成年蛋鸡常规饲料营养价值体外评定方法的研究与建立

'摘要本研究根据常态下成年蛋鸡嗦囊、胃和肠道各消化器官的形态结构及消化参数的变化规律，建立成年蛋鸡消化环境参数模型，并依据原理，设计一套蛋鸡体外消化生物反应器，建立成年蛋鸡常规饲料营养价值的体外评定方法。试验一成年蛋鸡体内消化参数变化规律的研究实际测定不同FI龄成年蛋鸡消化参数，了解成年蛋鸡消化道内的生理环境，建立蛋鸡消化参数模型，为成年蛋鸡体外消化生物反应器提供依据。试验选择22周龄健康海蓝褐蛋鸡1440只，随机分为4组，每组8个重复，每个重复45只鸡，采食玉米■豆粕常规日粮。在常规饲养情况下，分别于24、25、34、44、54周龄每组随机选取8只鸡，分别测定食糜水分含量、pH值、总胆汁酸含量和各种消化酶活；同时测定十二指肠、空肠和回肠长度。结果表明:在24~54周龄期Z间，嗦囊、胃食糜pH值均随周龄增加而逐渐升高，但是变化范围非常小，空场内pH值相对稳定。随周龄的增加，嗦囊、胃和空肠食糜的水分含量均无明显变化，相对稳定，但是空肠食糜含水量明显高于嗦囊和胃。小肠发育已稳定，随周龄增加无明显变化。总胆汁酸含量随周龄的增加逐渐升高，24-44周龄时总胆汁酸含量较高且相对稳定，44周龄后降低较快。成年蛋鸡胃蛋白酶随周龄增加而降低，但在24~34周龄时相对稳定，且酶活水平较高，44周龄后酶活明显降低。脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活24~44周龄相对稳定，44周龄后糜蛋白酶和淀粉酶下降较快。分别建立成年蛋鸡消化参数模型。试验二成年蛋鸡消化代谢试验本试验选取35周龄健康海蓝褐蛋鸡240只，随机分为3组，每组40只，每组2个重复，每个重复20只鸡。日粮为玉米•豆粕常规日粮，日粮中添加0.2%外源指示剂三氧化二辂，预试期为1周，试验期为3周。采用全收粪法连续收集3天粪样，65烘干，测定常规口粮中粗蛋白质、能量和各种氨基酸在成年蛋鸡体内的消化利用率(%)。结果表明：35周龄成年蛋鸡对常规口粮中粗蛋白质、代谢能和各种氨基酸等营养物质的表观消化利用率水平较髙且相对稳定。试验三成年蛋鸡体外消化方法的建立成年蛋鸡体外消化方法的建立包括四部分：消化参数的确立、生物反应器的设计、消化步骤的确立以及体外消化方法的优化。1消化参数的确立:根据成年蛋鸡体内消化参数的测定结果及相关文献资料，确立成年蛋鸡嗦囊、胃和小肠内食糜的pH值、水分含量、胆汁酸含量、各种消化酶水平和食糜的停留时间等主要消化参数，应用商品胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和猪胆汁提取物替代成年蛋鸡消化道内的消化酶和胆汁酸。2生物反应器的设计:依仿生学原理设计生物反应器。生物反应器有以下几部分组成：消化装置、恒温振动装置、流速控制装置、消化液接收装置。3消化步骤的确立：消化步骤分为嗦囊消化期、胃消化期和小肠消化期。4体外消化方法的优化：主要是饲料粒度和透析液流速的优化。经过优化后确定饲料体外消化方法中饲料样品的粒度为60目、透析液流速为1.5ml/min0试验四体外消化方法的检验应用试验三建立的体外消化方法，通过测定饲料氨基酸的消化率来检验此体外消化方法的可行性。结果表明:总氨基酸的消化差异不显著；单个氨基酸的消化率：除天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、绷氨酸、亮氨酸苯芮氨酸和酪氨酸体内外消化率差异显著外，其余氨基酸消化率差异均不显著。关键词：成年蛋鸡；常规饲料；营养价值；体外消化；消化参数Studyontheevaluationmothod