环境微生物学综合实验

实验一光学显微镜的使用，微生物染色和计数技术 Ⅰ、显微镜的使用 一、实验原理微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜(16mm，10´)高倍物镜(4mm，40-45´)和油镜(1.8mm，95-100´)三种。油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了(图Ⅰ-1)。利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：式中数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。式中l=光波波长由上述可知若n值和α角越大则N· A越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大(图Ⅰ-2)。一些物质的折射率：水1.33玻璃1.52空气1.0香柏油1.515。二、实验器材1、 仪器显微镜；2、 材料巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。三、操作步骤1、取镜显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图Ⅰ-32、调节光源1)将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5厘米左右。2)上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。图Ⅰ-3光学显微镜的构造1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋3)左眼看目镜调节反光镜镜面角度(在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜)。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。一般染色标本油镜检查对，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。3、低倍镜观察低倍物镜(8´或10´)视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤：1)先将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上)，并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约0.5厘米处。2) 左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。3)移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。4、高倍镜观察将高倍物镜(40´)转至镜筒下方(在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞)，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。5、油镜观察1)用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。2)左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台(注意：此时只准下降载物台，不能向上调动)，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。3)如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。4)观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。5)将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。四、注意事项1、显微镜镜头的保护和保养2、使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线Ⅰ、微生物的染色  一、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐(methylenebluechloride，缩写为MBC)；它可被电离成正、负离子：MBC®methyleneblue++chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystalviolet)、碱性复红(basicfuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。二、实验器材1、 菌种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)；2、 仪器显微镜；3、 材料接种环，酒精灯，火柴，载玻片，洗瓶，废液缸，擦镜纸，吸水纸；4、 染料草酸铵结晶紫或石碳酸复红。三、操作步骤1、涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。2、干燥将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。3、固定手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料；4、染色玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染l-2min。5、水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。6、干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。7、镜检用油镜观察并绘出细菌形态图。8、清理 实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。四、注意事项1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。Ⅱ、革兰氏染色法 一、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。二、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichiacoli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillussubtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；三、操作步骤1、 涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。2、 固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。3、染色⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。⑶脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。⑷复染滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。4、镜检干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G+)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。四、注意事项1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。