DB21T 2675-2016 马铃薯试管薯生产技术规程.pdf

'ICS65.020.01B23DB21辽宁省地方标准DB21/T2675—2016马铃薯试管薯生产技术规程2016-07-26发布2016-09-26实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/T2675-2016前言本规程按照GB/T1.1—2009的规则起草。本标准由沈阳市农业科学院提出。本标准由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、辽宁职业学院。本标准主要起草人：潘菊、张健、刘慧铭、胡颖、高红治、杨双、施骥、马东梅、李宁、李金凤、杨璐、宋扬、宋伟、张喆。本标准规范于2016年首次发布。Ⅰ DB21/T2675-2016马铃薯试管薯生产技术规程1范围本标准规定了马铃薯试管薯生产所需的仪器设备及化学试剂，组培苗生产流程，试管薯诱导、收获的操作规程。本标准适用于马铃薯试管薯生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB18133马铃薯种薯GB/T29375马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程GB/T29376马铃薯脱毒原原种繁育技术规程DB21/T1735马铃薯脱毒种薯生产技术规程DB21/T2341马铃薯种薯（种苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1脱毒苗应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Ｙ病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯A病毒（PVA）等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)，即为脱毒苗。3.2试管薯Microtuber用脱毒苗在容器内生产的微型小薯。3.3微型薯Minituber利用脱毒苗或试管薯在防虫温室或网室隔离条件下生产出来的微型种薯。4组培所需的仪器设备及化学试剂4.1仪器设备培养基制作和灭菌设备：炉具、锅、高压灭菌器等。接种及培养设备和容器：超净工作台、接种器具高温灭菌器、培养架、空调及冬季加温设备等。1 DB21/T2675-2016实验设备：万分之一天平、电子天平、显微镜、电冰箱、药品柜、自来水蒸馏纯化设备、pH计、手推车等。4.2玻璃器皿及器材包括盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。主要有：试剂瓶、容量瓶、烧杯、玻璃棒、洗瓶、培养瓶及瓶盖、瓶刷、工作服、手套等。4.3常用化学试剂包括组培苗基本培养基所需的无机盐类和有机物类。MS基本培养基成分及母液配制参见附录A；其它常用试剂及植物生长物质的配制参见附录B。5培养基制作5.1母液的配制与保存制作培养基前需先配制基本培养基母液，MS基本培养基母液配制比例参见附录A。母液配制应使用去离子水，配好的母液置于4℃保存，母液保存期应不超过30d。母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。5.2培养基制作以制作1L固体培养基为例：根据培养基成分准备好蒸馏水、琼脂、蔗糖和各类母液等。加蒸馏水700mL（按所需容量的70%左右），再加入琼脂7g，加热并不断搅拌使琼脂完全融化。加入蔗糖30g，待完全溶解后，按附录A加入母液，再根据要求加入适量植物生长调节物质并充分搅拌，最后定容至1L。用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节pH值至5.8。制作液体培养基的过程基本相同，但不需要加琼脂，加热时间可以适当缩短。5.3培养基灭菌制作好的培养基分装到培养瓶中后，装入高压灭菌锅在0.1Mpa压力下灭菌20min，取出后水平摆放，冷却备用。5.4培养基配方扩繁培养基：MS+蔗糖30g/L+琼脂7g，pH5.8，固体培养基壮苗培养基：MS+蔗糖30g/L，pH5.8，液体培养基试管薯诱导培养基：MS+500mg/LCCC+80g/L白糖+0.1%活性炭，pH5.8，液体培养基6试管薯生产6.1诱导材料选取选择具备该品种典型性状的株系，挑选植株健壮、长势良好、茎秆粗壮、根系发达的脱毒苗作为诱导材料。6.2脱毒苗繁育2 DB21/T2675-20166.2.1脱毒苗转接将健壮基础苗剪去顶芽和基部茎节，留中间带4～6个节的茎段，转入壮苗培养基（培养基配方及制作方法见5，用浅层静止方式培养。3～4周后每个茎段发育成一株带有5～7个节的健壮苗。6.2.2培养条件培养室温度为白天23～25℃、夜间16～20℃，光照时间16h/d，光照强度4000Lx以上。6.2.3病毒检测继代扩繁中选留的脱毒苗，在批量诱导之前要作一次病毒检测，条件具备的可在本单位进行自检（检测方法可参考DB21/T2341-2014马铃薯种薯（种苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程），然后送到国家法定植检部门复检认定，没有检出PLRV、PVX、PVY、PVA、PVS和PSTVd等病毒和类病毒的脱毒苗，才能进行扩繁或诱导。不合格的脱毒苗不得用于生产。6.3试管薯诱导在无菌条件下，将培养瓶中原来的培养基倒掉，再注入诱导结薯培养基（培养基制作见5）。在室温及光照16h/d条件下培养48h以促进匍匐茎的形成，然后转入18℃±1℃黑暗间散射光(8h/d，光照强度500～1000Lx)培养，3～4d后便可以产生试管薯，40～45d试管薯发育到直径5mm以上可以收获。6.4试管薯收获及储存收获时将试管薯及茎段从培养瓶中取出，摘取符合收获标准的小薯，用清水多次冲洗，直至洗净表面附着的培养基，于阴凉处阴干或烘干，再贮藏于透气的容器中，置于4℃条件下保存。试管薯经国家法定植检部门检验合格后，方可作为商品种薯。3 DB21/T2675-2016附录A（资料性附录）MS培养基母液成分及配制母液定容体配制1升MS培养基吸母液种类成分称取用量（g）积（ml）取量（ml）CaCl2(无水)3.32KNO319.0大量元素KH2PO41.71000100（A）NH4NO316.5MgSO4·7H2O3.7H3BO30.620MnSO4·H2O2.230ZnSO4·7H2O0.860微量元素KI0.083100010（B）Na2MoO4·2H2O0.025CuSO40.0016CoCl2·6H2O0.0025EDTA-Na23.73铁盐（C）100010FeSO4·7H2O2.78肌醇5.000甘氨酸0.100维生素烟酸0.02550010（D）盐酸吡哆辛(B6)0.025盐酸硫胺素(B1)0.020注：*A母液中CaCl2，KH2PO4，KNO3，NH4NO3分别溶解混合加水至800ml左右，再称取MgSO4·7H2O溶解后与之合并，定容至1000ml。*C母液中EDTA-Na2与FeSO4·7H2O应分别用热水溶解后混合并加热使其充分螯和。4 DB21/T2675-2016附录B（资料性附录）常用试剂及植物生长物质的配制B.10.1mol/LHCl的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19g/ml，假设要配制1000ml1mol/LHCl，则需要盐酸的物质的量为1mol，所以需要量取37%的盐酸为0.1*36.5/37%/1.19=8.2mlB.20.1mol/LNaOH的配制：称0.4gNaOH，溶于100ml蒸馏水中。B.395%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸馏水即可得到75%的酒精。5'