第6章第4节分子生物学方法和其

第6章第4节分子生物学方法及其在中医研究中的应用一、名词解释（每题2分）1．质粒答案：质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是分子生物学技术中最常用的载体。2．重组载体答案：重组载体指采用适当的限制酶切割开载体，采用DNA连接酶将插入载体切口的目的DNA片段与载体DNA片段重新连接起来。3．黏性末端答案：黏性末端指DNA片段端含有几个突出的核苷酸单链末端，该单链核苷酸碱基与该DNA片段的另一端或其他DNA片段的突出的核苷酸单链碱基互补配对，称为黏性末端。4．钝性末端答案：钝性末端指一些限制性内切酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生带平端的DNA片段。5．限制性核酸内切酶答案：限制性核酸内切酶能特异性地结合于一段该酶能识别的双链DNA序列上，切割该双链DNA，切割结果可产生黏性末端或钝性末端。6．DNA聚合酶答案：DNA聚合酶是指能催化4种脱氧核苷酸合成DNA，催化脱氧核苷酸3’-OH与脱氧核苷酸5’-P之间形成磷酸二酯键反应的酶。真核细胞有5种DNA聚合酶，原核细胞有3种DNA聚合酶。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模板互补。分子生物学实验最常用DNA聚合酶有PCR使用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）等，主要用于催化DNA体外合成反应。7．连接酶答案：连接酶是指使各具有游离的5’-P和3’-OH的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，将两段DNA连接起来的酶。最常用的是T4噬菌体连接酶。8．脱氧核糖核酸酶I答案：脱氧核糖核酸酶I（DNA酶I）为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物为5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。9．反转录酶答案：反转录酶是指能以RNA为模板催化合成互补DNA链的酶。10．琼脂糖凝胶电泳答案：琼脂糖凝胶电泳为采用琼脂糖凝胶的水平电泳11 。在分子生物学中常用以分离和鉴定DNA和RNA。琼脂糖凝胶电泳通常可分离200bp～50kb的DNA，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至50ng的DNA，甚至10ngDNA也能辨别得出来。11．聚丙烯酰胺凝胶电泳答案：聚丙烯酰胺凝胶电泳为采用聚丙烯酰胺凝胶的电泳，多为垂直电泳。在分子生物学中常用以分离和鉴定DNA和蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳多用于分离5～500bp的DNA，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA，因此常用来测序。12．RNA制备答案：RNA制备指从组织细胞中分离和纯化RNA。RNA制备的方法有多种，比较常用的是酚/氯仿制备总RNA一步法。该方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA的降解，并使RNA与蛋白质分离进入溶液，离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，之后被异丙醇所沉淀。该方法操作简便，一次可以分离大量的RNA。提取的RNA可用于Northernblot和过OligodT柱，后者用于分离mRNA。13．Northernblot答案：Northernblot即RNA印迹杂交，是RNA分析的常用方法。该方法首先采用电泳将不同分子量的RNA分离；随即将RNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜上，固定；再用已知的DNA或RNA作探针，与硝酸纤维素膜上的RNA杂交，分析所检测RNA的分子量和含量。近似的还有RNA的斑点杂交和狭缝杂交。14．Southernblot答案：Southernblot是DNA印迹杂交，是DNA分析的常用方法。该方法首先采用一种或多种限制酶消化DNA，琼脂糖凝胶电泳把分子量大小不等的DNA分开，运用虹吸或电印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上，固定，使DNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上，与放射性标记或非放射性标记的探针杂交，杂交后洗去未被结合的探针，进行放射自显影或X光片曝光，在胶片上出现被检测的DNA显影条带。也可以用冷CCD照相机直接对杂交膜进行拍照，分析被检测DNA杂交条带。15．Westernblot答案：Westernblot是蛋白印迹法，是常用的蛋白质定性和定量检测方法。该方法将待测蛋白样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分子量大小分离的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后将此膜与抗靶蛋白的非标记抗体一同温育，结合上的抗体再与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白抗体反应，最后加入酶联抗体生色底物或化学发光底物，在滤膜上抗原抗体结合处原位显示特异性染色蛋白条带，或用X光片曝光，在胶片上出现被检测的蛋白质显影条带。也可以用冷CCD照相机对滤膜上的化学发光进行拍照，分析被检测蛋白质显影条带。16．