Ⅲ、微生物平板菌落法数法 一、实验原理微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个菌)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数，一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检定、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检定。二、实验器材1、 90ml、45ml和9ml无菌水、1ml和5ml无菌吸管、无菌平板；2、 天平、称样瓶、记号笔； 3、 待测样品、所需各类培养基。三、操作步骤(混菌法)1、样品稀释液的制备准确称取待测样品10g，放入装有90ml无菌水并放有小玻珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置约20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液1ml移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2菌液1mL移入装有9ml无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度的菌液，供平板接种使用(如图Ⅴ-2)。图Ⅴ-2平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，多采用10-7、10-8、10-9稀释度的菌液；测定土壤细菌数量时，多采用10-4、10-5、10-6稀释度的菌液；测定放线菌和真菌数量时，多采用10-3、10-4、10-5稀释度的菌液。2、平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。该实验采用混合平板培养法计数：将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用1毫升无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1毫升放入编号10-9的3个平皿中，同法吸取10-8稀释液各1毫升放入编号10-8的3个平皿中，再吸取10-7稀释液各1毫升，放入编号10-7的3个平皿中(由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换)。然后在9个平皿中分别倒入已融化并冷却至45-50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养，至长出菌落后即可计数。放线菌和真菌同法可得。3、结果计算计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中，选择一个合适的稀释度，求出每克待测样品中的含菌数。⑴从三个稀释度中先出一个稀释度(即计算稀释度)，每个平皿中的菌落数，细菌、放线菌、酵母菌以每皿30-300个菌落为宜，霉菌以每皿10-100个菌落为宜。这是因为稀释度过高，菌数少，误差大，稀释度过低菌数多，不易得到分散的菌落，也不易数清。选出计算稀释度后，数出该稀释度中三个重复的菌落数，并求出平均的菌落数。⑵同一稀释度的各个重复的菌数相差(平行误差)不能太悬殊。⑶ 从低稀释度到高稀释度，以菌落数递减10倍为标准，各稀释度间的误差(递减误差)越小越好。⑷含菌数的计算含菌数通常以每克样品(烘干重或风干重)中含有的测定菌的数量来表示。可按下面的公式计算。四、注意事项1、在整个实验过程中的无菌操作。2、应根据实验所测的样品决定最高稀释度。3、混菌法倒培养基时应当注意培养基不能过烫或过冷。实验二培养基的制备及灭菌 Ⅰ、培养基的制备 一、实验原理培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。 二、实验器材1、 药品琼脂，1NNaOH溶液，1NHCl溶液，牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基的配方药品；2、 材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅，天平，10×200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签。三、操作步骤1、计算称量根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。2、溶解一船情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想)。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，补足水分到需要的总体积。3、调节pH用滴管逐滴加入1NNaOH或lNHCl边搅动；边用精密的pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止。pH值也可用pH计来测定。4、过滤要趁热用四层纱布过滤。A.培养基的分装B.棉塞的做法1.正确2.管内太短，外部太松3.整个棉塞太松4.管内太紧，外部太短松图Ⅴ-1培养基的分装装置与棉塞5、分装按照实验要求进行分装。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。6、加塞培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有很大影响。7、灭菌在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。如果分装的斜面，要趁热摆放并使斜面长度适当(为试管长度1/3-l/2，不能超过1/2)。培养基经灭菌后，应保温培养2-3天，检查灭菌效果，无菌生长者方可使用。 四、注意事项1、配制固体培养基用的琼脂应先行用冷水浸泡，纱布过滤，在调好pH值后加入。2、 配制高氏一号合成培养基时应小心溶解淀粉，不要成团。 Ⅱ、灭菌与消毒 灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。一、消毒与灭菌的方法消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。㈠、加热法加热法又分干热灭菌和湿热灭菌两类。1、干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气160℃-170℃下保温2小时进行灭菌。2、湿热灭菌⑴高压蒸汽灭菌法此法是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内1.05kg／cm2(15磅/英寸2)，121.3℃保持15-30分钟进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化、以达到彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。⑵间歇灭菌法有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌。该器底层盛水，顶部插有温度计，加热后水蒸汽温度达到100℃时，即循环流于器内，水蒸汽碰到器内物体时，又凝成水，流至底层贮水处，故不至干涸。灭菌时，将培养基放在器内，每天加热100℃30分钟、连续三天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养基取出放室温下18-24小时，使其中的芽孢发育成为营养体，第二日再加热l00℃ 30分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。一般凡能用高压蒸汽灭菌的物品均不采用此法灭菌。⑶煮沸消毒法注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10-15分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。