DB13T 1415-2011 鱼类寄生虫性疫病诊断技术规程.pdf

'ICS65.150B52DB13河北省地方标准DB13/T1415—2011鱼类寄生虫性疫病诊断技术规程Diagnosisprotocalforparasiteepidemicsoffish2011-06-15发布2011-06-30实施河北省质量技术监督局发布 DB13/T1415—2011前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河北省水产局提出。本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。本标准主要起草人：张志华、侯金良、李同庆、康辰香、孙伟彬、石洁卿、马瑞欣、邵铁凡、寇景莲。I DB13/T1415—2011鱼类寄生虫性疫病诊断技术规程1范围本标准规定了鱼类寄生虫性疫病即小瓜虫病、刺激隐核虫病、粘孢子虫病、三代虫病、指环虫病的诊断技术。本标准适用于小瓜虫病、刺激隐核虫病、粘孢子虫病、三代虫病、指环虫病的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法OIE《水生动物疾病诊断手册》3通则3.1材料和试剂3.1.1材料普通光学显微镜、双筒解剖镜、放大镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术刀、手术剪、解剖针、吸水纸、培养皿、滴管、解剖盘等。3.1.2试剂0.85％生理盐水、30‰人工配制海水、4％～5%和10％的福尔马林、70％酒精、硝酸银、甘油胶胨、肖氏液、聚乙烯醇。配置试剂用水应符合GB/T6682的要求。3.2采样量用于检查诊断的鱼应有一定数量，检查时采集的样品至少5尾~10尾。也可按照OIE《水生动物疾病诊断手册》的采样方法进行采样，见附录A。3.3样品及运输用于实验室检查的病鱼应是活体，运输时应在采集的病鱼中加注原池水进行活体运输。每个容器只装运同一种病鱼送至实验室。运输过程中应采取充氧、降温等措施。3.4病原体记数按不同感染部位采集组织，进行观察。记录显微镜检查时的倍数和该倍数下的虫体数量。孢囊用数字说明，虫体数为同一玻片中3个视野的平均数。1 DB13/T1415—20114小瓜虫病4.1病原种类特征见附录B。4.2现场样品目检检查鱼体。病鱼体色发黑，消瘦，游动异常，体表或鳃上可见1mm左右的小白点，病情严重时，鱼体表伴大量粘液，用镊子刮下白点或粘液，放在解剖盘上，滴一滴生理盐水，静置1min～2min，在光亮的地方仔细观察，如果见到一个个白色小圆球在慢慢地游动，且大多数集中在水滴的边缘，根据上述的症状可以初步确诊。4.3实验室检测及标本保存4.3.1体表用解剖刀刮取体表两侧粘液，置于载玻片上，滴一滴生理盐水，用镊子将组织粘液分散，盖上盖玻片，用拇指轻轻压片，在显微镜或解剖镜下检查。4.3.2鳍目检正常的鱼，剪下各鳍，置于载玻片上，滴一滴生理盐水，解剖镜下检查。目检鱼体各鳍如有溃烂或白点，用镊子刮取溃烂或白点部位，置于载玻片上，滴一滴生理盐水，用盖玻片盖上轻压，解剖镜或显微镜下检查。4.3.3鳃用剪刀将左右两边的鳃完整地取出，放在培养皿里（要分开放置），并附上左右标记。剪取一小块鳃组织（应从每一边鳃的第一片鳃片接近两端的位置剪取），放在载玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，在解剖镜或显微镜下检查。如鳃上肉眼可见白点或孢囊，则用镊子刮取白点或孢囊，或取整片鳃丝压片，显微镜下检查。4.3.4虫体收集保存见附录C。