基因芯片答案：基因芯片又称基因表达谱芯片（ExpressionArray），特点是把成千上万个基因高密度地点涂或压印在包被的载体上，一次检测可多达数万个基因。该方法进而发展出外显子芯片（ExonArray），可以进一步观察某基因各外显子剪接的差异。17．cDNA阵列11 答案：cDNA阵列（cDNAarray）技术把几十至上万个基因点涂在96孔板大小的硝酸纤维素膜上，一次检测可多达上万个基因。18．探针答案：分子生物学所指的探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。19．标记探针答案：把已知DNA或RNA片段作为模板，用一些特定的方法把一些易于检测的化学物质标记到所合成的另一条核酸链上，以便检测之用。20．双脱氧链终止法测序答案：双脱氧链终止法测序是DNA测序最常用的方法。其原理是采用2’,3’ddNTP，在3’位置上缺少一个羟基，当这些ddNTP掺入到正在延长的DNA链上，由于缺乏3’羟基，后继的dNTP不能与之形成磷酸二酯键，从而使DNA链终止延伸。在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入少量的一种ddNTP，将得到一系列不同长度的核苷酸链，其长度取决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在4组独立的反应体系中，加入4种不同的ddNTP（和一种经标记的dNTP），结果将产生4组长度不均的寡核苷酸，分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。然后采用能分辨长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，把4组反应液加样于凝胶顶部若干相邻的泳道上，电泳分离之后，从凝胶的放射自显影片上可直接读出DNA上的核苷酸序列。21．PCR答案：PCR是Polymerasechainreaction的缩写，即聚合酶链式反应，是DNA体外扩增的常用技术。该技术采用耐热的DNA聚合酶——Taq酶，在反复的目标DNA变性、PCR引物与DNA模板退火，以及Taq酶参与下的DNA链延伸中，微量DNA在几小时内将扩增达106倍，得到μg级的DNA！22．实时荧光定量PCR答案：实时荧光定量PCR指在PCR每一个循环后实时跟踪检测DNA的合成量。其原理是采用化学染料，常用的是SYBRGreenI，为双链DNA结合染料，能与双链DNA的小沟结合而所产生荧光大大增强。一旦PCR导致新的双链DNA合成，荧光强度将相应增加，从而被检测到。该技术通过不同浓度模板标准品扩增，所得到的标准曲线，可以用以判断待测样品起始拷贝数。23．RT-PCR答案：RT-PCR是反转录PCR的缩写。该技术采用寡聚胸苷引物或随机引物与模板mRNA退火，反转录mRNA成cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物，PCR扩增该段cDNA。RT-PCR的目的是判断、比较不同组别某一mRNA转录与否或转录量的多少。24．蛋白双向电泳答案：蛋白双向电泳是“等电聚焦电泳”和“SDS-PAGE电泳”的组合，即首先进行第一向等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后进行第二向SDS-PAGE电泳，蛋白质按分子量大小分离，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。二、填充题（每题2分）1．分子克隆常用酶有_______，_______，_______、_______和_______五类。11 答案：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、连接酶、脱氧核糖核酸酶I、反转录酶2．PCR的中文名称是_______。答案：聚合酶链式反应3．分子克隆常用载体包括_______、_______。答案：质粒、λ噬菌体或病毒4．目前用于检测目标组织多RNA转录的差异的技术目前主要有_______和_______技术。答案：基因芯片、DNA阵列5．常用的DNA测序方法是_______。答案：双脱氧链终止法测序6．_______即RNA印迹法，_______是DNA印迹杂交。答案：Northernblot、Southernblot7．为了分离和鉴别分子量大小不同的DNA或RNA片段，常用的电泳技术有_______和_______。答案：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳8．限制性核酸内切酶切割双链DNA后，可产生_______和_______两类末端。答案：黏性末端；钝性末端9．PCR的一个循环反应可分为_______、_______和_______三个过程。答案：变性、退火、延伸10．DNA的体外诱变是通过不同手段，造成目的DNA的_______或_______。答案：缺失、插入三、单选题（每题2分）1．分析RNA常用的分子生物学实验技术是（D）。　AEasternblotBWesternblotCSouthernblotDNorthernblotE以上都对2．连接酶可将（B）拼接起来。A两段RNAB两段DNACDNA与RNAD两个蛋白E以上都对3．NorthernBlot是常用的分析（B）的方法。ADNABRNAC蛋白质D基因组E以上都不对4．采用（C）可在体外将微量DNA迅速扩增。ANorthernblotBSouthernblotCPCRDcDNA阵列E以上都可以5．鉴定某一已知基因是否有所转录可用（A）方法。ANorthernblotBsouthernblotCPCRDEasternblotE以上都可以6．能催化4种脱氧核苷酸合成DNA的酶有（E）。