中短链脂肪酸脂质体的制备可行性研究报告

'中短链脂肪酸脂质体的研究可行性报告23 一、选题的必要性1、项目所处技术领域产业政策我国大力扶持医药产业的发展。“十五计划纲要”指出，要大力发展医药产业，并将医药现代化列为应“有所为”的高科技产业化范畴；国家“十五”期间，将重点发展中药、生物工程药物和优势化学原料药，其中中药被列为医药行业发展的首要任务。根据国家的产业政策，我国已将生物医药产业作为经济中的重点建设行业和高新技术中的支柱产业来发展,对一些科技发达或发展较快的行业给与了高度的重视。医药产业作为国家重大战略产业地位将更加突出，国家将支持医药产品结构的战略性调整，支持疗效确切、原创性强的医药大品种的产业化开发，鼓励企业采取新技术新工艺及新设备，提高中药行业的科技创新能力和产业化能力，提升医药产品的科技含量和市场竞争力。国家大力支持利用尖端的药物控释缓释技术，药物给药系统技术和药物制剂技术，加速中国发现新型制剂新药的进程。建立和进一步加强在药物控释缓释技术，靶向给药技术和临床研究领域的领先地位。脂质体是一种以细胞膜基本成分磷脂为材料的新型的药物输送系统，因其具有良好的生物相容性和安全性，并且制备技术日益成熟，在抗癌药物，抗病毒药物以及生物工程药物，如蛋白，多肽等的有效输送方面具有其他给药系统难以比拟的优越性。因此近年来，该技术越来越引起了人们的重视，并得到了飞速的发展。目前发展较快的靶位给药制剂，有前体药物全盛途径和药物载体(单克隆抗体、脂质体等)不少已进入临床研究或应用阶段。脂质体具有缓释、控释、提高药物稳定性，增强疗效降低毒副作用等方面的优越性，同时在生物体内及贮存过程中较稳定。近年来，脂质体在基础理论及应用上有重要意义，它能改变许多生物活性物质如抗肿瘤药、抗炎药、免疫调节剂、基因类药物等的体内转运过程，现已广泛用于基因药物、抗肿瘤药、蛋白质和多肽等药物的载体系统。它的使用途径很广，既可口服、注射，也可局部应用。现已有脂质体、固体脂质纳米粒、胶束、微乳等体系供临床使用。23 同时由于中短链脂肪酸特有的生理特性，将其制成脂质体符合国家产业政策、当前和今后一个时期有较大的市场需求，有广阔的发展前景，有利于开拓国内外市场。2、项目所处技术领域技术发展现状2.1脂质体的研究发展现状1935年，Bangham博士曾申请专利将药物置于卵磷脂/胆固醇中乳化以便缓慢释放，但是由于当时检测微观结构落后，他并没有发现这一结构，直到1965年他才观察到这一特点，并将其命名为脂质体。自从1970年，Sessa等认为脂质体可以作为药物载体，1971年Rymen等人将脂质体作为药物载体应用以来，脂质体引起了世界各国学者的关注。随着生物技术的不断发展脂质体制备工艺的不断完善，脂质体这种新型药物载体，在医药界得到了日益广泛的关注，并取得了长足的进展与发展，得到了广泛的研究与应用。我国80年代开始进行脂质体的研究工作。近年来，对脂质体的研究领域逐渐扩大和不断深入，发表了脂质体的作用特点及应用、作为抗癌药物载体的研究概况、两性霉素B脂质体对小鼠白色念珠菌感染的治疗观察、一种新型聚合膜脂质体、脂质体的冷冻与干燥、载脂蛋白/卵磷脂脂质体对培养的平滑肌细胞内胆固醇的清除作用、脂质体的物理化学稳定性研究进展、新型的皮肤给药系统——脂质体、脂质体作为药物载体的作用、应用和发展前景等一系列综述。国内新近研制脂质体涉及的药物有喜树碱、多糖、丝裂霉素、油酸、顺铂、氟糖啶、谷兹醇、南氟啶、青蒿酯、三磷酸腺苷、依托泊苷、白细胞介素-2、低分子肝素、氧氟沙星、阿霉素、维甲酸、黄连素、人参皂甙、汉防己甲素、黄岑、5-氟脲嘧啶、靛玉红、足叶玉甙、甲氨蝶呤、伯氨喹、三尖杉酯碱、双参、环磷酰胺等，特别是是中药或天然药物脂质体制品已引起世界的瞩目。目前，脂质体技术的开发研究，大多集中于院校和研究所，比如，上海药物研究所的侯惠民院士，沈阳药科大学的顾学裘教授和邓英杰教授，南京药科大学的朱家璧教授，北京大学的魏树礼教授等，在脂质体研究方面形成了自有的一套体系，23 也取得了很大的进展。如沈阳药科大学在脂质体抗肿瘤药物的研究方面取得了多项成果，包括油酸多相脂质体、复方氟脲嘧啶多项脂质体、喜树碱多项脂质体等，还在人参多糖和双多糖脂质体、热敏磁性脂质体、阿霉素热敏脂质体、氟尿嘧啶热敏脂质体和甲氨蝶呤热敏脂质体、顺铂热敏脂质体方面进行了很多研究。2.2中短链脂肪酸的研究现状中短链脂肪酸是指碳数为4－12的饱和脂肪酸，它们对血清胆固醇没有影响。它们吸收后可经动脉进入肝脏直接作为能源。且短链脂肪酸还具有促进粘膜血流的增加；促进肠上皮细胞增殖，促进消化道蠕动等生理功能。