南方水稻黑条矮缩病测报调查技术规范（试行稿）

'南方水稻黑条矮缩病测报调查技术规范（试行稿）1范围本标准规定了南方水稻黑条矮缩病测报调查的病毒检测技术、病情调查方法，以及调查数据记载归档的要求。本标准适用于南方水稻黑条矮缩病测报调查,有关研究及生产单位可参考执行。2术语与定义下列术语和定义适用于本标准。2.1南方水稻黑条矮缩病毒属斐济病毒属（Fijivirus），病毒粒体球状，直径70～75nm，病毒基因组由10片段dsRNAs组成。该病毒可在传毒介体白背飞虱体内增殖，循回期（从获毒至可传毒的间隔时间）5～7天，最短传毒取食时间为5～10分钟。2.2传毒介体携带可以侵染水稻的南方水稻黑条矮缩病毒的昆虫。南方水稻黑条矮缩病毒传毒介体为白背飞虱(SogatellafurciferaHorváth)，属昆虫纲、同翅目、飞虱科。成虫与若虫皆能传毒，且若虫传毒效率高于成虫。2.3传毒南方水稻黑条矮缩病毒经白背飞虱，由一植物传至另一植物的过程即为传播病毒或传毒。2.4获毒亲和性植物经白背飞虱取食获得病毒的过程。2.5持久性传毒又称循徊型传毒或增殖型传毒，是介体传播病毒的一种方式。白背飞虱在毒源植物上经较长时间吸食获得病毒，经数小时或更长时间的循徊期后即可传毒。获毒后，白背飞虱持毒期长，终身带毒，部分病毒可在体内增殖。2.6带毒率田间调查携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱虫量占白背飞虱调查总虫量的百分比率。2.7显症通常水稻感染SRBSDV一段时间后表现症状，一般15天左右达显症高峰，亦可出现多个显症阶段。2.8病丛率发病显症病丛数占调查总丛数的比例，表示病害发生的严重程度。2.9病情指数病害发生的普遍性和严重程度的综合指标，用以表示病害发生的平均水平。2.10见病面积指田间出现南方水稻黑条矮缩病的田块面积总和。2.11发生面积指田间南方水稻黑条矮缩病实际发生病丛率大于3%的田块面积总和。3白背飞虱带毒率调查检测3.1带毒率测定方法采用浙江大学研发的dot-ELISA检测试剂盒或采用商品化PCR试剂盒测定白背飞虱的带毒率情况（见附录D）。每批次检测白背飞虱数量应在100头以上（如果1次采虫不足100头，可采用连续几天收集或采集的虫体标本进行检测）。然后逐个检查反应类型（带毒白背飞虱呈现阳性反应），记载带毒虫量。根据公式（1）计算带毒率。—11— 通过公式（1）计算带毒率。……………………………………………………………………（1）式中：H——带毒率；S——带毒虫量；Z——检测总虫量。3.2越冬白背飞虱虫口密度调查及带毒率检测3.2.1调查时间：每年2月中旬至翻耕前调查1次，各地每年调查时间应大致相同。3.2.2调查地点：稻飞虱常年可越冬区域或间歇越冬区域（广东、广西、福建、云南、海南）。3.2.3调查方法：在再生稻苗、落谷苗、稻桩、田边和沟边杂草（游草）等越冬场所调查，用网扫法（针对成、若虫）,每点扫10复网次（左右摆幅3m，总共30㎡以上），如果收集到的白背飞虱低于50头，增加扫网次数。将收集到的飞虱进行种类鉴定，并将其中的白背飞虱进行带毒率检测。检测结果填入附件A中表A1并及时上报。3.3灯下白背飞虱带毒率调查检测3.3.1调查时间：华南稻区3-8月（海南3-9月），西南和江南稻区4-8月，长江中下游稻区6-8月。在水稻秧苗期至分蘖期，逐日收集白背飞虱，每周集中检测1次；如遇白背飞虱集中迁入峰，则单独检测峰日白背飞虱。3.3.2调查地点：南方水稻黑条矮缩病发生省份（或可能发生省份）。3.3.3调查方法：采用自动虫情测报灯，逐日收集白背飞虱，将每日白背飞虱样品置于1.5ml尖底或2ml平底小离心管中。为防止虫体腐烂，管内再放入适量经70%酒精浸润的纸巾或棉球,盖紧管盖。管壁标明地点和日期，初处理后及时进行检测。如灯下监测出现白背飞虱明显迁入峰，则需要对迁入峰日的白背飞虱带毒情况进行单独检测。检测结果填入附件A中表A2、表A3并及时上报。4水稻田间发病情况调查4.1系统调查4.1.1调查时间：自白背飞虱迁入水稻秧田高峰后起（一般早稻4月下旬至5月上旬，中稻5月下旬至6月上旬，晚稻7月下旬至8月上旬），每10天调查1次（可结合白背飞虱虫量调查同时进行），至水稻齐穗期结束。