第七讲 生物碱分析

第七讲生物碱分析生物碱分布■含生物碱较多的科有粗榧科、毛莨科、小檗科、防已科、罂含生物碱较多的科有粗榧科、毛莨科、小檗科、防已科、罂粟科、豆科、马钱科、夹竹桃科、茄科、菊科、百合科和石蒜粟科、豆科、马钱科、夹竹桃科、茄科、菊科、百合科和石蒜科等。有些科几乎全科植物均含生物碱，如罂粟科。同一科属或亲缘关系相近的植物中往往含有相同或相似的生物碱，如茄或亲缘关系相近的植物中往往含有相同或相似的生物碱，如茄科的颠茄属(AtropaAtropa)、曼陀罗属(DaturaDatura)、莨菪属(HyoscyamusHyoscyamus)、东莨菪属(ScopoliaScopolia)等属的植物都含有莨菪碱(hyoscyaminehyoscyamine)。■同一种生物碱也可分布于不同科中，如在毛莨科、小檗科、防已科与芸香科的一些植物中都有小檗碱。已科与芸香科的一些植物中都有小檗碱。■生物碱可存在于植物体内各个器官中，同种植物中所含生物碱常不止一种，有的可含数种至数十种，如罂粟约含25种生物碱，长春花中含70余种生物碱。■生物碱在植物体内各部分中分布是不相等的，往往集中于某一器官或某一部分中。如乌头（根）、黄连（根茎）、黄柏（树皮）、颠茄（叶）、麻黄（地上茎）、洋地黄（花）、吴茱萸皮）、颠茄（叶）、麻黄（地上茎）、洋地黄（花）、吴茱萸（果实）、马钱子（种子）等。在同一植物的不同部分，不但生物碱的含量有差异，而且生物碱的种类也可能不同。特点■生药中生物碱的含量大多低于1%，有少数含量特别低，如长春花中长春新碱含量为百万分之一，美登木中美登木素含量为千万分之一；也有些含量特别高，如黄连中小檗碱含量可达9%、金鸡纳皮中奎宁含量高达15%。在植物体内，生物碱一般与有机酸（苹果酸、枸橼酸、酒石酸等酸和鞣酸等）结合成盐类，呈溶解状态存在于液泡中，有些是与糖结合成甙而存在，更有少数生物碱是呈游离状存在的，如咖啡碱(caffeine)与秋水仙碱(colchicine)等。生物碱是生药中一类重要的有效成分，目前已分离到10000余种，其中80余种已用于临床，如黄连中的小檗碱(berberineberberine)用于抗菌消炎，麻黄中的麻黄碱(ephedrine)用于平喘，萝芙木中的利血平(reserpinereserpine)用于降压，喜树中的喜树碱(camptothecine)与长春花中的长春新碱(vincristine)用于抗肿瘤等。分类——按母核的基本结构来分类，主要有以下12类：(1)有机胺类(Amines)：氮原子位于直链上，如麻黄碱、益母草碱、秋水仙碱等；(2)吡咯烷类(Pyrrolidine)：如古豆碱、千里光碱、野百合碱等；(3)吡啶类(Pyridine)：如菸碱、槟榔碱、半边莲碱、苦参碱；(4)喹啉类(Quinoline)：如奎宁、喜树碱等；(5)异喹啉类(Isoquinoline)：如小檗碱、吗啡、粉防已碱、石蒜碱、可待因、青藤碱、锡生藤碱等；(6)喹唑酮类(Quinnazolidone)：如常山碱等；(7)吲哚类(Indole)：如利血平、长春碱、麦角新碱、士的宁；(8)莨菪烷类(Tropane)：如莨菪碱、东莨菪碱、古柯碱等；(9)亚胺唑类(Imidazole)：如毛果芸香碱等；(10)嘌呤类(Purine)：如咖啡碱、茶碱、香菇嘌呤等；(11)甾体类(Steroid)：如茄碱、贝母碱、藜芦碱；(12)萜类(Terpenes)：如猕猴桃碱、石斛碱、乌头碱、飞燕草碱、黄杨碱等。 理化性质1.性状大多数生物碱为结晶状固体，少数为液体，如菸碱、毒藜碱、槟榔碱等。液体生物碱通常不含氧原子，或分子中的氧原子多形成酯键。一般生物碱均无色，少数具颜色，如小檗碱（黄色）、血根碱（红色）。味苦。少数生物碱，如麻黄碱与液体生物碱具挥发性，可随水蒸气蒸馏。2.旋光性大多数生物碱具左旋光性。3.酸碱性一般是季胺碱＞叔胺碱＞仲胺碱。若氮原子呈酰胺状态，则碱性极弱甚至消失，如胡椒碱、秋水仙碱等。有的生物碱分子具有酚羟基或羧基，因而具酸碱两性，如槟榔次碱(arecaidine)和吗啡等。