而中链脂肪酸具有极好的消化吸收性以及生理学特性，在食品、医药、化妆品等领域中显出较广阔的应用前景。有人曾对山羊奶的中短链脂肪酸进行研究表明中短链脂肪酸具有独特的医用价值，可抑制胆固醇沉积，预防和治疗吸收不良综合症、肠功能紊乱、冠心病、早产儿营养不良症、膀胱的纤维变性、胆结石等疾病。1短链脂肪酸（SCFA）的研究现状1.1促进水钠吸收。肠道管饲养时，由于大部分配方中碳水化合物都在小肠吸收，导致结肠饥饿，SCFA生成减少，结肠粘膜营养不良，低水钠吸收，易发生腹泻。非离子化酸HSCFA的吸收可促进Na+-H交换，刺激Na+的吸收。Na+的吸收又刺激了SCFA-的吸收。结肠粘膜上皮细胞对Na+吸收增加，继而增加水的吸收。1.2增加肠血流。SCFA可促进结肠血供，有报道指出，结肠造口术后，直肠灌注短链脂肪酸每日两次共14天，病人的结肠粘膜血流量增加。且由于术后给予短链脂肪酸，增加了切除边缘的肠粘膜微循环血量，还可降低渗漏的危险。因此短链脂肪酸可增加粘膜损伤处的循环血流，从而促进其结构、功能的恢复。1.3提供能源底物。23 SCFA作为首选的代谢性燃料，可提供结肠粘膜总能量需要的70％，其中丁酸是大鼠结肠细胞首选能源物质。丁酸氧化主要在远端结肠进行。人类结肠细胞对能源物质的选择与大鼠中的发现类似。1.4在肠道外科应用。1989年Haring对难治性远端溃疡性结肠炎病人直肠灌注SCFA后发现其组织学明显改善。英国的Patz等通过实验发现采用三种短链脂肪酸（乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐）溶液灌肠治疗难治性远端溃疡性结肠炎能收到良好的疗效。李可洲等研究了SCFA对大鼠移植小肠萎缩及供能低下的预防作用。实验结果表明SCFA对移植小肠形态及吸收功能均有一定的支持作用。此外短链脂肪酸不仅对结肠粘膜有营养作用，对小肠粘膜也有营养作用。大鼠小肠部分切除后，对短肠大鼠肠外给予短链脂肪酸，可阻止肠粘膜萎缩。1.5抑制肿瘤，抗癌。SCFA作为饮食纤维酵解后的主要成分对预防结肠癌的发生具有重要作用。傅红等以人结肠癌Caco-2细胞为模型，发现醋酸盐、丙酸盐及丁酸盐3种短链脂肪酸均可影响人结肠癌细胞的表现，显著延长肿瘤细胞倍增时间，增强癌细胞分化标志物组蛋白酶的表达，并明显抑制癌细胞的转移丁酸能在毫摩尔浓度下发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡的作用，并且还能抑制肿瘤新生血管形成，在动物实验中也尚未发现可知的药物毒性。1.6作为饲料添加剂，控制肠炎沙门氏菌等病原微生物。日本的蕃场和宫川报告，给4周龄的产蛋鹌鹑喂食含0.2％－1.6％丙酸的饲料，可显著抑制伤寒沙门氏菌在肠道内的繁殖，而给予乳糖、甘露糖或乳酸菌制剂无效。若在饲料中添加短链脂肪酸可提高家畜的生长速度，降低单位增重耗料量；降低骨折、破骨现象的发生率，增加钙镁离子的吸收。2.2中链脂肪酸的研究现状由于中链脂肪酸极好的消化吸收及生理学特征，在食品、医药、化妆品等领域中显出了较23 广阔的应用前景。在鸡饲料中添加一定比例的中链脂肪酸，可提高鸡的采食量、提高产蛋率、增加蛋重、降低破壳率。特别是在肉鸡饲料中效果更理想，不影响增重，又能抑制体脂肪的形成，改善肉质。且添加了中链脂肪酸的饲料还能有效的抑制原虫引起的疾病，尤其鸡球虫病的发生。初生仔猪从出生到断奶期间有15－20％死亡，弱小仔猪的死亡率高达50％，导致初生仔猪死亡率高的一个重要因素是仔猪的营养状况不良，体内的能量储备有限，不能满足机体需要。中链脂肪酸可以作为快速补充能量的物质被直接利用供能，同时可减少体脂和蛋白质的消耗。通过实验发现中链脂肪酸对仔猪成活率可提高10％以上，对日增重可提高3％以上，对降低仔猪的死亡率提高仔猪日增重有较大的作用。MCFA用于初生弱仔猪，有提高血糖的功效，但对较强壮的猪则没有作用。也用以长途运输雏鸡饮水，可起到供能的作用。纯的MCT不含有必需脂肪酸，应用后引起血栓性静脉炎、面部潮红、恶心、脑电图改变、脑病、乳酸酸中毒，甚至动物死亡。一般减少剂量，减慢输液速度或可避免副作用发生。3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用本项目在研究过程中，以中短链脂肪酸为原料，分别用薄膜分散法、改良乙醇注入法、逆相蒸发法、冻融法制备脂质体悬浮液，得出制备脂质体的最佳工艺和配方；然后将制得的脂质体进行冷冻干燥，确定冻干条件，分别添加并比较几种冻干保护剂（山梨醇、葡萄糖、甘露糖、海藻糖），通过稳定性、包封率等指标确定制备中短链脂肪酸脂质体产品的生产工艺。