㈡、过滤灭菌许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。蔡氏过滤器是用银或铝等金属做成的，分为上、下两节、过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板，蔡氏过滤器的结构如图。滤膜过滤器的结构与蔡氏过滤器相似，只是滤膜是一种多孔纤维素(乙酸纤维素或硝酸纤维素)，孔径一般为0.45mm，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的滤膜。㈢、紫外线灭菌紫外线波长在200-300nm，具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。㈣、化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的有2%煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3-5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等，见表Ⅴ-1。表Ⅴ-1常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表二、实验室常用灭菌方法㈠干热灭菌用干燥热空气(170℃)杀死微生物的方法称干热灭菌。玻璃器皿(如吸管、平板等)、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品等不能用干热灭菌法。干热灭菌操作步骤：1、装箱将准备灭菌的玻璃器具洗涤干净、晾干，用纸包裹好，放入灭菌的长铁盒(或铝盒)内，放入干热灭菌箱内，关好箱门。2、灭菌接通电源，打开干热灭菌箱排气孔，等温度升至80-100℃时关闭排气孔，继续升温至160-l70℃计时，恒温1-2h。3、灭菌结束后，断开电源，自然降温至60℃，打开电烘箱门，取出物品放置备用。注意事项： 1、灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。2、灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包纸供焦。3、灭菌温度恒定在l60-l70℃为宜，温度过高，纸和棉花会被烤焦。4、降温时待温度自然降至60℃以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。㈡加压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低(表Ⅴ-2)，二是湿热的穿透力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。表Ⅴ-2蛋白质含水量与凝固所需温度的关系表Ⅴ-3干热与湿热穿透力及灭菌效果比较在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2)，它与1b/in2(磅/英寸2)和温度的换算关系见表Ⅴ-5。表Ⅴ-5蒸汽压力与蒸汽温度换算关系 实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。本实验介绍手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：1、首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2、放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3、加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4、用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。5、灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。6、将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。实验三微生物的分离培养和接种技术  Ⅰ、微生物的分离培养 一、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论总数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。本实验用平板划线法从土壤中分离纯化微生物。二、实验器材1、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等；2、盛9ml无菌水的试管，盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，1ml和5ml无菌吸管，无菌培养皿；3、接种环，土样等。三、操作步骤图Ⅴ-3平板划线操作示意图1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。2、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的土壤悬液-环在平板上划线(图Ⅴ-3)。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： ⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图Ⅴ-4，A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。图Ⅴ-4划线分离示意图⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。3、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。四、注意事项1、在倒平板时可在培养基中添加某些药物如在高氏一号合成培养基中加10%的酚，在马铃薯蔗糖培养基中加入链霉素(30mg/ml)，这样可减少所不需的杂菌。2、实验操作过程中无菌操作。Ⅱ、微生物的接种技术 一、实验原理 微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。本次实验做斜面接种技术。二、实验器材1、菌种枯草芽孢杆菌，大肠杆菌；2、培养基牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基；3、材料接种环，酒精灯。三、操作步骤斜面接种技术具体操作如下：1、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。2、点燃酒精灯。3、接种用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序(图Ⅴ-5)简述如下：⑴手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间部位。斜面向上，并使它们位于水平位置(图Ⅴ-5a)。⑵旋松棉塞先用右手将棉塞旋松，以便接种时拔出。⑶取接种环右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。⑷拔棉塞用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图Ⅴ-5b、c所示。⑸环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。 ⑹取菌种待环冷却后轻轻沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，如图Ⅴ-5d所示，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。图Ⅴ-5斜面接种时的无菌操作⑺接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基(图Ⅴ-5 e)。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。