fornutritionalvalueofconventionalfeedstuffofadultlayersinvitroAuthor：MeiXueWenTutor：ChenBaoJiangMajor：AnimalNutritionandFeedScieneeAbstractThestudywasontheruleofvariationofdigestivegut(gizzard,proventriculusandsmallintestine)andjuicedevelopmentofadultlayerstosetupaninvitrodigestionmethodfornutritionalvalueofconventionalfeedstuff.Experiment1StudyontheGastrointestinalParametersofadultlayersInthisexperiment,Digestionparametersofadultlayersindifferentageweredeterminedtosetupthegastrointestinalparametersmodel.144022-weekslayerswererandmlyassignedto4groupswith8repeats45eachandfedcorn-soybeanmealdiet.Layersat24,25,34,44,54weeksoldwerekilledtogetthechymeincrop,proventriculusandgizzard,duodenumjejunumandileum.Moisture,pHanddigestiveenzymeactivitiesweremeasuredrespectively.Thelengthofduodeum,jejunumandilenumweremeasuredtoo.TheresultshowedthatchymepHingizzardandproventriculusincreasedgraduallywithagein24~54weeksandkeptstableinjejunum・Moistureofchymeinjejunum尼izzardandproventriculuskeptstablewithage.Moistureinjejunumobviouslyhigherthanthatingizzardandproventriculus.Thesmallintestinehasdevelopedsteadyandnochangeswithage.ThecontentofTBAincreasedgraduallywithage.Between24and44weeksthecontentofTBAwashigherandstable,butdropedrapidlyafter44weeks・Pepsinumactivitiesinadultlayersdecreasedwithagebutkeptstablebetween24to34weeksanddropedrapidlyafter44weeks.Lipase,trypsinandchymaseactivitieskeptstablein24to44weeks.Chymaseandamylaseactivitiesdropedrapidlyafter44weeks・Experiment2DigestiveandmetabolictrialforadultlayersinvivoInthisexperiment,24035-weekshealthylayerswererandmlyassignedto3groupswith2repeats20eachwhichwerefedcorn-soybeanmealdietwithchromiumoxideasindicator.ltlasted4weeks.Feaceswerecollectedforthreedaysanddriedat65oC.Thedigestibilityofcrudeprotein,energyandaminoacidofadultlayersweredetermined.Theresultshowedthatthedigestibilityofcrudeprotein’energyandaminoacidofadultlayerskepthigherandstablerelatively.Experiment3EstablishofdigestionmethodinvitroforlayervitroInvitrodigestionmethodineludesfourparts:establishmentofdigestiveparameters,designofbioreactor,establishmentofdigestivestepsandoptimizationofindigestioncondition.Establishmentofdigestiveparameters：Inthisstage,pH,moisture,digestiveenzymeslevelandchymeretentiontimeincrop,proventriculus尼izzardandsmallintestineweredeterminedrespectivelyaccordingtotheresultsofexperiment1.Commercialdigestiveenzymes(pepsin,pancreatir^trypsin,amylaseandlipase)wereusedtoimitatethatofadultlayersgastric-intestinaltractrespective!y.Designofbioreactor：accordingtotheprincipleofbionics,bioreactoroflayergastric-intestinaltracthasthefollowingseveralparts:digestiondevice,constanttemperaturecontroldevice,flowspeedcontroldeviceanddigestivejuicereceivers・Establishmentofdigestivesteps:digestivestepsoflayer werethecropdigestionphase,stomachdigestionphaseandintestinedigestionphase.Optimizationofinvitrodigestioncondition:testshowedthattheoptimalfeedsizewas60meshanddialysateflowspeedwas1.5ml/min.Experiment4TestforinvitrodigestivemethodAccordingtotheresultofExperiment3,thedigestibilityofaminoacidofthefeedweremeasuredtotestthefeasibilityofthemethodofinvitrodigestion.Resultsshowedthatdigestibilityoftotalaminoacidhasnotsignificantdiffereneebetweeninvitroandinvivo.Thedigestibilityofasparticacid,glutamate,arginine,valine,leucine，phenylalanineandtyrosinehadobviousdifferencesbetweeninvitroandinvivo.KeyWords：Adultlayers；Conventinonalfeedsuff；Nutritionalvalue；Invitro；DigestionParametersFl录引..11禽类体外消化方法研究进展11.1理论依据11.2体外消化方法的分类213禽类体外消化试验发展历程31.4鸡体外消化方法研究现状41.5体外消化在生产中的应用41.6体外消化研究中存在问题41.7研究意义与目的5第一章成年蛋鸡体内消化参数变化规律的研究61试验材料与方法61.1试验动物及饲养管理61.2试验日粮61.3试验样品的采集与预处理71.4检验指标与测定方法72结果82.1成年蛋鸡各段消化道内pH值、水分含量及小肠长度随周龄的变化情况82.2消化道食糜屮儿种主要消化酶活性随周龄的变化规律92.3成年蛋鸡空肠食糜中胆汁酸含量随周龄的变化规律113讨论123.1成年蛋鸡各段消化道内pH值、水分含量及小肠长度随周龄的变化规律123.2成年蛋鸡空肠食糜消化酶活性随周龄的变化规律133.3空肠食糜胆汁酸含量随周龄的变化规律144结论14第二章成年蛋鸡消化代谢试验161试验材料与方法161.1试验设计16 