ATaq酶B大肠杆菌DNA聚合酶ICKlenow片段DDNA聚合酶IIE以上都对7．催化以RNA为模板合成互补DNA链的酶是（A）。A反转录酶BTaq酶C转录酶11 DRNA酶E大肠杆菌DNA聚合酶I8．分子生物学中目前应用最为广泛的载体是（C）。Aλ噬菌体B酵母人工染色体C质粒D噬菌体ESV40病毒基因组9．为了鉴别或分离分子量不同大小的DNA或RNA片段，最常用的电泳方法就是（A）。A凝胶电泳B纸电泳C粉末电泳D缘线电泳E毛细管电泳10．（D）是主要用于检测组织或细胞中蛋白质组表达差异的方法。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotD蛋白双向电泳E重组载体11．大规模检测组织或细胞中RNA转录组水平的常用方法有（D）。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotD基因芯片ERT-PCR12．（A）主要用于检测基因组DNA的特定序列的定位和DNA定量。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDDNA诱变ERTPCR13．（C）是常用的蛋白质定性和定量检测方法。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDRTPCREEasternblot14．（D）不是分子克隆常用酶。A限制性内切酶B连接酶CDNA酶IDDNA酶E逆转录酶15．（E）常用于比较不同组织或细胞的某一基因转录量的差异。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDRTPCREB+D16．可用于蛋白质的定性和定量检测的方法是（C）。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDEasternblotERTPCR17．（B）实验中不必使用硝酸纤维素膜。AcDNA阵列B基因芯片CNorthernblotDWesternblotESouthernblot18．质粒存在于（D）。A细菌的染色体中B真核细胞染色体中C原核细胞染色体中D细菌的染色体外E以上都可以19．PCR技术不可应用于（E）。ADNA大量扩增BRNA大量扩增C快速呈现细胞系或组织基因转录的差异D将mRNA反转录为cDNAEB+C+D20．连接两段DNA可用（D）ADNA聚合酶BDNA聚合酶ⅠCTaq酶　　D连接酶E反转录酶21．（E）可用于蛋白质检测和分析。ANorthernblotB蛋白双向电泳CWesternblotDA+BEB+C11 22．PCR一个循环反应不包括（C）。A变性B解链C限制性酶切D退火E延伸23．应用PCR技术，经过30～40个循环，可将微量DNA迅速扩增约（E）倍。A100B1000C10000D100000E100000024．关于DNA酶Ⅰ，下列表述正确的有（E）。A水解双链DNAB水解单链DNAC在Mg2+存在下，其切割位点随机分布。D优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNAE以上都对25．（E）可催化核苷酸之间形成磷酸二酯键。ADNA聚合酶BDNA酶ⅠC连接酶DA+BEA+C26．质粒最常用于（E）。A聚合酶链式反应B提取真核细胞DNAC标记探针D构建DNA文库E重组载体四、多选题（每题2分）1．（ACD）为分子克隆常用酶。A限制性内切酶B蛋白组合酶C连接酶D反转录酶E氧化水解酶2．为了鉴别或分离分子量不同大小的DNA或RNA片段，较常用的电泳方法是（AE）。A琼脂糖凝胶电泳B纸电泳C粉末电泳D缘线电泳E聚丙烯酰胺凝胶电泳3．以下技术手段中，可以用于在mRNA水平进行研究的是（ABC）。ADDPCR技术BRT-PCR技术CNorthernblotDWesternblotESouthernblot4．在DNA水平进行研究的方法可以采用（AE）。APCR技术BRT-PCR技术CNorthernblotDWesternblotESouthernblot5．硝酸纤维素膜在（ACDE）实验中使用。AcDNA阵列B基因芯片CNorthernblotDWesternblotESouthernblot7．蛋白双向电泳分离蛋白主要是根据蛋白的（CE）。A密度B溶解度C等电点D分子构象E分子量8．基因克隆常用的载体包括（AD）。A质粒B溶酶体C大肠杆菌Dλ噬菌体E酵母9．质粒的特性包括（ABDE）。A含有多克隆位点区域B具有自主复制能力C具有主动转移性D具有药物筛选标志基因E在细菌体内可获得较高的拷贝数11 10．用来检测组织或细胞中某个特定基因转录水平的分子生物学技术包括（BD）。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDRTPCRE基因芯片11．鉴定某一已知基因是否有所转录不可用（BCDE）方法。ANorthernblotBsouthernblotCPCRDEasternblotEWesternblot12．与DNA检测有关的实验技术有（ABC）。AsouthernblotB基因芯片CPCRDEasternblotEWesternblot13．不可用于蛋白质的定性和定量检测的实验方法有（ABDE）。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDEasternblotERTPCR14．（AE）可应用PCR技术进行。ADNA大量扩增BRNA大量扩增C快速呈现细胞系或组织基因转录的差异DmRNA反转录成cDNAE判断待测样品中DNA的起始拷贝数15．使目的DNA大量扩增可采用（CE）。ASouthernblot技术BNorthernblot技术C载体重组技术DWesternblot技术E　PCR技术16．（BC）可用于蛋白质检测和分析。