⑻塞棉塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气，如图Ⅴ-5f、g所示。⑼环灭菌将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧，如图Ⅴ-5h所示。实验四水的细菌学检验a)水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。二、实验材料1.样品：水样2.培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。3.其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。注意手指不得触及瓶口内部。在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。 1.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。每一接种量接种3管，置于35~37℃培养24士2h。将产酸、产气的发酵管按下列程序继续进行检验。2.在指示性培养基上分离培养：将产气的发酵管中的发酵液在EMB平板或远藤氏平板上划线分离，置于35~37C培养18~24h。3.革兰氏染色及镜检：于上述平板上长出的菌落中挑取1~2个大肠菌群可疑菌落进行镜检和革兰氏染色。4.复发酵试验：将上述镜检之菌落同时接种于乳糖发酵管，置于35~37C培养24土2h，观察产气情况。5.结果：凡是在乳糖胆盐发酵管产酸、产气，在指示性培养基上能生长的，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，在复发酵管中产酸、产气的，即说明有大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阳性；有一项不符的，即说明无大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阴性。根据有大肠杆菌细菌存在的初发酵管的管数，查相应的大肠杆菌检索表，报告每100毫升待检样品中大肠菌群细菌的最近似数。五、实验报告1.根据上述方法及步骤检查所给水样中大肠菌群细菌的含量。2.测定水中大肠菌群数有什么实际意义？为什么选用大肠菌群作为水的卫生指标？采样稀释初发酵：乳糖胆盐发酵管，35~37℃18~24h不产酸产酸结论：大肠菌群阴性EMB平板，35~37℃18~24h革兰氏染色乳糖发酵管，35~37℃24±2h革兰氏阳性革兰氏阴性，无芽孢杆菌产酸不产酸结论：大肠菌群阴性结论：大肠菌群阳性结论：大肠菌群阴性图5-1大肠菌群的检验程序 大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN阳性管数MPN1ml×30.1ml×30.01ml×3个/dL1ml×30.1ml×30.01ml×3个/dL000＜3020090001302011400026020220000390203260010302101500116021120001290212270013120213340020602202100219022128002212022235002316022342003090230290031120231360032160232440033190233530100403002301017030139010211030254010315030395011070310430111110311750112150312120011319031316001201103209301211503211500122200322210012324032329001301603302400131200331460013224033211000133290333＞24000 a)水中细菌总数的测定一、目的要求学习掌握平板菌落计数的原理和方法。二、实验材料1.菌液：大肠杆菌菌悬液2.培养基：营养琼脂培养基，无菌生理盐水3.1ml、10ml无菌移液管，无菌培养皿等三、基本原理平板菌落计数法是根据在固体培养基上形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的肉眼可见的子细胞群体这一微生物的培养特征而设计的一种计数方法。将样品进行不同稀释，使微生物分散并以单细胞存在。再用一定量的稀释液涂布于平板上，培养后，每一个活细胞即能形成一个菌落。统计菌落的数目，根据稀释的倍数及取样接种量即可换算出样品中的含菌数。现在倾向用菌落形成单位（colony-formingunits，cfu）来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法可用于测定单细胞或单孢子微生物菌液的浓度，成品检验和水质检查。四、操作步骤1.编号：取无菌培养皿9套，每3套为一组，在每组皿底分别写上10-1、10-2、10-3。另取3支无菌空试管排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3，并向试管中各加入9ml无菌生理盐水。2.稀释：用1ml无菌吸管精确地吸取1ml已充分混匀的菌悬液，注入10-1试管中（注意吸管不要碰到水面）。然后另取1支无菌吸管，于10-1试管中来回吹吸三次，使之混匀，即成10-1稀释液。再从10-1试管中吸1ml注入10-2试管中，重复上述操作，直至制成10-3稀释液。3.取样：用三支1ml无菌吸管分别吸取10-1、10-2和10-3稀释液各1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。4.倾注平板：尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的营养琼脂培养基，每皿约15ml，置水平位置迅速旋转平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出或溅到皿盖上。5.培养：待培养基凝固后，倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。6.计数：数各皿中菌落数，算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数，按下述报告计算结果。菌落数报告原则：1）选择平均菌落数在30~300之间的稀释度，乘以稀释倍数。2）若有两个稀释度的菌落数均在30~300之间，则应视二者菌数之比值如何。如果比值小于2.0，应报告其平均数；如果比值大于2.0，则报告其中较小的数字。3）如所有稀释度的菌落数均大于300，则应以稀释度最高的平均菌落数计算。4）如所有稀释度的菌落数均小于30，则应以稀释度最低的平均数菌落计算。5）如果所有稀释度的菌落数均不在30~300之间，其中一部分大于300，一部分小于30，则应以最接近30或300的平均菌落数计算。6）菌落总数在100以内，按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，后面的数字四舍五入处理，为了缩短数字的长度，可用10的指数来表示。 菌落数的报告方式项目例次各稀疏度平均菌落数两稀释度菌落之比菌落总数（CFU）报告方式（CFU）10-110-210-311,36516420－16,4001.6×10422,760295461.637,7503.8×10432,890271602.227,1002.7×1044不可计4,650510－510,0005.1×105527115－2702.7×1026不可计30512－30,5003.1×104五、实验内容用上述方法测定中的活细菌含量。六、实验报告1.记录各稀释平板上的菌落数，并计算出样品中的细菌含量。2.为什么融化后培养基要冷却到50℃左右方可倒平板？过冷或过热行不行？为什么？3.为使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？4.同一酵母菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？进一步比较两种计数法的优缺点。