解决了脂质体在制备过程中颗粒较大且不均匀、包封率较低的问题；将脂质体悬浮液经过真空冷冻干燥技术制成冻干脂质体解决了悬浮液不稳定的缺点；抑制了冻干产品在冷冻干燥过程中的聚合。项目技术的先进性表现在有效解决以下几个问题：第一、通过正交试验，将几种表面活性剂进行复配，而不是用单一的表面活性剂，从而改变了各种表面活性剂的乳化效果，使得脂质体悬浮液粒度分布更均匀，并且使被包封的中短链脂肪酸增加，从而有效地提高了包封率。第二、制备的脂质体溶液属于热力学不稳定体系，通常在短时间内会出现粒径增大、团聚、水解等现象，若将其干燥成固体可有效提高脂质体的化学稳定性，保持原有粒径，避免水解。常用的干燥方法有冷冻干燥和喷雾干燥，23 由于在喷雾干燥过程中的高温、高剪切力和脂质的部分融化，易造成粒子团聚，所以尽管喷雾干燥较冷冻干燥法更经济，但较少用于脂质体的干燥，所以采用真空冷冻干燥方法将脂质体悬浮液进行干燥，从而提高了脂质体的稳定性。第三、样品经冷冻干燥变成固态后，具有更好的化学和物理稳定性，但由于其再增溶作用，粒子由于处于一个低含水量、高粒子浓度、高渗透压的环境中，易发生聚合。因此在冷冻干燥时应加入适量的冷冻防护剂，抑制粒子的聚合，使干燥后产品有更好的分散性。常用的冷冻防护剂有山梨醇、葡萄糖、甘露糖、海藻糖等。3、项目目前进展情况。目前，脂质体研究已经在各个制药领域广泛开展，该类药物新剂型已经被广泛的应用于抗癌药物、抗菌药物、抗寄生虫药物、激素类药物、酶、解毒剂、免疫激活剂以及抗结核药物的研究中。另外，因为脂质体具有生物膜的特性和功能，使它不仅作为一种新剂型应用与疾病的治疗和诊断中，而且在生物物理、生物化学、免疫学研究、免疫诊断及化妆品等许多领域中都有应用。随着脂质体技术的不断发展，各种各样新型的脂质体已经被研制出来，如pH敏脂质体、免疫脂质体、磁性脂质体、光敏脂质体、超声波敏脂质体等。目前，这种药物新剂型在兽药领域内也得到了一定的发展。本项目“中短链脂肪酸脂质体的研究”目前已完成小试阶段，准备进行中试放大研究。二、技术方案论述1、项目技术关键点或创新点论述，项目完成时达到的技术水平项目创新点：①首次以中短链脂肪酸为原料，制备纳米脂质体，科学有效的利用了脂质体靶向性、长效性、保护性等特点。②通过真空冷冻干燥法制备了固体中短链脂肪酸脂质体，改变了脂质体悬浮液的不稳定性，便于储存运输。③本项目对中短链脂肪酸脂质体23 的流变学特性进行了研究，并揭示中短链脂肪酸含量与其粘度的关系本项目达到的技术水平：开发出具有一定生理功能，商业价值高的中短链脂肪酸脂质体的冻干产品，开发出适合不同用途的中短链脂肪酸脂质体产品,可作为脂肪吸收障碍的患者及发育不好的婴幼儿等的能源物质，或作为体育运动者的能量补充源。若将其添加于饲料中，可降低初生仔猪死亡率，提高日增重，减少畜禽肠道疾病的产生，从而提高农民的收入。项目水平将达到国内领先水平。2、项目技术方案论述：生产技术、工艺流程、主要技术参数生产技术：（1）摸索气相色谱法测定中短链脂肪酸的条件，并对原料中短链脂肪酸进行测定；（2）通过正交实验得出制备脂质体的最佳工艺，制备出稳定性好的中短链脂肪酸脂质体；（3）研究中短链脂肪酸脂质体流变学特性，并揭示中短链脂肪酸含量与其粘度的关系；（4）通过中短链脂肪酸脂质体粒径、Zate电位、包封率等性质的测定考察所制备脂质体的稳定性；（5）开发中短链脂肪酸脂质体冻干产品。工艺流程：1、采用气相色谱对原料中短链脂肪酸的组成及含量进行分析。目前鲜见关于气相色谱法同时测定中、短链脂肪酸含量和组成的报道，为了对原料的组有一个全面的了解，我们摸索了气相色谱法测定中短链脂肪酸的组成及含量的方法①23 脂肪酸的甲酯化：采用硫酸-甲醇法对原料中短链脂肪酸进行甲酯化。在装有脂肪酸混合样的梨形瓶中，加入硫酸-甲醇溶剂，在沸水浴上冷凝回流酯化1h，移入分液漏斗中，加入蒸馏水，用石油醚萃取脂肪酸甲酯三次。合并石油醚于另一分液漏斗中，用蒸馏水洗涤至中性，低温冷冻除去水分，将石油醚转入另一梨形瓶中，去除溶剂，加入二氯甲烷溶液，供色谱分析检测。②气相色谱检测：采用Agilent6890N气相色谱仪，FID检测器。选用30×0.25mm(id)HP-INNOWAX毛细管柱进行分析，初始温度为120℃保持1min，然后以10℃/min的速度升温至250℃并维持5min。检测器温度为280℃，进样口温度为250℃,进样量为1μL。载气为氦气，流速为1.8mL/min.用Agilent6890N化学工作站作为数据接收处理系统③根据出现色谱峰的保留时间，定性判断脂肪酸种类及组成，用面积归一法进行脂肪酸定量分析，所得结果为每千克总脂肪酸中所含的各种脂肪酸的量。