异黄酮no供体衍生物的合成及其初步生物活性论文

　　异黄酮NO供体衍生物的合成及其初步生物活性论文李芳耀，杨新平，林家逊，劳世鑫【摘要】目的设计合成具有NO释放作用的新型异黄酮衍生物，以期通过NO与异黄酮的协同作用，增强衍生物抗肿瘤活性。方法该文将有机硝酸酯通过碳链与异黄酮7-酚羟基连接，得到两个7-取代的异黄酮的硝酸酯衍生物。结果其结构经IR、1H-NMR、13C-NMR和MS表征，总产率为40%～45%。结论对目标产物进行一氧化氮体外释放测定和体外抗肿瘤活性测试.freelutualprodrug)的设计原理，在7位羟基上连接NO供体片段，合成两个NO供体型异黄酮类衍生物，即7-(2-硝基氧基)乙氧基-4’-甲氧基异黄酮(6a)及7-(3-硝基氧基)丙氧基-4’-甲氧基异黄酮(6b)，合成路线见图1，初步研究了目标产物体外释放NO体外活性和体外抗肿瘤活性。图1目标化合物的合成路线1仪器和试剂美国Perkin公司傅立叶变换红外光谱仪，瑞士Bruck公司超导核磁共振仪，日本Shimadzu公司质谱分析仪，德国Heraeus公司恒温CO2培养箱：美国BIO-RAD公司酶联免疫检测仪，日本Olympus公司倒置显微镜。所用试剂均为市售化学纯，必要时经无水处理。2方法2.17-羟基-4’-甲氧基异黄酮(4)的合成将间苯二酚22g(0.20mol)和对甲氧基苯乙酸32.8g(0.20mol)置于三颈瓶中，用70mlBF3·Et2O中，恒温80℃下电磁搅拌反应6h，生成脱氧安息香(TLC跟踪反应进程)。冷却至10℃，加入DMF(300ml)和BF3·Et2O(100ml)，升温至50℃，滴加干燥的甲基磺酰氯(70ml)和DMF(100ml)混合液，升温至78℃反应3h，将冷却物倒入大量碎冰中，有大量棕红色固体沉淀，过滤收集固体，真空干燥后，得到浅红色粉末42.2g，收率为78.7%，m.p.257.0～258.3℃。2.27-溴乙氧基-4’-甲氧基异黄酮(5a)的合成将无水K2CO35.6g和17ml(0.20mol)二溴乙烷置于三颈瓶中，加少量的KI，7-羟基-4’-甲氧基异黄酮5.5g(0.02mol)溶解于50ml的DMF与50ml的丙酮组成的混合液中，在搅拌下缓慢滴进三颈瓶中。恒温60℃下电磁搅拌反应24h(TLC跟踪反应进程)。反应完成后，冷却至室温，减压过滤，真空干燥得浅黄色固体6.6g，收率为68.3%，m.p.180.5～180.6℃;1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:3.72(2H,t,-CH2Br),3.87(3H,s,-OCH3),4.41(2H,t,-OCH2-),6.88-8.26(8H,-Ar);13C-NMR(CDCl3,.freelol)溶解于50mlDMF与50 ml丙酮的混合液，在搅拌下缓慢滴进盛有无水K2CO35.6g，1,3-二溴丙烷20.2ml(0.20mol)和少量碘化钾的三颈瓶中。加热恒温60℃下电磁搅拌反应20h(TLC跟踪反应进程)。反应完成后，冷却至室温，减压过滤，真空干燥得浅黄色固体7.9g,收率为74.5%,m.p.248.5～249.1℃;1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:2.40(2H,t,-CH2-CH2-CH2),3.65(2H,t,-O-CH2-),3.86(3H,s,-O-CH3),4.23(2H,t,-CH2-Br),6.88-8.24(8H,m,Ar).13C-NMR(CDCl3,125MHz)δ:29.6,32.0,55.4,66.0,100.8,114.0,114.7,118.6,124.2,124.9,127.9,130.1,152.1,157.9,159.6,163.0,175.8。2.47-(2-硝基氧基)乙氧基-4’-甲氧基异黄酮(6a)的合成7将硝酸银6.0g(0.035mol)溶于无水乙腈20ml中，搅拌下避光加热至50℃，迅速加入7-溴乙氧基-4’-甲氧基异黄酮2.4g(0.0064mol)和无水乙腈55ml的混合液。加毕继续加热至70℃，反应3h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入醋酸乙酯和水，分出有机层，用醋酸乙酯(20ml×3)萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却并凉干，得到白色结晶3.8g,收率为73.3%，m.p.139.8～141.7℃;IR(KBr)υ:3445,2927,1633,1517,1446,1297,1259,1025,828;1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:3.86(3H,s,-O-CH3),4.36(2H,t,-CH2-ONO2),4.89(2H,t,-O-CH2-),6.86-8.25(8H,m,Ar);13C-NMR(CDCl3,125MHz)δ:28.3,55.4,64.5,68.8,70.4,101.1,114.0,114.4,114.6,119.1,124.1,125.0,128.1,128.2,130.1,152.1,157.7,159.7,162.1,157.7;159.7,162.1,175.7;MSm/z+357.9。