4.1.2调查方法：水稻本田期，在白背飞虱带毒虫量高、常年南方黑条矮缩病发病比较重、有代表性的地区，选取不同抗感病品种、不同播栽期的类型田各1块进行调查。采用对角线5点取样，每点查40丛，记载发病丛数、严重度（分级指标参考附录C），根据公式（2）和（3）分别计算病丛率、病情指数。结果记入附件A中表A4。通过公式（2）计算发病丛率：…………………………………………………………（2）I——发病丛率（%）；Pi——发病丛数；Pm——调查总丛数。通过公式（3）计算病情指数：—11— ………………………………………………（3）A——病情指数；Bi——各级严重度病丛数；Bd——各级严重度代表值；Mi——调查总丛数；Md——严重度最高级代表值。4.2　病情普查4.2.1调查时间：根据水稻不同播期与抗性，分别选择早、中、晚及不同抗感类型田共20-30块，于双季早稻、中稻及双季晚稻的分蘖末期和齐穗期各调查1次。4.2.2调查地点：南方水稻黑条矮缩病发生省份（或可能发生省份）。4.2.3调查方法：以县为单位，选择有代表性的乡镇3个，每个乡镇选长势好中差的不同类型田各3块，采用对角线5点取样，本田每点调查40丛。记录调查情况，并进行带毒率检测（记载发病田块数、发病丛数，计算病田率、病丛率）。每季水稻病情稳定后，根据各生育期发病普查结果，统计水稻种植及南方水稻黑条矮缩病见病、防治、发生面积。调查结果填入附录A中表A5和表A6并及时上报。5　数据汇总和传输5.1主要传输工具采用全国农作物重大病虫害数字化监测预警系统、互联网和传真机等。5.2模式报表按统一汇报格式、时间和内容汇总上报。其中，发生程度分别用1、2、3、4、5表示。同历年比较的早、增、多、高用“＋”表示，晚（迟）、减、少、低用“－”表示；与历年相同和相近，用“0”表示；缺测项目用“××”表示。5.3信息共享平台根据病害监测实际，全国农技中心已在上线运行的全国农作物重大病虫害数字化监测预警系统中设立南方水稻黑条矮缩病发生与监测信息共享平台，并组织各级病虫监测机构和技术人员实时上传病害监测和发生信息。请有关机构和人员随时登陆系统获取相关信息。登陆地址：http://202.127.42.2176调查资料表册全国制定统一的“调查资料表册”的样表一份（见附录A），供各地应用时复制。用来规范各区域测报站测报调查行为，保证为全国数据库积累统一、完整的测报调查资料。其中的内容不能随意更改，各项调查内容须在调查结束时，认真统计和填写。—11— 附录Ａ（规范性附录）农作物病虫调查资料表册南方水稻黑条矮缩病（试行稿）（　　　　年）测报站名盖章站址（北纬：　　　　　东经：　　　　　海拔：　　　　）测报员负责人中华人民共和国农业部—11— 表A1白背飞虱越冬带毒情况调查调查地点：省县(市、区)站调查时间取样地点取样面积（㎡）白背飞虱(头)带毒白背飞虱(头)带毒率(％)备注（环境类型）表A2灯下白背飞虱带毒情况调查调查地点：省县(市、区)站汇报时间(月-日)取样地点高峰期(月-日)检测白背飞虱合计(头)带毒白背飞虱(头)带毒率(％)表A3灯下高峰日白背飞虱带毒情况调查调查地点：省县(市、区)站高峰日期（月-日）取样地点高峰日虫量(头)检测虫量(头)带毒虫量(头)带毒率(％)表A4南方水稻黑条矮缩病田间发病系统调查表调查地点：省县(市、区)站调查日间(月-日)类型田品种生育期调查总丛数病丛数(丛)病丛率（%）各级严重度的病丛数病情指数备注01234表A5南方水稻黑条矮缩病田间病情普查表调查地点：省县(市、区)站调查时间(月-日)品种生育期调查田块（块）发病田块（块）病田率（%）调查丛数（丛）发病丛数（丛）病丛率(％)—11— 表A6南方水稻黑条矮缩病发生基本情况调查地点：省县(市、区)站水稻类型水稻播种面积（667m2）见病面积（667m2）防治面积（667m2）发生面积（667m2）双季早稻双季晚稻单季中晚稻其它合计简述发生概况和特点：附录B（规范性附录）南方水稻黑条矮缩病模式报表表B1越冬代白背飞虱南方黑条矮缩病毒带毒率测定模式报表序号报表内容报表程序1234567891011调查日期取样面积（m2）捕获白背飞虱虫量（头）捕获虫量比上年增减比例（%）捕获虫量比常年增减比例（%）检测白背飞虱虫量（头）白背飞虱带毒率（%）带毒率比上年增减比例（%）带毒率比历年平均增减比例（%）发生面积比率（%）填报单位注：此表由白背飞虱越冬区各区域站在3月30日前调查汇报1次。