2、中短链脂肪酸脂质体包封率的检测①悬浮液包封率的测定采用透析法分离游离药物,收集透析液，并将透析液经行前处理，然后用气相色谱法测定其中游离的中短链脂肪酸的含量。计算包封率.包封率%=（总加入量－游离脂肪酸的量）/总加入量×100%②冻干脂质体包封率的测定先将冻干脂质体重新分散于磷酸缓冲液中，然后测定其包封率。3、脂质体悬浮液的制备（1）中短链脂肪酸脂质体制备方法的确定在预实验的基础上，采用相同配方条件，分别用薄膜分散法、改良乙醇注入法、逆相蒸发法、冻融法制备脂质体悬浮液。①薄膜分散法按一定比例称取大豆磷脂、胆固醇、中短链脂肪酸适量，将其置于茄形烧瓶中。加入二氯甲烷使其溶解，在45℃23 水浴下旋转蒸发使之均匀成膜；加入一定量的PH6.8的磷酸缓冲液洗膜，直至形成牛奶状液体，即得脂质体。停止洗膜后，超声处理，置冰箱内保存。②改良乙醇注入法按一定比例称取中短链脂肪酸、磷脂、胆固醇适量，溶于适量的乙醇中，加热使其溶解。在搅拌条件下，将恒温至一定温度的磷酸盐溶液快速注入到类脂溶液中。注射完毕后，继续搅拌直至无乙醇味为止。即得到中短链脂肪酸脂质体胶体溶液。③逆向蒸发法按一定比例称取大豆磷脂、胆固醇、中短链脂肪酸适量，将其置于茄形烧瓶中。加入二氯甲烷使其溶解，在加入磷酸缓冲液并在超声波清洗机中进行超声使之成为牛奶状液体；再在45℃水浴下旋转蒸发除去有机溶剂；再加入磷酸缓冲液直至成为牛奶状液体，停止洗膜，置冰箱保存。④冻融法该法前面步骤同逆向蒸发法，洗膜后，置于低温冰箱中冷冻，冷冻后取出室温下融化，融化完毕，充分震荡，反复冻融3次；置冰箱4℃保存。比较各种方法所制得脂质体的包封率、粒径、稳定性，选定一种可行的制备方法。对选定的制备方法以包封率、粒径、分散性为指标对脂质体配方进行优化，首先选定水化温度、水化时间、胆固醇与磷脂的比、中短链脂肪酸与膜材的比、水相与油相的比五个因素进行单因素实验。然后从中选出对脂质体包封率影响较大的三个因素进行均匀设计。从而得出制备脂质体的最佳工艺。（2）验证试验采用选定的最佳工艺制备脂质体，并检测其包封率与预期包封率对比，进行验证实验。4、冻干脂质体的制备23 将制得的脂质体进行冷冻干燥，确定冻干条件。分别添加以下几种冻干保护剂（山梨醇、葡萄糖、甘露糖、海藻糖），通过稳定性、包封率等指标比较各种冻干保护剂的对中短链脂肪酸脂质体的影响。并比较冻干前后脂质体包封率、分散性能的变化。5、脂质体理化性质及初步稳定性的研究（1）用粒度分析仪及电镜观察测定脂质体的形态、粒径范围及分布。（2）采用硫代巴比妥酸法测定磷脂的过氧化值。过氧化值可以反应脂质体中脂质材料的氧化程度，是评价脂质体化学稳定性的重要指标。（3）Zeta电位测定仪测定脂质体的Zeta电位，Zeta电位绝对值高溶液越稳定。（4）脂质体稳定性的测定①不同储存时间脂质体悬浮液及冻干脂质体的外观（颜色、悬浮液是否分层、颗粒形态）、粒径、包封率、粘度、zate电位、及过氧化值的变化。②不同储存温度下脂质体悬浮液及冻干脂质体外观（颜色、悬浮液是否分层、颗粒形态）、粒径、包封率、粘度、zate电位、pH值及过氧化值的变化。①不同pH条件下脂质体的稳定性（取粒径、包封率、Zate电位值作为考过滤2、项目技术质量指标：项目产品达到的主要技术性能指标、执行的质量标准、通过的国家相关行业许可认证等本项目预期达到的目标：制备的中短链脂肪酸脂质体悬浮液呈乳白色，平均粒径200-300nm,Zeta电位数值小于-40，包封率大于80%。开发出适合不同用途的中短链脂肪酸脂质体产品,可作为脂肪吸收障碍的患者及发育不好的婴幼儿等的能源物质，或作为体育运动者的能量补充源。若将其添加于饲料中，可降低初生仔猪死亡率，提高日增重，减少畜禽肠道疾病的产生，从而提高农民的收入。考核的主要技术经济指标：产品执行国家行业标准。本项目通过省级鉴定，成果水平处于国内领先水平。在研究期间发表与本课题相关的论文数量不少于3篇。并培养硕士生1－2名，本科生3－4名。23 2、分阶段描述项目执行过程中各阶段目标第一阶段（2007.1—2007.2）：课题申报、文献查阅、制定试制方案。查阅国内外文献，包括文摘、专利、研究报告、市场分析情况，制定研究中短链脂肪酸脂质体的技术路线和试制方案。对国内外研究现状以及我们先前取得的实验结果和理论分析作进一步归纳总结，目标是尽可能通过调整配方和制备条件等手段解决中短链脂肪酸储存过程中的不稳定因素。