ANorthernblotB蛋白双向电泳CWesternblotDSouthernblotEPCR17．检测基因组DNA的特性不宜采用（BCE）技术。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotDDNA诱变ERTPCR18．下列（BD）是用于检测RNA的实验技术。ASouthernblotBNorthernblotCWesternblotD基因芯片EPCR19．DNA酶Ⅰ可用于（ABD）。A水解双链DNAB水解双链或单链DNAC水解双链或单链DNA和RNAD优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNAE以上都可以20．（ACD）可催化核苷酸之间形成磷酸二酯键。ADNA聚合酶BDNA酶ⅠC连接酶D反转录酶E限制酶五、问答题（每题10分）1．何谓载体，常用的载体有哪些？何谓重组载体？答案：（1）在分子生物学中，载体指用以承载插入DNA片段的分子。常用的载体有质粒和λ噬菌体。（2）重组载体，指采用适当的限制酶切割开载体，采用DNA连接酶使各具有游离的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，将插入载体切口的目的DNA片段11 与载体DNA片段重新连接起来。载体重组后，转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所含抗生素抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落。选择阳性单菌落扩增，小量制备DNA，鉴定。2．何谓质粒，在分子生物学中具有什么作用？答案：质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是分子生物学技术中最常用的载体。通过改造，实验室常用质粒具备了以下特性：（1）含有多克隆位点区域；（2）具有自主复制能力；（3）有药物筛选标志基因；（4）在细菌体内可获得较高的拷贝数。3．分子克隆常用哪些酶？答案：分子克隆常用的酶有限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、连接酶、脱氧核糖核酸酶I、反转录酶等。4．何谓限制性核酸内切酶，常用的有哪些？答案：限制性核酸内切酶能特异性地结合于一段该酶能识别的双链DNA序列上，切割该双链DNA，切割结果可产生黏性末端或钝性末端。常用的限制性核酸内切酶有EcoRI、HindⅢ、BamHI、KpnI、PstI、ScaI、SmaI等。5．什么叫DNA聚合酶，主要有哪些？具有什么作用？答案：DNA聚合酶是指能催化4种脱氧核苷酸合成DNA，催化脱氧核苷酸3’-OH与脱氧核苷酸5’-P之间形成磷酸二酯键反应的酶。真核细胞有5种DNA聚合酶，原核细胞有3种DNA聚合酶。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模板互补。分子生物学实验最常用DNA聚合酶有PCR使用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）等，主要用于催化DNA体外合成反应。6．连接酶的用途是什么？答案：连接酶是指使各具有游离的5’-P和3’-OH的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，将两段DNA连接起来的酶。最常用的是T4噬菌体连接酶。其用途是将两段DNA连接起来。7．何谓脱氧核糖核酸酶？答案：脱氧核糖核酸酶I（DNA酶I）为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物为5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。8．反转录酶的用途是什么？答案：反转录酶的用途是以RNA为模板催化合成互补DNA链。9．为什么要DNA凝胶电泳？常用的DNA凝胶电泳有哪些？答案：DNA凝胶电泳主要用以鉴别或分离分子量不同大小的DNA或RNA片段。常用的DNA凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。琼脂糖凝胶电泳为采用琼脂糖凝胶的水平电泳。在分子生物学中常用以分离和鉴定DNA和RNA。琼脂糖凝胶电泳通常可分离200bp～50kb的DNA，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至50ng的DNA，甚至10ngDNA也能辨别得出来。11 聚丙烯酰胺凝胶电泳为采用聚丙烯酰胺凝胶的电泳，多为垂直电泳。在分子生物学中常用以分离和鉴定DNA和蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳多用于分离5～500bp的DNA，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA，因此常用来测序。10．为什么要制备RNA？在RNA制备过程中需要注意什么？答案：（1）真核细胞RNA的制备主要有以下目的：1）了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化。2）了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化。3）获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。4）其他用途。（2）在RNA制备过程中主要是需要防止RNA酶的污染，从而导致RNA的降解。11．何谓Northernblot，何谓Southernblot，各自具有什么作用？答案：（1）Northernblot即RNA印迹杂交，是RNA分析的常用方法。