2.57-(3-硝基氧基)丙氧基-4’-甲氧基异黄酮(6b)的合成将硝酸银6.0g(0.035mol)溶于无水乙腈20ml中，磁力搅拌，避光加热至50℃，迅速加入7-溴丙氧基-4’-甲氧基异黄酮2.4g(0.0062mol)和无水乙腈55ml的混合液。加毕继续加热至70℃，反应2.5h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入醋酸乙酯和水，分出有机层，用醋酸乙酯(20ml×3)萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却，得到白色结晶4.7g,收率为76.6%，m.p.121.2～121.5℃;IR(KBr)υ:3451,2926,1627,1514,1444,1279,1259,1180,1034,888,829;1H-NMR(CDCl3,500MHz))δ:2.31(2H,t,-CH2-CH2-CH2),3.87(3H,s,-O-CH3),4.12(2H,t,-CH2-ONO2),4.73(2H,t,-O-CH2-),6.87～8.25(8H,m,Ar).13C-NMR(CDCl3,125MHz)δ:26.9，29.7,55.4,64.2,69.6,100.8,114.0,114.6,118.8,124.2,125.0,128.0,130.1,152.1,157.8,159.6,162.7,175.8;MSm/z+371.9。3初步活性实验8，93.1目标化合物NO 释放量的测定将目标产物及对照化合物单硝酸异山梨醇酯溶于二甲基亚砜中(0.01mol/L),再用磷酸缓冲液稀释。缓冲液里含有过量的半胱氨酸(5mmol/L),混匀,受试物终浓度为10-4mol/L。将溶液置于37℃环境中孵化,于不同时间点取反应液8ml与格里斯试剂2ml混合在锥形瓶中，试剂混合,室温放置10min,于540nm处测吸收度。NO释放量以其氧化物亚硝酸盐(NO2-)的量表示。结果如图2所示，合成的两个一氧化氮供体化合物在2h内，释放一氧化氮明显，均达到40%Cmax以上水平，高于单硝酸异山梨醇酯的一氧化氮释放量3倍左右;2h后，释放趋于平缓。单硝酸异山梨醇酯的一氧化氮释放量低，具有释放缓慢增多的趋势。在3h内，6a、6b和单硝酸异山梨醇酯的Cmax分别为0.25、0.195、0.122。这3个化合物的NO释放量顺序是6a6b单硝酸异山梨醇酯。图2NO的体外释放3.2体外抗肿瘤活性实验用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将人淋巴样白血病细胞HL-60稀释成5×104个/ml的细胞悬液，取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置于恒温CO2培养箱中培养24h。然后分别加入化合物4、6a和6b20μl/孔，每档浓度设4个平行孔，另设溶剂对照组,培养48h。加入MTT，再培养4h后吸去上清液，各孔加150μlDMSO，轻轻振荡5min后用酶联免疫检测仪在标波长为490nm处测定各孔的吸光度(A)值，并计算细胞的抑制率。从图3可以看出，化合物4、6a和6b在10～100μg/ml的浓度下，三者均表现出了抑制人淋巴样白血病细胞HL-60增殖的作用，而且这种作用呈剂量依赖性，同时还可以看出，异黄酮与一氧化氮供体偶联物6a和6b的细胞抑制率与母体异黄酮4相比有了明显的提高，可能是因为6a和6b释放出NO与母体产生协同作用，增强了抑制肿瘤细胞增殖活性。图3目标产物对HL-60细胞的抑制作用4讨论由7-羟基-4’-甲氧基异黄酮4制备5a和5b的反应是属于分子亲核取代反应加入少量的KI作为催化剂加快反应速率，因为I-既是强的亲核试剂又是很好的离去基团，先利用它取代二溴乙烷或二溴丙烷中的一个溴形成1-溴-2-碘乙烷或1-溴-3-碘丙烷，然后7-OH容易取代取代1-溴-2-碘乙烷或1-溴-3-碘丙烷中的碘生成5a或5b。同时加入的无水碳酸钾作为缚酸剂，可以及时除去生成的酸性物质。利用5a和5b与硝酸银避光下合成NO供体型异黄酮类衍生物，主要目的是为了防止硝酸银见光分解使得副产物增加。谱图分析：5a和5b的1HNMR谱大部分相差不大，只是5b比5a在化学位移2.4处多两个氢，这是5b比5a多一个亚甲基缘故。6a与5a 相比，由于硝基氧基取代了溴，导致原来与溴相连的亚甲基上的氢向低场移动，化学位移从3.72ppm增为4.12ppm，同样6a和6b的氢谱也有类似的变化。目标产物的红外光谱中，在1650cm-1附近都有羰基特征峰。初步研究表明，调节连接碳链的长度，能够控制NO的释放速率，将具有释放一氧化氮活性的硝酸酯与异黄酮偶联，在一定程度上提高了抑制人淋巴样白血病细胞HL-60增殖活性，可能是因为NO供体新异黄酮在人淋巴样白血病细胞HL-60内释放出异黄酮和NO，两者产生协同效应，导致了抗肿瘤作用增强。【