第二阶段（2007.7—2008.5）：中短链脂肪酸脂质体的制备方法的研究在现有的一些技术环节基础上，通过正交实验优化中短链脂肪酸脂质体制备方法，原料配方，以及制备条件等，分别测定脂质体的粒径，包封率，稳定性等性能指标，目标是制备粒径均匀、包封率高、稳定性好的中短链脂肪酸脂质体。第三阶段（2008.6—2008.12）：中锻炼脂肪酸冻干产品的研制和项目验收通过加入冻干保护剂，选择优化冻干过程的工艺参数。将中短链脂肪酸脂质体悬浮液进行真空冷冻干燥，目标是研制和开发粒径均匀、包封率高、稳定性好的中短链脂肪酸脂质体冻干产品。3、项目经费预算情况：项目投资总额、项目已完成投资、项目须新增投资及投资构成和投资预算、申请科技三项经费的使用预算（见附表）。本项目投资总额80多万元、用于NICOMPTM380ZLS粒度测定仪、真空冷冻干燥机、气相色谱仪等设备投入，项目须新增投资30万元设备投入，详见表二。表一：本项目总投资和筹措方案序号项目金额1投资总额85固定资产投资100.5流动资金3023 2资金筹措自筹资金110其中：已完成投资80新增投资30申请科技三项经费20.5借（贷）款表二：项目拟购设备清单序号设备名称规格型号单位数量单价(万元)金额(万元)1气相色谱仪Agilent6890N台125252真空冷冻干燥机LABCONCO台130303ZLS粒度测定仪NICOMPTM380台135354超声波清洗器KQ-50B台10.30.36旋转蒸发器RE-52C台10.50.57流变仪BOOKFIELD台115158全自动氮吸附比表面仪3H-2000台1889真空干燥箱DZG-6020台10.50.510设备安装费用1.21.211透射电镜1112其它2.223 13设备安装费用1.21.214总计130130表三：申请科技三项经费使用预算表序号名称单位数量金额(万元)使用时间1开发费项目开发人员费1.0原材料动力费3.0检测费0.5调研费0.4查新费0.1技术咨询费0.1转让、合作费2.72设备费申请三项经费资助设备：5.03试制费23 人员费1.0原材料动力费5.0检测费1.04鉴定验收费0.8三、项目实施支撑条件1、项目技术来源中短链脂肪酸脂质体的生产技术是自主开发，知识产权由南昌大学所有。2、项目实验、检测条件江西南大中德食品工程中心（FEC）是中德两国政府间的合作项目，江西南大中德食品工程中心是由德国政府无偿援助600万马克，中方配套投入1000多万元人民币共同建成的，占地面积9000多平方米，建筑面积3700多平方米，拥有多功能的食品产业化推广车间，食品添加剂产业化推广车间及功能齐全的培训楼。总设备投入将达290万马克，FEC旨在创建一个具有世界先进水平的科研开发产业化推广基地，FEC具有全国一流的技术装备。如：分子蒸馏装置、连续喷雾干燥造粒装置、冷冻干燥设备、具有反渗透离子交换及超滤的高纯水装置、制备型高压液相色谱仪、旋转薄膜蒸发及降膜蒸发装置、3Mpa氢化反应釜及15Mpa高压反应釜、不锈钢及搪瓷反应釜、不锈钢精馏塔、二氧化碳超临界萃取装置和全自动发酵罐等先进设备。其中，有国产NCJJ0.2/150纳米超高压均质机和从美国Microfluidics公司引进M-7125-30型的动态超高压膨化设备，其压力可达200MPa，这将为本项目技术的实现提供了可靠的设备保障。其主管单位是南昌大学，通讯地址为江西省南昌市南京东路235号南昌大学校内，江西南大中德食品工程中心于2000年6月建成正式运行，2001年3月，在江西省工商局注册，注册资金120万元，登记注册类型为全民所有制企业。3、项目申请单位人才资源情况：技术人员总数、中高级技术人员比例本项目申请单位南昌大学中德食品工程中心是中德两国政府间的合作项目，也是江西中德联合研究院23 (1989年开始建立)的第二期工程,由德国政府无偿援助600万马克、中方配套投入1000多万人民币共同建成，是南昌大学食品科学教育部重点实验室的重要组成部分，有博士学位授予权。现有教授5名、副教授3名，其中国家重点学科带头人1名，博士导师1名，中高级技术人员比例合理，大多数技术人员参加过国外科研机构培训或与国外学术机构进行过科研合作。1、项目组人员专业结构、职称结构“中短链短链脂肪酸脂质体的研究”项目在江西南大中德食品工程中心进行。课题组成员包括：教授1人，副教授2人，讲师1人，研究生2名。本项目研究人员情况见表1。