1.2试验日粮161.3试验样品的采集及预处理171.4检测指标与测定方法171.5营养物质表观消化率172结果及分析18第三章体夕卜消化模拟方法装置的研究及条件的确立191体外消化模拟方法确立191.135周龄成年蛋鸡体外消化环境参数的确定191.2生物反应器的设计与消化液的配制201.3体外消化方法操作程序的确立211.4体外消化模拟试验条件的优化222讨论232.1透析液流速大小对体外营养物质消化率的影响232.2样品粒度大小对体外营养物质消化率的影响243结论24第四章体外消化方法的检验251试验材料与方法251.135周龄成年蛋鸡体外消化环境参数的确定251.2试验仪器及溶液配制251.3试验设计251.4试验步骤251.5检测指标及测定方法261.6氨基酸消化率的计算262结果263讨论274结论27参考文献28在读期间发表的学术论文32作者简介33致谢341引言众所周知，饲料营养价值的准确评佔是满足动物营养需要、提高饲料价值的前提，所以评定饲料的营养价值非常重要。评定饲料营养价值的方法主要有化学分析法、体内法及体外法等。化学分析法是评定饲料营养价值的一种常用方法，如总能、总磷、粗蛋白、粗纤维和粗脂肪等测定方法。但利用概略养分分析所测得的饲料养分与动物消化吸收养分间存在很大差异，不足以准确地反映出饲料的实际营养价值；体内法乂分为:平衡试验法、同位素示踪法、原位结扎灌注肠段 法和自然饲喂法。体内法的优点是，在基于保持动物正常生理状态和肠上皮细胞的代谢活动及功能正常的水平下，研究营养物质的吸收变化，能够比较准确地对饲料营养价值进行评定。但是，体内试验中动物个体的条件控制一致相对困难，结果变界较大，重复性差，同吋很难在短时间内对大量的饲料样品进行评价分析，限制了其实用性；体外法又分为半体外法和体外法。半体外法包括：外翻肠囊、体外灌注肠段；体外法即体外消化模拟技术，是通过模拟动物消化生理规律，采用与动物体内相应的消化酶系在体外评定饲料消化吸收的一种方法。体外法的优点是:可以控制试验条件，干扰因素较少，因而结果的重现性较好、试验时间短、成本低[1]O但是，体外消化模拟技术是处于非正常生理状态下的，其结果能否用于说明体内情况，因此体外试验的结果必须用严格控制的体内试验加以验证。随着养殖业的的不断壮大，饲料行业的不断发展，体外法越来越受到人们的青睐，体外法的创新也成为营养研究的重点，各种动物饲料营养价值体外评定方法的研究均取得了一定成果。Moughan等⑵实验表明：H粮消化率的好坏能够通过快速、简便的体外消化模拟技术来评定。我国是禽蛋生产笫一大国，在供给理想的营养水平和管理措施下，入舍母鸡72周龄产蛋量可达280枚以上，因此，蛋鸡饲料营养水平的高低至关重要。据报道：供给家禽满足生产力要求的日粮营养后，再供给过多的营养并不能提高生产力，并且长期营养水平过量会产生营养代谢病，如脂肪肝综合症等。但是，如果饲料营养供水平给不足，蛋鸡的高生产力性能就不能充分发挥。可见蛋鸡饲料营养水平的评定至关重要，所以成年蛋鸡饲料营养价值体外消化方法的研究意义深远。1禽类体外消化方法研究进展1.1理论依据饲料营养物质在动物体内的消化吸收是一个非常复杂的过程，体外消化模拟技术是根据动物体内的消化吸收原理在体外模拟动物体内消化吸收的方式。1.1.1营养物质在动物体内的的消化营养物质在动物消化道内主要经过物理消化、化学消化和微生物消化，但是仍以酶的化学消化占主导地位。饲料中蛋白、淀粉、脂肪含量要与家禽消化道发育中相应消化酶活性相适应，否则可能引起营养不足或消化不良，而导致生反迟缓或各种疾病的发生0不同品种间营养物质消化率不同与酶的性质相关，如蛋鸡、肉鸡粗蛋白质表观利用率和消化道胰蛋白酶活性相一致,粗2脂肪表观利用率与胰腺和食糜屮脂肪酶活性高低相对应⑷:袁建敏⑸等比较肉仔鸡与蛋公鸡蛋白消化酶活性和饲料氨基酸消化率后，证明蛋白消化酶的高低与饲料氨基酸消化率有关；同一动物不同消化道部位的消化率不同也主要与消化到部位的酶活及酶的种类相关，如大部分淀粉在十二指肠前消化[6]o年龄对鸡饲料营养物质的消化吸收也可能与其消化道内酶的发育有关，Freeman 等⑺研究表明肉鸡出生时对动物脂肪的消化率很差，1~8周龄时消化脂肪的能力逐渐增加，这主要是由于刚出雏时胰腺分泌的脂肪酶不足所致。