—11— 表B2南方水稻黑条矮缩病灯下、田间白背飞虱带毒率检测模式报表序号报表内容报表程序1234567891011调查日期检测白背飞虱虫量（头）带毒虫量（头）加权平均带毒率（%）加权平均带毒率比上年增减比例（%）加权平均带毒率比常年平均增减比例（%）水稻生育期水稻生育期与白背飞虱高峰期吻合程度预计南方水稻黑条矮缩病发生程度(级)预计南方水稻黑条矮缩病发生面积比例（%）填报单位注：此表在5月5日、6月5日、7月5日、8月5日前调查上报。表B3南方黑条矮缩病田间发生情况系统调查模式报表序号报表内容报表程序12345678调查日期田间虫量（头/百丛）田间虫量比上年增减（%）田间虫量比常年增减（%）稻作类型本田病丛率（%）病情指数填报单位注：此表自田间见病后每月逢1日调查汇报1次。表B4南方黑条矮缩病田间发生情况普查模式报表序号报表内容报表程序12345678调查日期稻作类型生育期本田病田率（%）本田病丛率（%）病情指数见病面积（万亩）防治面积（万亩）—11— 910发生面积（万亩）填报单位注：此表于每季水稻发病稳定后调查汇报1次（早稻6月10日、中稻7月30日、晚稻9月20日）。附录C（规范性附录）南方水稻黑条矮缩病病情划分指标表C1　南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级指标级别症状0级健株，无症状；1级植株矮缩不明显，能抽穗，但穗小，结实率低，在中上部叶片基部可见纵向皱褶；在茎秆下部节间和节上可见蜡白色或黑褐色隆起的纵向排列小瘤突；2级植株矮缩丛生，高度不及正常株的3/4，有的能抽穗，但相对抽穗迟而小、实粒少、粒重轻，半包在叶鞘里，剑叶短小僵直；3级植株分蘖增多丛生，矮缩明显，高度不及正常株的1/2，主茎及早生分蘖尚能抽穗，但穗头难以结实，或包穗，或穗小，似侏儒病；4级植株严重矮缩，高度不及正常株的1/3，后期不能抽穗，常提早枯死。表C2　南方水稻黑条矮缩病发生程度分级指标发生程度轻发生（1级）偏轻发生（2级）中等发生（3级）偏重发生（4级）大发生（5级）发生面积占种植面积比例（%）＜30≥30≥30≥30≥30病丛率（%）＜1.01.1～3.03.1～10.010.1～20＞20附录D（规范性附录）南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）dot-ELISA检测方法1试验原理dot-ELISA是以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体的ELISA检测方法，具有简便、快速、特异、敏感、便于推广、不需特殊仪器等优点，目前在人类、动植物病原检测中广泛应用。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱（或水稻植株）样品的匀浆液点到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗南方水稻黑条矮缩病毒的鼠单抗，则单抗与固相抗原（SRBSDV）形成抗原-抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶（HRP）[检测植株时加入碱性磷酸酶（AP）]—11— 标记的抗鼠IgG抗抗体（即二抗），则抗抗体与上述抗原-抗体复合物结合形成抗原-抗体-酶标抗抗体复合物；加入显色底物，复合物上的酶催化底物生成沉淀型有色产物而显色。由于每步之间均有洗涤的步骤，若待测白背飞虱（水稻植株）样品中不含SRBSDV，则酶标抗体将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。肉眼观察斑点颜色有无及深浅来进行样品中SRBSDV的定性和半定量检测。