4.溶解度游离生物碱极性较小，不溶或难溶于水，能溶于氯仿、乙醚、苯、丙酮、乙醇等有机溶剂，也能溶于稀酸的水溶液而生成盐类。生物碱盐类易溶于水和乙醇，不溶或难溶于有机溶剂。5.沉淀反应(1)碘化铋钾试剂(2)碘-碘化钾试剂(3)碘化汞钾试剂(4)硅钨酸试剂(5)磷钼酸试剂(6)苦味酸试剂(7)氯化金试剂6.显色反应常用的显色剂如下：(1)矾酸铵-浓硫酸溶液(Mandelin试剂)：为1%矾酸铵的浓硫酸溶液。该试剂能与多数生物碱反应，呈现不同的颜色，如与阿托品、东莨宕碱显红色，与马钱子碱显血红色，与士的宁显紫色，与奎宁显淡橙色，与吗啡显棕色，与可待因显蓝色。(2)钼酸铵（钠）-浓硫酸溶液(Frobde试剂))：为1%钼酸铵或钼酸钠的浓硫酸溶液。该试剂能与可待因显黄色，与小檗碱显棕绿色，与乌头碱显黄棕色，与阿托品及士的宁不显色。在使用时应注意，该试剂与蛋白质也能显色。(3)甲醛-浓硫酸试剂(Marquis试剂)：为30%甲醛溶液0.2ml与浓硫酸10ml的混合液。该试剂能与可待因显蓝色，与吗啡显紫红色，与咖啡碱不显色。(4)浓硫酸：该试剂能与乌头碱显紫色，与小檗碱显绿色，与阿托品不显色。(5)浓硝酸：该试剂能与小檗碱显棕红色，与秋水仙碱显蓝色，与乌头碱显红棕色，与咖啡碱不显色。含量测定：欲测定生药中的生物碱含量，首先应将其从植物组织中定量的分离出来，精制后选择合适的方法进行测定。1.生物碱的提取非极性溶剂极性溶剂混合溶剂2.生物碱试样的精制萃取法色谱法离子对法3.生物碱的定量分析：■生物碱的定量分析方法大多是根据它含有的N原子或双键或分子中官能团理化性质而设计的。 测定总碱的方法一、重量法碱性极弱的生物碱或总碱。如元胡中的总生物碱，用氨水、氯仿提取后，挥去溶剂，按重量法测定。本法又可分为提取重量法和沉淀重量法。1、提取重量法通常将生物碱提取出来并精制后，将提取液放置已知重量的容器中，除去溶剂，干燥后称量，即可得到生物碱或总碱的含量。2、沉淀重量法利用生物碱沉淀剂将生物碱沉淀出来，然后洗涤，干燥，称定沉淀的重量，计算出生物洗涤，干燥，称定沉淀的重量，计算出生物碱或总碱的含量。常用的沉淀剂有苦味酸，碱或总碱的含量。常用的沉淀剂有苦味酸、硅钨酸、四苯硼钠及雷氏铵盐等。二、容量法1、中和滴定法当所测定的生物碱碱性较强时，可用适当方法将提取出来的单生物碱或总碱转化为游离碱而转溶于有机溶剂，然后挥去溶剂，残渣加过量标准酸液，再用标准碱回滴，或不挥去溶剂，而加过量酸水，将生物碱转溶于酸水中，分离出酸液，有机层再以水分提取，合并水提取液和酸提取液，再以标准碱溶液滴定，也可用中性乙醇将提取出来的生物碱残渣直接溶解，然后用标准酸直接滴定。如北豆根片用乙酸乙酯提取，蒸干，残渣溶于无水乙醇，以碱量法测定山豆根碱含量。2、非水滴定法由于许多生物碱在水溶液中显示的碱性较弱，难以进行中和滴定。这时，可考虑采用非水碱量法。如《中国药典》1995年版中，苦参中苦参碱的含量测定，麻黄中麻黄碱的测定，罂粟壳中生物碱的测定，颠茄草中莨菪碱的测定。小檗胺以丙酮或醋酐-冰醋酸(1：1：5)为溶剂，甲橙或结晶紫为指示剂用高氯酸标准液进行滴定。3、雷氏盐法生物碱在酸性溶液中能与雷氏盐即硫氰化铬铵定量的发生沉淀，滤取沉淀洗净后溶于丙酮，与碱性酒石酸钾钠或2M氢氧化钠液注沸而使其分解，定量释出SCN-，加硝酸酸化，加入过量的硝酸银标准溶液，用铁钒作指示剂，然后用硫氰酸铵液将剩余的硝酸银滴定，从而间接测定生物碱的含量。4、四苯硼钠法大多数解离常数大于10-11的生物碱阳离子都可与四苯硼钠定量地形成沉淀，在丙酮或其它有机溶剂中甚易溶解，而四苯硼钠与银离子所形成的络合物在水及丙酮或其它有机溶剂中溶解度极小。因此，可将生物碱的四苯硼盐溶于丙酮，在弱酸中以曙红为指示剂，以硝酸银进行置换滴定。三、比色法生物碱能与多种试剂发生颜色反应，用有机溶剂提取后，可进行比色测定。这种方法的灵敏度高，所需样品量少，有一定的专属性和准确性，所以该法在生物制剂中应用较多。