Longland⑻报道年龄与消化酶的合成、分泌有关，而AlexMaiorka等的报道则表明：鸡胰脏酶活不受年龄的影响。所以，以动物消化道内实际消化参数（温度、ph值、消化酶的活性及种类、胃肠运动等）为依据建立的体外消化模拟技术來预测家禽饲料体内消化率的方法是可行的，预测结果用于估算体内消化率也具有实用意义。1.1.2营养物质在动物体内的吸收营养物质在动物体内经过各种消化酶的降解后生成的氨基酸、单糖、甘油一酯、廿油和脂肪酸，以及离子、维生素及水，它们的吸收是由小肠黏膜细胞来完成的，即主要在小肠中进行。吸收过程包括4个基本方面：①营养素分子从肠腔到肠壁的物理运动；②肠上皮细胞表面积的最大化；③营养素穿越上皮细胞膜进入细胞质的机制；④营养素从肠上皮细胞移出转运到细胞外体液（血液或淋巴）。其中营养素分子从肠腔到肠壁的物理运动主要包括肠蠕动（混合运动）与上皮细胞吸收与分泌造成的液体流动引起的肠内容物的对流混合，以及上皮细胞界面层的扩散交换。扩散与在细胞表面与肠腔间的溶质浓度差异及交换面积成正比。在体外消化模拟技术中营养物质的分离技术即依此为依据而选用透析法。所以，体外消化模拟技术屮对营养物质吸收的模拟是以动物体内营养素吸收过程的第-步为主要依据。1.2体外消化方法的分类体外消化方法根据体外消化应用酶的种类和来源等分为以下两类：（1）单酶评定法主要利用胃蛋白酶在体外进行模拟消化。蛋白质体内消化率的预测是通过蛋白质的水解程度来判断的。Pedersen等[10]建立了一套保持pH值恒定不变单酶法预测蛋白质体内消化率的操作程序，并利用该方法分别预测了31种植物性蛋白质饲料和11种动物性蛋白质饲料的体内消化率，相关性分别为=0.85和0.92。研究表明:在一定范围内，可以通过测定蛋白质水解程度来预测饲料蛋白质体内消化率。此法只适合对饲料中蛋白质一种养分的营养价值和体内消化率进行评价和预测。Shefiher等[11]研究表明，利用单酚法评定蛋白质饲料时，饲料品质易受饲料粒度和胃蛋白酶剂量等因素的影响，并且胃蛋白酶水平的高低直接对酶消化方法的可靠性产生影响。（2）多酶评定法饲料养分在动物消化道内的消化过程，不是由某种单一消化酶独立完成，因此必须对动物消化道内的各种环境条件进行有效模拟，所预测的结果才能与体内情况更为接近。随着对畜禽消化生理的深入研究，体外消化模拟技术市过去的单一酶法发展为现在的多酶法，多酶法根据模拟消化部位的不同乂分为两步酶解法和三步酶解法。两步酶解法即模拟胃•小肠两部分的消化，先用胃蛋白酶进行消化，然后用肠液或胰酶进行消化，消化结束后利用离心或过滤的方法将已消化养3分和未消化养分进行分离 [12]，此方法分离出来的蛋白质消化产物分子量通常偏大或偏小[13]o为了可服消化产物累积对酶促反应的抑制作用，Cave等[14]在利用半透膜去除消化产物吋发现，去除消化产物可以提高体内与体外养分消化率的相关性，因此消化产物的分离技术引进了透析法。Maurn[15]建立了不连续透析法，将小肠消化过程放在透析袋内进行，并将透析袋浸泡在pH值呈中性的缓冲液中，使消化产物不断从透析袋内透析出來进入缓冲液。该方法明显降低了消化产物积累对水解反应的抑制作用，提高了饲料养分酶解消化率。Drake[16]对透析袋截流分子量的大小及透析时间等对口粮营养輛解消化率的影响作了研究。研究表明：透析袋的截留分子量是影响酶解消化率的主要因素。三步酶解法既胃■小肠•大肠三部分，在两步酶解法的基础上增加了瘤胃液或碳水化合物酶。Boisen和Fernandez[17]研究表明：三步酶解发可以用來评定单胃动物日粮的消化能。多酶法不但对胃消化过程进行模拟，而且还对小肠消化以及大肠消化等过程进行模拟。不仅增加了酶的数量还增加了消化产物的分离技术。1.3禽类体外消化试验发展历程虽然饲料营养物质在禽类体内的消化是一个非常复杂的过程，但是与反刍动物的消化过程相比还是要简单的多。饲料营养物质在禽类体内的消化屮微生物的消化作用不大[18]o酶的消化作用是禽类体内最主要的消化方法。