重10～15kg，雌雄不限,由南通大学实验动物中心提供。采用门腔静脉端-侧分流及胆总管结扎切断术建模[3]。1.2.3新型BAL的构建和体内外循环灌流采用BIOLIVA3A中空纤维管生物反应器构建新型BAL[4]。中空纤维管膜孔径200nm，截流分子质量为70kD。新型BAL由闭合循环的细胞环路和血路两部分组成。细胞环路容量为250ml。将旋转培养后的猪肝细胞悬液（含1×1010猪肝细胞）置于中空纤维管外腔，循环速度20ml/min，持续通入氧气流量2L/min。体外循环灌流时血路采用RPMI1640培养基250ml流经中空纤维管内腔进行循环。体内灌流时，将ALF犬的股动脉血通过BAL的中空纤维管内腔循环到犬股静脉内，循环速度30ml/min。保持生物反应器于37.5℃，循环时间6h。体内外循环灌流实验分别进行5次。1.2.4检测指标①灌流前取球体培养的中国实验用小型猪肝细胞，用PCR扩增检测肝细胞PERV原病毒DNA和猪线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）。②循环前后分别取中空纤维管内腔RPMI1640培养基和犬血清，用RT-PCR扩增检测PERVRNA。1.2.5引物设计引物设计参照StDNA序列，上游引物PMTF：5′-TCACCCATCATAGAAGAACTCCTACA-3′，下游引物PMTR：5′-TTTTACGGTTAAGGCTGGGTTATTAATT-3′，扩增的目的片段大小为255bp。1.2.6猪肝细胞DNA和灌流前后中空纤维管内腔循环液、犬血清中RNA的提取DNA提取：按1ml消化缓冲液﹕108个细胞的比例加入消化缓冲液（100mmol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，25mmol/LEDTA(pH8.0)，5g/LSDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。50℃保温18h，其间经常振摇。加入等体积酚／氯仿／异戊醇，混匀、振摇、离心（5000g，10min，室温）。有机相弃去，向水相加入1/2体积7.5mol/L醋酸铵和2体积预冷无水乙醇。离心（5000g，5min，室温）弃上清液。沉淀用70%乙醇洗涤1次，空气中晾干，溶于TE中[5]。RNA提取：按照TaKaPa公司的Cartrimox-14TM RNA提取试剂盒的说明提取RNA，乙醇沉淀，干燥后溶于DEPC处理的dH2O中。1.2.7PCR和RT-PCR扩增反应PCR扩增：50μl反应体系中，各1μl引物PRETR1、PRETR2（各20μmol/L），1μl模板，5μlPCR缓冲液，3μlMgCl2(25mmol/L)，4μldNTPs(各2.5mmol/L)，0.25μlTaq聚合酶(5U/μl)，加灭菌ddH2O至终体积50μl。按标准的PCR反应条件：94℃1min，55℃1min，72℃11min进行35个循环。然后72℃延伸10min，于1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时其他条件不变，将引物改为PMTF、PMTR各1μl，PCR扩增猪mtDNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。RT-PCR扩增：20μl反应体系中，4μlMgCl2，2μlPCR缓冲液，8.5μl无RNA酶的ddH2O，2μldNTPs+（各10mmol/L），0.5μlRNA酶抑制剂，1μlPRETR2，(责任编辑：)1μlRNA模板，1μl逆转录酶（RT）。42℃反应20min后，99℃5min。再向反应体系中加入6μlMgCl2，64.5μl灭菌蒸馏水，8μlPCR缓冲液，1μlPRETR1，0.5μlTaq酶。与PCR循环的条件相同进行PCR扩增。同时以无逆转录酶的PCR作对照。2结果2.1PCR扩增图1显示了循环前猪肝细胞中PERVgag基因和mtDNAPCR扩增产物的凝胶电泳结果。结果表明，在用于BAL循环的5只中国实验用小型猪细胞中均可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA。2.2RT-PCR扩增图2显示了体外灌流前后中空纤维管内腔灌流液和治疗前后犬血清PERVRNART-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。结果表明，所有体外灌流前后中空纤维管内腔灌流液和治疗前后犬血清标本PERVRNA均为阴性。3讨论 肝衰竭的治疗是临床最为棘手的问题之一。迄今为止，肝移植是惟一有效的治疗手段。但因患者病情危急、供体缺乏和费用较高等原因，肝移植尚不能作为常规治疗手段。人工肝通过有效的体外肝支持作用，有可能为肝衰竭患者过渡到肝移植或经过肝再生而恢复创造条件。近年来，BAL成为人工肝研究的重点[1]。用培养肝细胞发挥生物合成与解毒作用是BAL与非生物人工肝、中间型人工肝的主要区别。在肝细胞来源方面，人肝细胞最为理想，但其来源缺乏；动物肝细胞中，猪肝细胞来源较广，功能与人相近，因此有可能成为异种肝细胞的较合适来源。1997年Patience等[7]首次报道猪体内存在PERV并感染体外培养人细胞系，猪肝细胞在BAL中使用的生物安全性引起人们广泛关注。PERV是单链RNA病毒，几乎存在于所有猪的品系中。VanderLaan等[8]报道了在SCID小鼠进行胰岛细胞异种移植后有少量的PERV感染。这引起人们对种族间PERV传播的普遍担心。本研究对使用猪肝细胞的新型BAL治疗前后进行PERV监测，以期阐明PERV传播的可能性，对猪肝细胞生物人工肝应用的安全性进行探讨。PERV的检测方法包括分子生物学方法和免疫学方法。前者检测PERV原病毒DNA序列、mRNA表达或RT活性，后者通过特异性抗体来检测PERV，包括areelsG,PoyckPP,ElootS,etal.Three-dimensionalNumericalModelingandputationalFluidDynamicsSimulationstoAnalyzeandImproveOxygenAvailabilityintheAMCBioartificialLiver[J].AnnBiomedEng,2006,34(11):1729-1744.[2]ChenZ,DingY,ZhangH.Morphology,viabilityandfunctionsofsucklingpighepatocytesculturedinserum-freemediumathighdensity[J].DigSurg,2002,19(3):184-193.[3]陈钟,丁义涛,徐庆祥,等.犬急性肝衰竭一种新模型的建立[J].中国普通外科杂志,2003,12(3):206-208.[4]ChenZ,DingY.Configurationofaneandinvitroevaluationofitsfunctions[J].AnnClinLabSci,2005,35(1):7-14.[5]田鹏鹏,陈钟,黄华,等.猪肝细胞和培养上清中猪内源性逆转录病毒的检测[J].细胞生物学杂志,2004,26(5):544-547.[6]SugamV,ChapmanL,etalPolymerasechainreactionassaysforthediagnosisofinfectionanandnonhumanrecipientsofpigxenografts[J].Transplantation,1999,68(2):183-188.[7]PatienceC,TakeuchiY,ed,1997,3(3):282-286.[8]VanderlaanLJice[J].Nature,2000,407(6800):90-94.(责任编辑：)