GBT17494-1998 马传染性贫血病间接ELISA技术规程.pdf

'GB/T17494-1998前言马传染性贫血病(简称马传贫，下同)的流行，曾给我国养马业造成巨大的经济损失。经过多年的防制，在全国范围内取得显著成效，已达到控制标准。为消灭马传贫，提供一个先进有效、特异敏感、反应快速、操作方便、易于推广的检测方法，是十分必要的。为此制定马传染性贫血病间接ELISA技术规程。马传贫间接ELISA技术自1983年建立以来，已在全国主要养马省区推广应用十余年之久，在马传贫防制工作中发挥了重要作用。特别是研制的试剂实现了标准化、商品化，并以低耗优质的产品质量，为该方法推广应用奠定了基础，在这方面我们已走在世界前列。本标准的附录A、附录B,附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由中华人民共和国农业部畜牧兽医司归口。本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草。本标准起草人:戴玉坤。.www.bzxzk.com. 中华人民共和国国家标准马传染性贫血病间接ELISA技术规程GB/"f17494-1998RulesofindirectELISAtechniqueforequineinfectiousanemiadisease1范围本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA技术规程的测定原理、仪器设备、试剂、配制溶液、操作步骤、结果判定。本标准适用于检测马血清中的马传贫疫毒抗体。可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马匹的检疫，马传贫病马的定性;也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。NY127-1987马传贫酶联免疫吸附试验(ELISA间接法)抗原、酶标记抗体制造及检验试行规程3测定原理用特制的马传贫病毒抗原(NY127)，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有马传贫病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物，再与酶标记的抗体(抗马免疫球蛋白)反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性、定量抗体测定。4仪器设备吸管:1mL,5mL,10mL;量桶:50mL,100mL,1000mL;烧杯:50mL,100mL;玻璃滴管:每滴体积约20^-30pL;血清稀释板:2。孔板每孔容积为1mL;定量加液器:1mL分装定量;微量吸液器:50pL,100pL;分析天平:感量。.001g;托盘夭平:感量。.01g;水浴锅;酶标测试仪。5试荆除特别注明外，所用试剂皆为分析纯。国家质f技术监督局1998一08一31批准1999一01一01实施.www.bzxzk.com. GB/"r17494-1998磷酸氢二钠;磷酸二氢钠;氯化钠;柠檬酸;磷苯二胺(化学纯);过氧化氢(浓度30%);吐温-20(Tween-20);白明胶(Gelatinwhite)(E.Merck);健康牛血清(无污染);浓硫酸(纯度95%-98%);酶标记抗体(冻干品，活性和特异性应符合NY127，见附录A);马传贫病毒抗原包被板(活性和特异性应符合NY127，见附录B);阴性及阳性对照血清(冻干品，活性和特异应符合NY127).6配制溶液6.1磷酸盐缓冲液(0.02mol/LpH7.2PBS)6.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(NaiHPO,·12HzO)71.64g，先加适量的去离子水加热溶解，最后定容至1000mL,混匀。6.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液:称取磷酸二氢钠(NaH,PO,"2H,O)31.21g，先加适量的去离子水加热溶解，最后定容至1000mL,混匀。6.1.3量取。.2mol/L磷酸氢二钠溶液360mL,0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL,称取氯化钠38g，混在一起，用去离子水溶解稀至5000ml-,6.2洗液(0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐9-20)量取0.02mol/LpH7.2PBS1000mL，加入0.5mL吐温-20,混匀。