因此，用体外消化法评定禽类饲料营养价值更具有说服力,并且营养学家对家禽体外消化方法的研允也取得了许多成功经验。禽类体外消化模拟方法的发展分为以下儿个阶段：第一阶段：利用猪的体外消化法评定禽类饲料营养价值。Sakamoto等[19]利用胃蛋白酶-猪小肠液测定了4种鸡饲料干物质和粗蛋白质的消化率，发现与鸡体内消化代谢实验结果存在显著相关；卢福庄等[20]、杜荣等[21]用胃蛋白酶•猪小肠液冻干粉估测鸡饲料代谢能值，亦均取得了较好的结果。这说明利用猪的消化酶谱来模拟机体内消化过程是可行的。虽然利用猪体外消化模拟操作方法和采用猪的内源消化酶能够在一定程度上用来估测鸡体内养分消化率，但还远远不能完 全替代禽类消化道的消化环境。第二阶段：根据禽类体内消化参数配制人工消化液评定饲料营养价值。Bedford等[22]以胃蛋白酶和胰酶为消化酶源，在与鸡消化道内pH接近的条件下，通过对不同的胃蛋白酶和胰酶水平以及消化时间对食糜粘性的影响，确立一套适合于鸡的酶法评定饲料营养物质消化率的操作程序。在此基础上，Zyla等[23]以火鸡为试验动物对该方法进行了改进，实际测定了火鸡嗦囊、胃和小肠内食糜的pH作为酶法模拟中的pH参数，不仅对胃和小肠的消化过程进行了模拟，还模拟了鸡的嗦囊。同时，还将透析法应用于该方法中，消除消化产物对酶促反应的抑制作用，该方法也是目前鸡体外消化模拟方法中较为成熟的一种。荷兰学者Larsson(1997)等[24]对Zyla等的操作方法进行改进，使用的胃肠道动态模型，包括胃、十二指肠、空肠、回肠四个连续模拟室,并通过计算机来调控人工小肠液的分泌及消化环境的调节，使其结果更接近鸡消化代谢实验实际结果。张铁鹰[25]在Zyla的基础上以肉仔鸡为试验动物，实际测定了肉仔鸡各消化道内食糜的酶活、含水量、胆汁酸含量和pH作为体外消化的参数，建立了一套肉仔鸡酶法评定日粮营养价值的模拟程序，此方法消除了酶法评定过程中胆汁对消化率的影响，成功评定了肉鸡日粮中粗蛋白质、淀粉的消化率及植酸酶的作用效果。但是人工消化液法要根据不同的饲料特性选择不同种类的酶谱。4第三阶段：采収禽类肠液评定饲料营养价值。赵峰等[26]对小肠液的获得和保存方法进行研究，用胃蛋白酶和鸭小肠消化液法评定了鸭的饲料代谢能。此法与家禽体内消化物质最为相符,但是采集消化液対禽类应激过重，禽类的恢复状况与健康动物有一定差异。1.4鸡体外消化方法研究现状营养物质在鸡消化道内主要经过物理消化和化学消化，微生物在鸡饲料营养物质的消化屮不起直接作用，它主要是通过改变肠道形态来提高营养物质的消化。因此体外消化法评定成年鸡饲料营养价值具有先天的优势。在众多体外消化方法中，大多都是以猪作为研究对象，所采用的参数也均以猪体内参数作为参考。最初鸡体内消化率的预测也是利用猪体外消化模拟参数程序。李文英等[27]用预测猪体内能量的胃蛋白酶■小肠液冻干粉的体外消化模拟方法佔测鸡饲料代谢能值，均収得了较好的结果。虽然它可以用来估测鸡体内养分消化率，但是还不能完全替代，毕竟鸡与猪的消化生理存在不同。如消化道pH、食糜在消化道内的停留时间、消化酶分泌水平和酶谱以及这些酶催化反应的最适条件等均有所不同。随着鸡养荊业的扩大，鸡体外消化模拟技术也迅速建立。但是鸡体外消化模拟技术的研究相对较少，尚不成熟，还有待与进一步加强。1.5体外消化在生产中的应用 随看对动物消化生理的不断深入研究，现代科学技术的发展，体外消化模拟技术也得到了很大的发展，并FI益成熟。尤其是猪体外消化模拟技术的研究报道和规范化操作程序比较多。人量试验研究表明，通过体外消化模拟技术所获得饲料养分消化率与其体内养分消化率之间存在显著相关，体外消化模拟技术在生产中主要应用于以下几方面：一方面是利用体外消化模拟技术预测饲料体内养分消化率。（李文英等；Boison等；黄瑞林等）[27-30]利用体外消化模拟技术成功估测饲料体内养分消化率均取得了显著成果。另一方面是利用体外消化模拟技术测定饲料添加剂对饲料养分消化率和抗营养因子降解率的影响（Lowgem等；Smulikowska等；Zyla等；黄辉等；Bedford等；Liu等;曾志伟等）。[31-36]第三方血是利用体外消化模拟技术筛选复合酶的最佳组合和适宜用量。（谢新东等；张宏福等）[37,38]利用体外消化模拟技术成功筛选出了鸡日粮中复合酶的最佳配方。