表1：“中短链短链脂肪酸脂质体的研究”项目主要研究人员姓　名性别年龄技术职务业务专业为本课题工作时间（%）在课题中分担的任务所在单位刘成梅男42教授博士90%主持南昌大学中德食品工程中心刘伟男33讲师硕士90%主持南昌大学中德食品工程中心梁瑞红女39副教授博士90%全部研究工作南昌大学中德食品工程中心付桂明男33副教授硕士90%全部研究工作南昌大学中德食品工程中心王瑞莲女24研究生硕士生60%参加南昌大学中德食品工程中心万婕女24研究生硕士生60%参加南昌大学中德食品工程中心2、项目新增投资筹集情况本项目实施的新增投资及筹集见下表3：23 表3：经费来源与预算表（万元）经费来源预算经费支出预算科目预算数科目预算数来源预算合计110.5支出预算合计110.51、申请课题拨款1、仪器设备购置费80.5其中年度拨款2、材料、样品费18.2第一年第二年第三年3、土建安装费0.520.54、试验费82、申请单位自筹505、调研费0.53、合作申请单位自筹406、鉴定费0.84、成果应用单位资助7、资料费0.55、主管部门资助8、其它费用1.56、银行贷款或其它资助四、项目预期经济效益1、预期市场需求随着人们生活水平的提高，环保意识的增强，对兽药的要求也越来越高。目前对兽药的普遍要求是高效、低毒、低残留、不易产生耐药性等。靶向缓释的脂质体制剂作为第四代药物制剂，有着无可比拟的优点。目前兽用脂质体制剂的研究主要以抗寄生虫、抗感染、抗病毒、促生长、微量元素、营养药物为主。陈凤丽等制备的碘醚柳胺脂质体定向剂、李荣誉等制备的吡喹酮脂质体即属于抗寄生虫类，而与抗感染和抗病毒方面有关的脂质体有李万坤等自行制备的诺贝脂质体注射液，陈吉祥等人还用CABA/DOPE脂质体包裹新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因的真核表达质粒pcHNM.。在促生长、微量元素和营养药物方面主要有猪生长激素脂质体的，和半胱胺脂质体的报道。目前有关兽用脂质体制剂的文献中，其主要研究内容涉及制备工艺、理化性质、体内外稳定性、药效学研究及临床观察等方面，但其横向和纵向的研究都不是很深入。一、脂质体在制药工业中的应用23 从1988年第一个脂质体药物在美国进入临床试验，到1989年由Nexstar公司生产的Ambisome在爱尔兰投放市场，目前已有多种脂质体药物工业化生产并上市销售，如脂质体阿霉素、脂质体柔红霉素、脂质体两性霉素、脂质体甲肝疫苗和脂质体乙肝疫苗等。脂质体技术是继第一代普通注射剂、片剂，第二代缓释制剂，第三代控释制剂发展而来的第四代先进的靶向给药制剂。这种新剂型已经被广泛的应用于抗癌药物、抗菌药物、抗寄生虫药物、激素类药物、酶、解毒剂、免疫激活剂以及抗结核药物的研究中。（1）脂质体抗肿瘤、抗癌药物脂质体剂型可提高药物溶解度，改变药物在体内的分布，降低药物的细胞毒性，拓宽其临床治疗剂量范围。Crosasso等采用薄膜分散法,将处方组成确定为PC(磷脂酰胆碱)、PG(磷脂酰甘油酯),其摩尔比为9∶1,制备紫杉醇脂质体,使紫杉醇溶解度达1.0~1.5mgml。顺铂的衍生物二胺环己烷铂有很强的生物活性,但由于几乎不溶于水而不能用于静脉给药,Perez-Soler等制备了其亲脂性异癸酸衍生物NDDP(Cis-bis-neodecanoato-trans-R,R-1,2diaminocyclohexaneplatinum),用薄膜分散法将其制成载药脂质体,主药浓度可达278.6Lgml。第四军医大学对有蒜丝裂霉素脂质体及游离药物的抗肿瘤活性进行了比较，结果发现脂质体组存活率明显高于游离药物组。谭继宏等通过基因重组构建生存基因突变体质粒（pcDNA3-survivin-mutant,Cys84Ala），并以脂质体转染的方法将质粒DNA转入胃癌细胞株，观察到突变体Cys84Ala能诱导胃癌细胞凋亡、增加胃癌细胞对化疗药物的敏感性。该研究还表明，脂质体在抗癌方面的应用不再仅仅局限于药物载体，同样有许多其他有效的途径。Peer等通过实验发现，将丝裂霉素C（MMC）载入透明质烷（hvaluronan）靶向的纳米脂质体中可增加其对癌症模型小鼠的抗癌活性。一般而言化疗药物都有很强的毒副作用，脂质体药物剂型可以在某种程度上提高化疗和抗感染药物的靶向性。由于脂质体对淋巴系统的定向性和对癌细胞的亲和性，并可改变药物在组织中的分布，使药物选择性的杀伤癌细胞或抑制癌细胞繁殖，在癌的治疗中具有高疗效，小剂量，低毒性，无变态反应和免疫反应等优点。因而，这种新剂型作为抗肿瘤药物载体得到了广泛的应用和发展。23 阿霉素脂质体（Doxil-Lip，美国Sequus制药公司）是世界上第一个抗癌药物脂质体，于1995年底在美国获得FDA批准。它能明显的增加靶向部位的药物浓度，降低药物对心脏的毒性。1996年，我国批准了沈阳管城制药厂的复方氟尿嘧啶多相脂质体口服液，这是我国最早的脂质体产品。