该方法主要用于：1）鉴定某一基因是否有所转录及其转录量；2）估计目的RNA的分子量大小；3）比较不同组织或细胞的某一基因转录量的差异。（2）Southernblot是DNA印迹杂交，是DNA分析的常用方法。该方法主要用于基因组DNA特定序列定位和分析基因组的变化，如基因缺失与否。12．何谓基因芯片，其用途如何？基因芯片与Northernblot的目的有何异同？答案：（1）基因芯片又称基因表达谱芯片，特点是把成千上万个基因高密度地点涂或压印在包被的载体上，一次检测可多达数万个基因。该方法主要用于多基因转录水平的检测。通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。（2）基因芯片与Northernblot检测的最大区别在于，Northernblot一次仅检测单个基因（但具有估计目的RNA的分子量大小的优点），而基因芯片一次可以检测数万个基因。避免了NorthernBlot操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等的不足。13．何谓探针，探针的用途是什么？答案：分子生物学所指的探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用一些特定的方法把一些易于检测的化学物质标记到合成的另一条核酸链上，以便检测之用。其用途是用于检测与其互补的核酸序列。14．cDNA文库与DNA文库的区别是什么？答案：（1）cDNA文库是指以某组织细胞mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合。（2）DNA文库是指以某一特定来源的DNA，通过细胞-DNA克隆技术构建成含所有DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，使之包含全部DNA克隆集合。（3）cDNA文库与DNA文库的区别在于11 ：基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性；cDNA文用以筛选克隆细胞特异表达的基因。而DNA文库含有所有基因组DNA，包含带有内含子和外显子的基因组基因，而cDNA文库中仅含已经过剪接、去除了内含子的cDNA。15．什么是PCR，PCR的用途是什么？答案：PCR是Polymerasechainreaction的缩写，即聚合酶链式反应。该技术采用耐热的DNA聚合酶——Taq酶，在反复的目标DNA变性、PCR引物与DNA模板退火，以及Taq酶参与下的DNA链延伸中，微量DNA在几小时内将扩增达106倍。因此，PCR的用途主要是体外扩增DNA。16．实时荧光定量PCR与普通PCR原理的区别？答案：（1）普通PCR的原理是采用耐热的Taq酶，在反复的目标DNA变性、PCR引物与DNA模板退火，以及Taq酶参与下的DNA链延伸中，微量DNA在几小时内得到大量扩增。（2）实时荧光定量PCR采用了普通PCR的原理，其区别在于在PCR每一个循环后实时跟踪检测DNA的合成量。其原理是采用化学染料，常用的是SYBRGreenI，为双链DNA结合染料，能与双链DNA的小沟结合而所产生荧光大大增强。一旦PCR导致新的双链DNA合成，荧光强度将相应增加，从而被检测到。该技术通过不同浓度模板标准品扩增，所得到的标准曲线，可以用以判断待测样品起始拷贝数。因而其具有普通PCR所不可比拟的优势。17．何谓RT-PCR，RT-PCR与Northernblot的异同如何？答案：（1）RT-PCR是反转录PCR。该技术采用寡聚胸苷引物或随机引物与模板mRNA退火，反转录mRNA成cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物，PCR扩增该段cDNA。RT-PCR主要用于是判断、比较不同组别某一mRNA转录与否及转录量的多少。（2）与Northernblot比较，RT-PCR具有方法简单、检测速度快；但灵敏度和重复性略逊于Northernblot，且不能观察所检测mRNA的分子量。18．克隆化基因的表达的用途是什么？答案：（1）克隆化基因的表达指将目的基因重组入相应的，可以在真核细胞（或原核细胞）中表达的载体，采用物理或化学方法将重组后的载体导入真核细胞（或原核细胞），使目的基因得以表达。（2）该技术主要在于观察所克隆基因的功能，以及工业化生产。19．何谓Westernblot？答案：Westernblot是蛋白印迹法，是常用的蛋白质定性和定量检测方法。该方法将待测蛋白样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分子量大小分离的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后将此膜与抗靶蛋白的非标记抗体一同温育，结合上的抗体再与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白抗体反应，最后加入酶联抗体生色底物或化学发光底物，在滤膜上抗原抗体结合处原位显示特异性染色蛋白条带，或用X光片曝光，在胶片上出现被检测的蛋白质显影条带。20．何谓蛋白双向电泳，与Westernblot的作用异同如何？11 答案：（1）蛋白双向电泳是“等电聚焦电泳”和“SDS-PAGE电泳”的组合，即首先进行第一向等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后进行第二向SDS-PAGE电泳，蛋白质按分子量大小分离，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。（2）蛋白双向电泳主要用于对特定环境下细胞内存在所有蛋白质进行综合分析；而Westernblot主要检测是某特定蛋白质的表达情况。11