2白背飞虱样品检测2.1主要试剂与材料准备0.01mol/LPBS10mlSRBSDV单克隆抗体0.1mlHRP标记羊抗鼠IgG二抗0.04mlTMB显色底物液4ml10×浓缩封闭液5ml10×抗体稀释液5ml20×浓缩洗涤液10ml以上试剂均保存于4℃下NC膜2张2.2操作步骤（1）一头白背飞虱放入1.5ml的离心管中后加入50-200ul0.01mol/LPBS，用牙签或200ul枪头捣碎飞虱；（2）5000rpm离心3min，如无条件此步可以省略;（3）取3ul上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，室温干燥10-20min;（4）NC膜浸入到封闭液中室温封闭30min;（5）NC膜放入用抗体稀释液1:1000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min;（6）水平摇床上用洗涤液洗膜3-4次，每次3min;（7）NC膜放入用抗体稀释液1:1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min;（8）水平摇床上用洗涤液洗膜4-5次，每次3min;（9）将TMB底物显色液滴加到膜表面进行显色反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察结果，并记录检测结果。2.3缓冲液配方（1）磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）：NaCl8g,KCl0.2g,KH2PO40.2g,Na2HPO4•12H2O3g，加蒸馏水950ml溶解后调pH至7.4，定容至1000ml。（2）封闭液：用去离子水将10×封闭液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的封闭液在4℃环境可保存一个月。（3）洗涤液：用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水），稀释后的洗涤液在4℃环境可保存一个月。（4）抗体稀释液：用去离子水将10×抗体稀释液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的抗体稀释液在4℃环境可保存一个月。2.4注意事项(1)硝酸纤维素膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用镊子和戴一次性PE手套取膜；(2)NC膜CK+处为阳性对照（点带SRBSDV的白背飞虱匀浆液）；—11— (3)NC膜CK-处为阴性对照（点无SRBSDV的白背飞虱匀浆液）；(4)NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；(5)抗体在使用前10min之内稀释;(6)阳性对照和阴性对照来自于带毒和非带毒的白背飞虱，仅用于dot-ELISA检测；(7)该试剂盒反应温度为4-38℃，最佳反应温度为37℃。2.5贮藏条件及保存期试剂盒于2-8℃避光保存，冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。3水稻植株样品检测3.1主要试剂与材料0.01mol/LPBS10mlSRBSDV单克隆抗体0.1mlAP标记羊抗鼠IgG二抗0.04ml10×浓缩封闭液5ml10×抗体稀释液5ml20×浓缩洗涤液20mlNBT储备液0.15mlBCIP储备液0.1ml底物缓冲液20ml以上试剂均保存于4℃下NC膜2张3.2操作步骤（1）水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（重量：体积，克/毫升）加入0.01mol/LPBS后研磨；（2）5000rpm离心3min;（3）去2ul上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，室温干燥10-20min;（4）NC膜浸入到封闭液中室温封闭30min;（5）NC膜放入用封闭液1：1000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min;（6）水平摇床上用洗涤液洗膜3-4次，每次3min;（7）NC膜放入用封闭液1：1000倍稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min;（8）水平摇床上用洗涤液洗膜4-5次，每次3min;（9）66ulNBT和33ulBCIP底物加到10ml底物缓冲液中混匀，洗好的膜放入底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察结果，并记录结果。