随后，人红细胞膜脂三尖椹酯碱脂质体、B-榄香烯脂质体、人参皂甙脂质体、多柔比星脂质体、依托泊甙脂质体等也相继问世。(2)抗寄生虫药物北京医科大学药学院研究了磺胺嘧啶钠脂质体对小鼠体内弓形虫的作用，发现脂质体载药组在药物剂量减半的情况下，小鼠存活天数显著高于游离药物组，显示出优越性。上海医药工业研究院对青蒿酯脂质体进行了研究，青蒿酯脂质体对鼠疟原虫的抑制率明显高于单纯青蒿酯。(3)抗细菌抗病毒药物脂质体制剂用于抗菌药物有许多优点：可以降低毒性，改变药代和药物的体内分布，增加血药浓度，并提供缓释。脂质体可以靶向进入网状细胞，而这也正是细菌富集和存活的部位。更重要的是脂质体制剂可改变药物的原有物理化学性质，从而降低了细菌对药物的抗药性。华西医科大学制备了青霉素前体药脂质体，有利于青霉素透过血脑屏障。目前，上市的抗生素类脂质体有青霉素G脂质体、庆大霉素脂质体、阿米卡星脂质体、还有我国的302医院研制的无环鸟苷脂质体。这些脂质体都具有很高的安全性和有效性。最近Liposome公司用PEG衍生的脂类开发了阿糖胞甙脂质体制剂，毒性较低，可增加肝和脾中药物的数量，提高治疗指数，效果优于游离药物。(4)作为肽类和蛋白类药物载体的研究进展多肽、酶类药物都是生物大分子，他们在生物体内不稳定，易被蛋白水解酶水解，且在生物体内的半衰期较短，且绝大部分不利于口服给药。如Maitani等制备的促红细胞生成素（EPO），并测得口服该脂质体的生物利用度为0.74%~31%，而口服EPO溶液无吸收。23 此外脂质体还可作为疫苗、解毒剂及激素类药物的载体，应用于生物制药工业。二、脂质体在兽药工业中的应用随着人们生活水平的提高，环保意识的增强，对兽药的要求也越来越高。目前对兽药的普遍要求是高效、低毒、低残留、不易产生耐药性等。靶向缓释的脂质体制剂作为第四代药物制剂，有着无可比拟的优点。目前兽用脂质体制剂的研究主要以抗寄生虫、抗感染、抗病毒、促生长、微量元素、营养药物为主。陈凤丽等制备的碘醚柳胺脂质体定向剂、李荣誉等制备的吡喹酮脂质体即属于抗寄生虫类，而与抗感染和抗病毒方面有关的脂质体有李万坤等自行制备的诺贝脂质体注射液，陈吉祥等人还用CABA/DOPE脂质体包裹新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因的真核表达质粒pcHNM.。在促生长、微量元素和营养药物方面主要有猪生长激素脂质体的，和半胱胺脂质体的报道。目前有关兽用脂质体制剂的文献中，其主要研究内容涉及制备工艺、理化性质、体内外稳定性、药效学研究及临床观察等方面，但其横向和纵向的研究都不是很深入。三、脂质体在食品工业中的应用脂质体在食品工业中的应用空间非常广阔，可用于生产微胶囊化的酶制剂、作为天然活性成分的载体，香精香料的包裹等。（1）生产微胶囊化的酶制剂。患有乳糖不耐症人士，因缺乏乳糖酶会阻碍含乳糖产品的吸收，特别是乳制品。可通过补充乳糖酶解决这一问题。然而若是直接在乳制品生产中添加乳糖酶会引起发酵现象，影响产品的质感和味道。若以脂质体包埋方法，可确保乳糖酶只在肠道内释放，防止酶在介质中产生反应。(2)通过在脂质纳米粒上修饰特定的活性基团，增强靶向性。如在某些含油量较高的食品中，为了防止油脂的氧化可添加适量的抗氧化剂。将天然抗氧化剂制成脂质纳米粒将其定位到食品的敏感位置，使其有效作用浓度提高，从而提高作用效率。23 (3)保护维生素、氨基酸、矿物质，减少加工储存过程中的损失。很多维生素、氨基酸都具有易氧化，见光易分解等特性。若将其制成脂质体可有效的保护这些物质，减少在加工和保存过程中的流失，降低成本。(4)香精香料的缓释。利用SLN的控释、缓释特性，可以控制香精香料的释放，延长释放时间。也可将脂溶性香精添加到水相中，或将水溶性香精添加至油相中，扩大使用范围。四、脂质体在中药现代化中的应用中医药学是我国优秀传统文化的瑰宝，但由于各种原因，中医药的发展严重地滞后于时代的发展。将各种高新技术时时地引入现代中药研究，充分发挥中药在临床治疗上的优势，提高我国中药产业综合技术水平，增强国际竞争力，在当前形势下显得尤为紧迫。脂质体具有的缓释与控释、靶向给药、低毒性等特点是其在中药现代化中具有良好的应用前景，且有利于开发药物新剂型。脂质体用于中药制剂的研究有一些报道。张中冕制备了猪苓多糖脂质体并进行抗肝转移癌的研究。结果表明，脂质体包裹同等剂量的猪苓多糖能显著减少转移性肝癌的结节数目。丁玉玲等制备了人参皂甙复层脂质体，粒径分布为0.7-1.2微米，并具有良好的稳定性。采用适当脂质材料或对脂质体修饰可使其具有某些特殊功能。这些都为中药脂质体的研究提供了广阔的思路。