微生物中细菌菌落总数

种测定化妆品菌落总数培养基的质量比较录入时间:2010-9-1415:11:13来源：现代预防医学随着化妆品使用越来越广泛。已成为人们日常生活中的必需品。开展化妆品卫生质量监测。是保障人民健康维护消费者的利益，如使用了细菌总数超标的化妆品。会导致皮肤感染。因此，化妆品细菌总数测定是便于判明样品被污染的程度。是对样品进行卫生学评价的重要依据。按国家卫生部颁布《化妆品卫生规范》，卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基是用于测定化妆品菌落总数的培养基。现在生产培养基的厂家很多，为了解不同厂家生产的卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基质量，对4种培养基进行比较。现将结果报告如下。 1材料与方法1.1实验菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)。 1.2培养基卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基分别购自杭州天和微生物试剂有限公司．北京陆桥技术有限责任公司．广东环凯微生物科技有限公司等3种干燥培养基，编号为1、2、3号，干燥培养基按产品说明书配制，均在有效期内使用。自配卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基，由本实验室参照文献方法配制。其蛋白胨采用日本进口材料，自配培养基编号为4号，共4种卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基。 1.3试剂0.5％氯化三苯四氮唑(TTC)121℃20min高压灭菌，备用。 1.4实验方法1.4.1菌液的准备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌分别接种营养肉汤管。在37℃培养18～24h。 1.4.2稀释培养基并接种将培养好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌两种肉汤管用生理盐水10倍稀释，从10-1到l0-7。选用平板上菌落数在50～100cfu之间的稀释度，然后取稀释好菌悬液1ml置入无菌平皿，倾注加入0.5％TTC的卵磷脂、吐温80营养琼脂，每个平板15-20ml，每种培养基接种3个平板。待凝固后将平板翻转置37℃培养48h取出观察结果．并以每种培养基的3个平板菌落平均数为各检测数进行比较，试验重复5次。 1.4.3实验室室内质量控制 用菌落计数方法，取大肠埃希菌肉汤培养管用生理盐水10倍稀释，从10-1到10-7，吸取10菌悬液1ml注入无菌平板。共接种3个平板，然后将已溶解的营养琼脂倾注平板。混匀，待凝固置37℃培养48h后作菌落计数，连续进行10次。将所得结果标入质量控制图。 2  结果2.1 4种培养基大肠埃希菌的计数比较4种培养基对大肠埃希菌进行5次菌落计数重复试验，结果显示各种培养基的菌落大小与数量基本一致．差异无统计学意义(F=0.257，P>0.05)。见表1。 表1   4种培养基大肠埃希菌生长菌落数比较培养基编号细菌计数（×106cfu/ml）1234518.756.006.908.266.1029.736.408.438.966.23 39.266.567.168.706.104(自配)9.6606.167.208.806.96  2.2  4种培养基对金黄色葡萄球菌细菌总数计数连续进行5次实验，结果显示各种培养基的菌落大小与数量基本一致，差异无统计学意义(F=0.066，P>0.05)：见表2。 表2  4种培养基金黄色葡萄球菌生长菌落数比较培养基编号细菌计数（×106cfu/ml）1234516.568.436.609.036.2326.908.766.169.166.537.239.805.668.806.534(自配)8.639.065.869.136.202.3实验室室内质量控制连续10次菌落计数，测定值在4.3×106—9.66×106之间，平均值为6.94×106cfu／ml。s=1.74×106cfu／ml。10次测定值均在`x±2s范围内，达到实验室内部控制标准要求。 3  讨论实验表明，在4种不同厂家生产的卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基上，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的生长速度、菌落形态与数量无明显差别，各种培养基的软硬度、pH值等理化指标符合质量要求，差异无统计学意义。但在透明度上自配的卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基较其他3种干燥培养基清晰透明，而3种干燥培养基配制的平板较混浊可能是由于培养基的原材料不同的关系。自配培养基用的是日本进口蛋白胨，其颜色偏浅。蛋白胨是由蛋白质(如酪蛋白、纤维蛋白)经酶或酸碱分解而成。由于蛋白质的来源和消化程度不同，因而制得的胨质量相差很大，就是同一厂家不同批号的蛋白胨质量也会有差异，所以是否这样配制出来的培养基的透明度就有所不同。实验室室内质量控制是保证实验室检验结果准确性的必要基础。为确保本次实验结果的准确性与可靠性，我们对实验结果进行控制，绘制质量控制图，结果显示，l0次菌落总数测定值在4.3×106—9.66×106之间，均在允许误差范围，实验结果在`x±2s之内，未发现失控现象，从实验稳定、重复性好，表明本次培养基的实验结果是可信的。 近年，干燥培养基使用越来越广泛，培养基的质量关系到微生物实验室检测工作的成效。因此，开展微生物培养基的质控工作十分必要。目前，我国生产培养基的厂家很多，然而各厂家配制培养基的所采用配方有不同，有国家标准，或是行业标准。在制做方法上也各有异。如这次实验用的卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基里的吐温80试剂，有些厂家产品是在使用该培养基时才加吐温80。还有4号琼脂培养基，有些厂家生产干燥培养基是在制备4号琼脂平板时加入亚碲酸钾及庆大霉素，而有的厂家将亚碲酸钾、庆大霉素已经加进干燥培养基里，两种方法配制出来的4号琼脂平板颜色就不一样。现在的商品培养基还存在一些问题，如培养基包装不规范，没有标明生产日期及有效期限，包装标签说明没列出培养基的配方，还有的产品质检报告不规范等，干燥培养基的生产由于原料来源不同容易出现这样或那样的问题。因此．商品培养基的生产质量要提高，不断完善，要更加规范化、标准化。据文献介绍，实验室不得使用不符合要求的培养基。所以，在购买干燥培养基时，应选择技术力量强、性能稳定、通过质量管理体系认证企业的产品，而且不要经常更换厂家生产，以避免试验中出现使用不生产商的产品所造成的误差，同时，无论自制还是商业提供 培养基都需要按《商业性微生物培养基质量检验规范》进行质量控制，使用高质量的培养基，才能保证微生物检验结果的准确、公正、可靠。菌落总数一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》三、说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。（二）倾注培养1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。（三）计数和报告1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。 2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。赞同菌落裸露售卖是造成菌落总数超标的原因之一