4.4结果判定目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内小瓜虫计数达到10个及10个以上时，判定为小瓜虫病；小瓜虫计数不足10个时，判定为小瓜虫感染。5刺激隐核虫病5.1病原种类特征见附录B。5.2现场样品目检滴加试剂为30‰人工配制海水，其他步骤同4.2。2 DB13/T1415—20115.3实验室检测及标本保存诊断时滴加试剂为30‰人工配制海水，其他步骤同4.3。5.4结果判定目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内刺激隐核虫计数达到10个及10个以上时，判定为刺激隐核虫病；刺激隐核虫计数不足10个时，判定为刺激隐核虫感染。6粘孢子虫病6.1病原种类特征见附录B。6.2现场样品目检粘孢子虫的多数种类，寄生于鱼的体表、鳃、肠道及体腔，都表现出肉眼可见的症状，即白点状或白色的瘤状孢囊，孢囊形状和大小不规则，颜色灰白而不透明。用镊子取下一个孢囊放在载玻片上，滴一滴生理盐水，用盖玻片盖上轻压，如孢囊破裂并流出乳白色液体，可初步诊断为粘孢子虫病。6.3实验室检测及标本保存6.3.1镜检在400倍显微镜下，压破的孢囊液体中清晰可见孢子，可诊断为粘孢子虫病。一个孢囊中有成千上万个孢子虫。6.3.2体表检查体表，用解剖刀刮取鳞片下的瘤状物，置于载玻片上，加一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，显微镜下检查。6.3.3鳍检查方法参见4.3.2，镜检倍数为400倍。6.3.4鳃检查方法参见4.3.3，镜检倍数为400倍。6.3.5体腔打开鱼体腹腔，仔细观察显露出的部位有无可疑病变。如发现白点，或较大孢囊，有可能是粘孢子虫寄生。用镊子刮取白点部位或孢囊置于载玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，见孢囊破裂后，显微镜下检查。6.3.6肠道将肠道外壁上所有脂肪去除干净，把肠前后伸直摆在解剖盘上。将肠分为前、中、后三段，各取一段，用剪刀从与肠平行的方向剪开一个小小切口，用镊子从切口上取一小滴内容物放在载玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，显微镜下检查，每段同时检查两片标本。3 DB13/T1415—2011剪开肠道后，如见白点或孢囊附着，直接用解剖刀刮取白点或孢囊于在载玻片上，压片后，显微镜下检查。6.3.7虫体收集保存见附录C。6.4病原体记数及结果判定6.4.1病原体记数6.4.1.1计数符号用“+”表示：“+”表示有；“++”表示多；“+++”表示很多。6.4.1.2高倍显微镜400倍一个视野下，有1个～20个虫体时记“+”，21个～50个虫体时记“++”，50个以上的虫体时记“+++”。6.4.2结果判定检出粘孢子虫则判定为粘孢子虫病。7三代虫病7.1病原种类特征见附录B。7.2现场样品目检当虫体大量寄生时，病鱼体表可见一层灰白色的粘液，鱼体失去光泽，游动极不正常。7.3实验室检测及标本保存该病不会出现白点或孢囊，无须此步检测。其他步骤参见4.3。7.4结果判定目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内三代虫计数达到5个及5个以上时，判定为三代虫病；三代虫计数不足5个时，判定为三代虫感染。8指环虫病8.1病原种类特征见附录B。8.2现场样品目检同7.2。8.3实验室检测及标本保存同7.3。4 DB13/T1415—20118.4结果判定目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内指环虫计数达到5个及5个以上时，判定为指环虫病；指环虫计数不足5个时，判定为指环虫感染。