3.3缓冲液配方（1）磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）：NaCl8g,KCl0.2g,KH2PO40.2g,Na2HPO4•12H2O3g，加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000ml。（2）封闭液：用去离子水将10×封闭液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的封闭液在4℃环境可保存一个月。—11— （3）洗涤液：用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水），稀释后的洗涤液在4℃环境可保存一个月。（4）抗体稀释液：用去离子水将10X抗体稀释液按1：9体积比进行稀释（1份10×封闭液+9份去离子水），稀释后的抗体稀释液在4℃环境可保存一个月。（5）底物显色液：66uLNBT和33uLBCIP加到10mL的底物缓冲液混匀。3.4注意事项（1）NC膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用镊子和戴一次性PE手套取膜；（2）NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；（3）硝酸纤维素膜CK+处为阳性对照（点含SRBSDV病毒的水稻叶片汁液）；（4）硝酸纤维素膜CK-处为阴性对照（点健康水稻叶片汁液）；（5）抗体在使用前10min之内稀释；（6）底物显色液要现配现用；（7）阳性对照和阴性对照来自于水稻病叶，仅用于dot-ELISA检测；（8）该试剂盒反应温度为4-38℃，最佳反应温度为37℃。3.5贮藏条件及保存期试剂盒于2-8℃避光保存，冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。附录E（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病测报基本依据南方水稻黑条矮缩病的发生为害与白背飞虱的虫源基数和带毒率、耕作制度、气候条件、白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度等关系密切。1虫源基数和带毒率南方水稻黑条矮缩病毒主要由白背飞虱携带传播，白背飞虱一旦获毒可终身带毒，若虫、成虫均能传毒，且传毒效率非常高，但不经卵传毒。带毒白背飞虱通过吸食传毒为害。南方水稻黑条矮缩病发生流行主要取决于白背飞虱种群数量及其带毒率高低。2耕作制度田间稻作复杂、杂草多，有利于带毒白背飞虱的辗转传毒为害；初步调查研究结果表明，育秧移栽田重于直播田；杂交稻重于常规稻；水稻混栽区重于连片稻作区；田块间发病程度差异显著等。近几年全国发生危害特点为中、晚稻重于早稻。3气候条件冬季气温偏高有利于白背飞虱越冬和其北界向高纬度延伸，扩大越冬范围和越冬虫源数量，增加毒源积累。春季强对流天气多，多雨有利于大量的南方越冬区白背飞虱随气流北迁。特别是5-8月份强降雨天气增多，迁入的白背飞虱虫量大，如果带毒率高，将是南方水稻黑条矮缩病大流行的主要因素。4白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度水稻秧苗期至分蘖前期对南方水稻黑条矮缩病毒的抵抗力比较差，为南方水稻黑条矮缩病侵入敏感期，若此期间遇上白背飞虱迁入峰（且白背飞虱带毒），极有利于病毒侵染发病。—11— 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