1、酸性染料比色法在适当的pH介质中，生物碱可与氢离子结合成盐，一些酸性染料在此条件下、解离为阴离子，而与生物碱的阳离子定量地结合成有色的离子对，此离子对可溶于某些有机溶剂，生成有色的溶液，测定溶液的吸收度，即可按比色法计算有机碱的含量。如硫酸阿托品片，平喘Ⅱ号中麻黄碱，止咳糖浆中麻黄碱，在适当pH介质中，与溴麝香草酚蓝作用，甲苯或氯仿提取后于波长403nm处测定阿托品，测定阿托品，422nm或420nm处测定麻黄碱。 2、雷氏盐比色法3、络合物比色法4、苦味酸盐比色法四、紫外分光光度法对中药及其制剂中的生物碱，多采用的是双波长法、三波长法、正交函数法，导数光谱以消除众多已知或未知杂质的干扰，如生药中麻黄碱可用一阶导数光谱法来测定，胶囊中的宁可采用三波长发等等。五、薄层色谱——分光光度法1、比色法如一叶荻碱，在氧化铝薄层板上，用氯仿展开，分离后再与溴甲酚绿作用，形成有色离子对，用氯仿提取后，进行比色测定。苦豆草中含苦豆碱、苦参碱、槐果碱和槐定碱四种成分，在氧化铝薄层板上，用苯—丙酮—乙醇（70：16：1）展开剂，展开后，以改良碘化铋钾试剂显色，所得各斑点刮下后溶于溶剂进行比色测定。2、紫外分光光度法荜茇中胡椒碱用乙醇提取。点样于硅胶G板上，以苯—乙酸乙酯—丙酮（7：2：1）展开，分离出胡椒后于343nm处测定。延胡索中脱氧延胡索碱和巴马亭，用含甲酰胺的硅胶G为固定相，以氯仿—正丁醇（9：1）展开，两者分离后用稀硫酸洗脱，在270nm处测定脱氢延胡索碱，274nm处测定巴马亭含量。3、荧光法止咳喘热参片中莨菪亭和阿托品类生物碱，用乙醇提取后，点于板上，用氯仿—甲醇—氨水（8.5：1.5：0.07）展开，挥去溶剂后在荧光灯下观察，莨菪亭的Rf=0.88，显亮蓝色荧光，以Ex=330nm，Em=450nm进行荧光法测定。测定指定成分的含量六、薄层色谱扫描法在薄层色谱上，直接测定有效成分的光吸收度或荧光强度，计算出待测成分的含量。该法较薄层色谱—分光光度法简便、灵敏、稳定性好，按检测方法也可分为以下三种。1、比色法2、紫外分光光度法3、荧光法七、气相色谱法衍生化后进样法。如USP(XXⅡ)对颠茄流浸膏例如：BP(1998)对硫酸吗啡注射液的含量测定。例如，颠茄类生物碱中的莨菪碱、东莨菪碱和樟柳碱用N—甲基—3甲硅烷乙酰胺硅烷化试剂，衍生化后得到其三甲硅醚衍生物，然后用GC—MS联用技术进行定量分析。八、高效液相色谱法１、RP—HPLC硅醇基，导致色谱峰拖尾，保留时间过长，甚至长期地保留在色谱柱上。(1)相中添加有机胺或季铵盐(2)流动相中添加离子对试剂常见的离子对试剂为：烷基磺酸盐等。(3)调节流动相pH或缓冲液类型和浓度对于强碱性生物碱的分离，流动相pH宜为3.5－5.5，大多数情况下，钾盐优于钠盐缓冲液，浓度宜在0.01—0.1mol/L。2、离子交换色谱对生物碱类药物的HPLC分析，可使用固定相为烷磺酸键合的硅胶进行离子交换色谱分析。3、正相色谱例如：在马钱子碱和土的宁的测定，采用YWG—80作为固定相，以乙醚—甲醇— 氨水（80：20：1）为流动相，于250nm处检测。九、极谱法例如，黄连素的含量测定，可将黄连素与四苯硼钠反应，以0.02mol/LTl2SO4为滴定液，进行示波极谱法测定。马钱子碱、乌头碱在硫酸钡存在下，加磷钼酸试剂沉淀，再用硫酸消化，以极谱法测定残余物中的钼，从而计算生物碱的含量。十、高效毛细管电泳(HPCE)高效毛细管电泳虽然在定量准确性上较HPLC略差，但由于其具有柱效高，分析速度快，节省溶剂和样品等特点，因而特别适用于复杂的中药成分分析。示例：苦参中药苦参指纹图谱和苦参生物碱在动物体内药代动力学及代谢的研究一、中药苦参（SophoraflavescensAit.）概述化学成分（略）苦参碱型生物碱的基本结构：略二、LC-MS在中药苦参指纹图谱建立中的应用■液-质联用（HPLC-MS）是一种集高效分离与高灵敏度、高选择性检测于一体的现代分离分析手段。LC-MS技术对于中药指纹图谱研究中实验条件的选择与优化，药材提取方法的研究，中药成分的归属等均起着重要的作用。其余略。具体见课件。