除上述提到的应用外，脂质体因具有细胞膜的某些特性，因而极易为皮肤所吸收，在化妆品中也可考虑使用脂质体为载体。1、预期盈利水平本项目中试研究成功后，经产业化实施预算总投资500万元，其中固定资产400万元；设备投资150万元；流动资产100万元。可为年产5吨的中短链脂肪酸脂质体的工业化生产提供可靠的工艺条件和工艺参数。经济效益分析见表2表2：经济效益分析表序号项目数量单价合计（万元）备注1中短链脂肪酸4吨200000元/吨80市场价2其它原料5吨50000元/吨2523 3内包装250万板0.10元/板25每片0.5g，4片/板4外包装250万盒0.15元/盒37.51板/盒5职工工资50人1000元/月606职工三项保险工资的20%计127职工福利基金工资的20%计128一般性费用每吨产品10000元计59水、电、汽费用每吨产品30000元计1510管理费按年销售收入1%计11.2511广告销售费用按年销售收入5%计56.2512财务费用等按年销售收入1%计11.2513设备折旧费总设备投资150万元按10年折旧算302年14总成本380.2515销售收入11254.5元/盒16销售利润744.7517流转税金及附加74.7618缴纳税款245.7719净利润424.22注：1.流转税金及附加=产品销售收入×6.23%　　2.所得税=产品销售利润×33%根据销售价格和市场占有情况的分析，预测本项目在完成中试生产后，达到5吨23 中短链脂肪酸脂质体时，可实现销售收入1125万元，净利润424.22万元，缴纳税款245.77万元。本项目经中试后,预计经推广可实现年产5吨中短链脂肪酸脂质体产品的工业化生产，生产中无污染物排放，可达到了无环境污染的生态效益。预计形成工业化生产时，不仅可以解决50余人的就业问题，将产生良好的经济效益，对推动江西省经济的发展有十分重要的意义。1、预期产业化前景世界脂质体药品的销售额以每年60%的增长速度发展，到2003年其销售额已达30亿美元。我国目前关于脂质体的研究大部分还停留在试验阶段。脂质体作为一种载体，具有自己的特点，且随着科学技术的不断发展和人们对脂质体基本原理及生产方法研究的不断深入，脂质体的应用领域将不断拓宽，且今后脂质体将向着温度敏感脂质体、PH敏感脂质体、免疫脂质体、聚合膜脂质体、磁性脂质体等新型脂质体发展。2、项目实施风险分析。第一，我们有强大的技术专家做支撑。具有一批能力强、水平高、在学术上各有特色，知识面广、思路敏捷、富有创新精神，凝聚力强、影响力大构成的以中青年为骨干，知识、年龄结构比较合理，科研实力比较雄厚的研究队伍。第二，目前市场上没有同类产品，所以我们的产品具有一定的新颖性。虽然，我们具有各方面的优势，但市场竞争是激烈的。目前还没有有关中短链脂肪酸脂质体的宣传，人们对新产品的接受还需要一定的时间。五、项目预计社会效益、环境效益1、对社会发展的作用中短链脂肪酸易于消化吸收，可颈动脉进入肝脏直接作为能源，且还具有促进粘膜血流增加、增强消化道蠕动，抗癌抗肿瘤，抑制肠炎沙门氏菌等病原微生物生长的生理功能。而脂质体作为一种新型药物载体，有利于增强药物的靶向性，提高药物的生物利用度，增加药物的稳定性，降低药物的毒副作用，达到药物控释缓释的目的。将中短链脂肪酸制成脂质体的形式可增强它的作用效果，提高它在肠道内的稳定性，降低对非靶向部位的毒副作用，从而进一步扩展其应用领域，推动经济的发展。23 1、对资源利用情况鉴于中短链脂肪酸和脂质体的特殊生理功能，将中短链脂肪酸制成脂质体纳米粒将其定位到敏感位置，使其有效作用浓度提高，增强靶向性，从而提高作用效率。2、对人才培养情况通过本项目的实施可培养本科生5－6名，硕士生2－3名。3、环境影响及效益本项目在实施过程中的“三废”均能达到国家规定。本项目主要废弃物为生产用水，水中主要成分为清洗设备的废水，这些杂质用污水处理系统，用沉淀+氧化+吸附等设施处理可达国家废水排放标准，其废气为有机溶剂，通过回收有机溶剂，并且在通风厨中进行可以降低有机溶剂对大气的污染，噪声在50B以下，符合国家规定，故本项目“三废”均符合国家规定。针对中短链脂肪酸的特殊生理功能，及脂质体的特性，采用脂质纳米粒包埋技术，有利于快速发挥中短链脂肪酸的生理作用，提高其对肠道作用的靶向性，减少剂量降低对非靶向部位的毒副作用。开发出适合不同用途的中短链脂肪酸脂质体产品,可作为脂肪吸收障碍的患者及发育不好的婴幼儿等的能源物质，或作为体育运动者的能量补充源。若将其添加于饲料中，可降低初生仔猪死亡率，提高日增重，减少畜禽肠道疾病的产生，从而提高农民的收入。23'