6.3血清及酶标记抗体稀释液(0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐温-20-0.1%白明胶-10%健康牛血清)量取洗液(6.2)100mL，加入100mg白明胶加热溶解，冷却后量取90mL，加人健康牛血清10mL,混匀。6.4底物溶液(pH5.0磷酸盐一柠檬酸缓冲液，内含。.04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)6.4.1pH5.0磷酸盐一柠檬酸缓冲液:称取柠檬酸(CsHsO,·H20)21.01g，用去离子水溶解，定容至1000mL。量取243mL与。.2mol/L磷酸氢二钠溶液(6.1.1)257mL混合，于4℃冰箱中保存不超过一周。6.4.2称取40mg邻苯二胺，溶于100mLpH5.0磷酸盐一柠檬酸缓冲液(6.4.1)中(用前从4℃冰箱中取出，在室温下放置20^-30min平衡温度)，待溶解后，加人150pL过氧化氢混匀。根据试验所需量按此比例增减。现用现配，剩余液废弃。6.5终止剂:2mol/L硫酸量取浓硫酸4mL加入32mL去离子水中，混匀。了操作步骤了.1洗板去掉抗原包被板的密封条及板孔保护膜，向各孔注入洗液，浸泡约3min，甩干，再重新注入洗液重复洗下次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。了.2加被检血清及对照血清.www.bzxzk.com. GB/T17494-1998将被检血清登记编号后，用50pL微量吸液器依次各取50pL加人到血清稀释板的各孔内(每份血清各用1个加样嘴)。用定量加液器，将。95mL的稀释液(6.3)依次加人装有血清的各孔内，使血清做1120倍稀释。混匀后用100pL微量吸液器将被检血清依次加人抗原包被板孔内(每份血清各用1个加样嘴)，每份血清加两个孔。每块反应板均需设阳性对照及阴性对照血清。冻干的阴、阳性对照血清，按瓶上标注量加人稀释液(6.3)，溶解后加入上述包被板孔内。阴、阳性对照血清各两孔，每孔100pL。盖好板盖，置37℃水浴中，保温1h,7.3洗板甩掉板孔内的血清，向各孔注入洗液，按(7.1)方法洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。7.4加酶标记抗体按瓶签标注量，用稀释液(6.3)将冻干酶标记抗体溶解混匀后，每孔加100yL,盖好板盖，置37C水浴中，保温1h。7.5洗板甩掉板孔内的酶标记抗体，向各孔注入洗液，按(7.1)方法洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干口7.6加底物溶液用100pL微量吸液器，每孔加新配制的底物溶液100pL，在室温下避光反应大约5.10min(见附录C),7.7终止反应用玻璃滴管每孔滴加终止剂1滴。8结果判定8.1目测法阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判为马传贫病毒抗体阳性。如遇颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异者，用目测法难以判定时，则以比色法测定结果为最终结果。8.2比色法用酶标测试仪，在波长492nm下，测定各孔OD值，阳性对照血清的两孔平均OD值大于1.0，阴性对照血清的两孔平均OD值小于或等于。.2为正常反应。按以下两个条件判定结果:被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比，大于或等于2，且被检血清的两孔平均OD值在。.2以上者，判为马传贫病毒抗体阳性，否则为阴性。.www.bzxzk.com. GB/"r17494-1998附录A(标准的附录)马传贫酶标记抗体质t的说明马传贫酶标记抗体(冻干品)，系山羊抗马IgG与辣根过氧化物酶的结合物。对标准阳性血清的平切终点(PEP)应(0.25Ftg/mL，平切滴度(PT)应>-1:10240倍。酶标记抗体用二倍平切终点的浓度，对标准阳性血清与标准阴性血清的1:20倍稀释液进行测定，阳性吸收值应>1.0，阴性吸收值应(0.2。在一20℃下可保存2年。附录B(标准的附录)马传贫病毒抗原包被板质t的说明马传贫病毒抗原包被板，系马传贫病毒抗原包被40孔或96孔聚苯乙烯板制备而成，对标准阳性血清的终点滴度)1:20480倍。在一20℃下可保存2年。附录C(标准的附录)底物溶液作用时间的说明底物溶液的作用时间与环境温度有关，如温度较高，酶催化作用就快，颜色反应则快。如温度低，酶的催化作用就慢，颇色反应则慢。因此底物的作用时间多依阳性和阴性对照血清颜色变化为准。当阳性对照血清孔呈鲜明的黄色，而阴性对照血清孔无色或基本无色时即要终止反应。标准中规定的底物作用时间5^10min，是在不同温度条件下的大致范围。.www.bzxzk.com.'