5 DB13/T1415—2011AA附录A（资料性附录）采样数量表A.1检疫采样数量表鱼群大小2％感染率时取样5％感染率时取样10％感染率时取样505035201007545232501105025500130552610001405527150014055272000145602740001456027100001456027100000或以上1506030注：检疫采样应采集全部实验室样品。6 DB13/T1415—2011BB附录B（资料性附录）病原种类特征B.1多子小瓜虫B.1.1成虫期虫体一般呈卵形或球形，大小(350～800)µm×(300～500)µm，胞口在接近前端的腹面上。大核香肠状或马蹄状，小核紧帖大核上，细胞质有很多小的伸缩泡和一些食物粒。B.1.2幼虫期身体一般呈椭圆形，随着发育时间的延长身体逐渐变长，变成扁鞋底状，在前端有一乳头状突起，叫钻孔器，前端较圆，除身体后端有1根特长的尾毛外，周身长着长短一致的纤毛。在腹面稍前的位置，有1个近似“6”字形的小胞口。在身体前半部有一个大的伸缩泡。B.1.3包囊期离开鱼体的虫体或越出囊泡的虫体，可作3h～6h的游泳，然后沉入水底的物体上，静止之后，分泌一层胶质厚膜将虫体包围即是包囊。包囊圆形或椭圆形，白色透明。B.2刺激隐核虫B.2.1寄生滋养体成熟的虫体呈球形或卵圆形，直径约300μm～500μm，显微镜下常呈乳白色，体被纤毛，表面有脊状突起，胞口位于身体的前端，体内有4个～8个卵圆形团块连接成“Ｕ”字形排列的念珠状大核。虫体会随运动改变形状。B.2.2胞囊虫体从宿主体表脱落后，纤毛退化，表面的脊状突起变平，形成厚壁胞囊，大小为94.5μm×170μm～252μm×441μm。B.2.3幼虫卵圆形或纺锤型，前端稍尖，大小为20μm×30μm～50μm×70μm，其形态大小随地域、宿主种类和温度的不同而有所变化。B.3粘孢子虫主要致病种类有：B.3.1变异粘体虫（M.variaAchmerovNie&Lee,1964)7 DB13/T1415—2011营养体外观不规则，大小不一。成熟孢子壳面观为椭圆形，前端较后端宽或钝圆。后端壳缘光滑，或有4～5个V形皱褶。极囊2个，梨形或卵圆形，大小相等，平行排列于前方，约占孢子长的1/2。少数极囊不等，斜向排列于前。极丝在极囊内盘绕5～9圈。孢中质有圆形胚核2个。无嗜碘泡。顶面观纺锤形。缝面观亦为纺锤形，缝脊直或稍弯曲。孢子长9µm～13µm，宽6µm～8.5µm。孢囊形状大小不一，有椭圆形、扇形块状、长条形或分枝不规则等。B.3.2中华粘体虫（M.sinensisNie&Lee,1964)成熟的孢子圆形，前方稍尖，后方钝圆，缝脊直。两个梨形极囊同等大小。无嗜碘泡。感染的鱼肠道内壁或外壁形成乳白色芝麻状孢囊。B.3.3鲢碘泡虫（M.drjagini）(1954)(Schulman,1962)营养体直径4.8µm～16.0µm.。孢子壳面观椭圆或倒卵形，前宽而后稍狭。壳面光滑或有4～5个V形的褶皱，囊间有明显V形小块。孢子长12.3µm，宽9.0µm。极囊2个，梨形，通常大极囊倾斜地位于孢子前方。B.3.4饼形碘泡虫（M.artuaAchmerov,1960)孢囊白色，圆形或椭圆形，长42µm～89.2µm，宽31.5µm～73.5µm。孢子壳面观为圆形，纵轴小于横轴，孢子后方有不甚明显的褶皱。缝面观纺锤形。孢子长4.8µm～6.0µm。2个卵圆形的极囊大小相等，呈八字形排列。B.3.5异型碘泡虫（M.disparTheolohan,1895)孢子椭圆形，缝脊直而明显，两个梨形极囊大小不等，彼此有一定间隔，有一个明显的嗜碘泡。孢囊大小为29.7µm～39.2µm×195.8µm～230µm。B.3.6鲮单极虫（T.rohitae）(Southwell&Prashad,1918)着生于鱼体鳞片下，白色或蜡黄色，孢囊大小形状不一，有圆形、椭圆形、长方形或多角形，其长可达32mm，短的有5mm。孢子长29.8µm～35µm，宽7µm～12.3µm，极囊长19µm～25µm，宽为7µm，呈长卵形，约占孢子长的1/3～1/2。嗜碘泡1个。孢子外面常被有一层无色透明的薄膜。B.4三代虫主要致病种类有：B.4.1鲢三代虫（G.hypopthalmichthysiLing）主要寄生于鲢、鳙的皮肤、鳍、鳃及口腔。无眼点，体长0.32mm～0.51mm，宽0.07mm～0.14mm前端有头器1对。后吸器上的8对边缘小钩排列呈伞状，中央大钩1对，2片联结片。口在身体前端腹面，呈管状或漏斗状。咽由16个大细胞构成，葫芦状。食道很短，肠支伸至体后的4/5处。睾丸位于体后部中间。交配囊卵圆形，由1根大而弯曲的大刺和8根刺组成。卵巢单个，呈新月形，在睾丸之后。B.4.2秀丽三代虫（G.eleganseNordmann）主要寄生于鲤、鲫及金鱼。无眼点，在虫体的中部，可见到胚胎，有时甚至可见到“连续四代”在一起。8 DB13/T1415—2011B.4.3鲩三代虫（G.ctenopharyngodontisLing）主要寄生于草鱼皮肤和鳃上。无眼点，虫体较大，为0.33mm～0.57mm×0.09～0.15mm，两端的前缘常各具有一尖刺状的突起。B.5指环虫指环虫属的主要特征：后吸器具7对边缘小钩，1对中央大钩。联结片存在，辅助片存在或缺失。体前端具眼点2对，具贮精囊，前列腺储囊1对。主要致病种类有：B.5.1页形指环虫（DactylogyruslamellatusAchmerov）主要寄生于草鱼鳃、皮肤和鳍。虫体扁平，大小为0.192mm～0.529mm×0.072mm～0.136mm，具眼点及头器各2对。B.5.2鳙指环虫（DactylogyrusaristichthysLong&Yu）主要寄生于鳙鱼鳃部。具7对边缘小钩，中央大钩基部较宽，内外突明显。联结片略呈倒“山”字形，辅助片稍似菱角状，左右两部分较细长。B.5.3小鞘指环虫（DactylogyrusvaginulatusTchang&Niu）主要寄生于鲢鱼鳃上，为较大型的指环虫，可达0.98mm～1.4mm×0.233mm～0.344mm。中央大钩粗壮，全长0.054mm～0.066mm。B.5.4坏鳃指环虫（DactylogyrusvastatorNybelin）主要寄生于鲤鱼、鲫鱼、金鱼的鳃丝。联结片单一，呈“一”字行。9 DB13/T1415—2011CC附录C（资料性附录）虫体标本收集方法及保存C.1小瓜虫、刺激隐核虫C.1.1用4％～5％福尔马林保存带有虫体的组织。C.1.2制备干片保存：将有病原体的含有物涂在载玻片上，空气中干燥后进行染色（硝酸银法染色），用以观察虫体的纤毛线。C.2粘孢子虫C.2.1把孢囊取出，压破，或取出内含物，用盖片涂抹法涂片，用肖氏液固定。C.2.2用4％～5％福尔马林保存孢子或孢囊。C.2.310％福尔马林固定保存病变组织。C.2.4用甘油胶胨保存孢子。即把孢子放在载破片上的中间位置，水分尽量少带，然后用小解剖刀或小镊子取一小块甘油胶胨放在有孢子的位置上面，把载玻片放在酒精灯的火焰上稍微加热，待甘油胶胨完全溶解后，即盖上盖玻片，并轻轻压平，平放在桌上，使其在空气中干燥即可。C.3三代虫、指环虫C.3.1解剖镜下从鳃片上找到虫体，用针挑出，再用吸管吸取，置于盛有蒸馏水的器皿里，用甘油胶胨或聚乙烯醇把虫体封固或者放入4％福尔马林中固定保存。C.3.2将鳃组织完整剪下，放入4％～5％福尔马林中固定保存。_________________________________10'