大多研究表明，用体外消化模拟技术评定饲料营养的作用效果是可行的。与动物试验和测定酶活法相比，利用体外消化模拟技术法评定酶制剂既克服了二者的不足，又继承了体内法的优点。1.6体外消化研究中存在问题营养物质体内的消化吸收是一个动态的连续过程，在受到各种刺激后，由神经系统和激素来进行精确调控，完全模拟这个复杂的过程是不可能的。经多年的研究表明，禽类体外消化模拟方法己有了很大进展,在科学研究和实际生产中也发挥了其应有的作用，但仍然存在许多不足。（1）胃蛋白酶-小肠液法主要存在问题：①肠液的制取复杂，且工作量大；②肠液屮酶活受动物个体、饲养水平、釆集部位及年龄等因素的影响，活性高底变化较大。5AlexMaiorka等报道：鸡消化道内脂肪酶的酶活水平受日粮屮能量水平的影响；③猪肠液中酶的活性与鸡的不同，包承玉等[39]报道猪小肠液中的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性比鸡十二指肠及后段肠液中对应的活性低很多。Valdes和Leeson[40]用胃蛋白酶一猪胰液素两步酶水解法测定71个成年公鸡日粮的体外消化能值，得出了胰液素中酶的活性及组成、酶水解条件参数是制约此方法准确性的主要限制因素。④鸡个体较小，手术安装痿管不便，肠液的制备受阻。（2）胃蛋白酶和肠道消化酶法主要存在的问题：①酶适宜添加量的确定，酶活性受tl粮类型和鸡的年龄等因素的影响，张铁鹰[41]等研究表明肉鸡空肠内容物中消化酶随日龄增加而增加，达到峰值后逐渐降低，但仍比峰值前高，并逐渐趋于稳定。Noy等[42]报道，与4口龄相比，21日龄仔鸡十二指肠中淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶净分泌活性分别增加了100、50、20倍。消化道内酶活很容易受日粮成分的影响，万辉等[43] 报道：在蛋鸡日粮中添加稀土壳糖胺螯合盐使小肠食糜中胰蛋白酶和淀粉酶活性均在一定范围内有所提咼0①消化酶种类的确定，鸡消化道内主要的消化酶系为胰腺分泌的胰液中所含的消化酶，有胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等，Krogdahla等[44]研究表明：此酶系活力强弱是衡量机体消化能力强弱的极佳指标，此外还有一些辅酶，如二肽酶、弹性蛋白酶等；②肠道消化液中酶活的高低，消化道酶活高低除了受鸡本身决定外，还受饲料原料影响，此外，一些消化酶辅助因子（如Na水平）的影响[45]0（3）操作过程中存在的问题：①每一消化阶段的混合强度及样品的粒度。酶法评定时饲料的粉碎粒度对营养物质的消化率有明显影响[46]0②鸡体内的机械降解，如肌胃蠕动时沙粒对饲料的研磨作用影响饲料消化率；③消化器官对某类营养物质的再利用，在酶法操作过程屮无法实现；④营养物质的分离方法，目前所分离出的已消化养分与鸡体内实际吸收的情况可能存在差异。如，酶法估测饲料消化率吋采用差值法计算，一些可溶性蛋白包含在内，而实际生产中一些可溶性蛋白不一定能被动物吸收利用。1.7研究意义与目的虽然体外消化方法的研究已取得了很多的成功，但仍存在着很多的不足。例如体外消化参数的确定方法、己消化养分的分离及对影响体外营养物质消化率的因素考虑的全面性等方面,尚存在许多的问题需要解决。有关蛋鸡体外消化模拟技术的研究报道相对较少。本试验通过研究成年蛋鸡体内儿种主要消化参数的变化规律，设计成年蛋鸡体外消化生物反应器，确立相关的体外消化参数。通过模拟成年蛋鸡饲料营养物质在嗦囊、胃和空肠的消化吸收,来测定成年蛋鸡饲料营养物质体外消化率，利用成年蛋鸡体内营养物质消化率与体外消化率相关性的高低来检验该方法预测体内营养物质消化率的可行性与可靠性，建立一套成年蛋鸡体外消化方法，为常规饲料营养物质的体内消化利用率提供参数，进而为成年蛋鸡常规日粮营养水平供需是否平衡提供依据，避免营养的浪费，减少营养代谢病的发生机率。6第一章成年蛋鸡体内消化参数变化规律的研究鸡消化道内稳定的pH值和含水量，是保证各种消化酶完成正常催化反应、己消化养分吸收以及消化道内有益菌群正常繁殖的重要前提条件。小肠是养分消化和吸收的主要部位，小肠发育情况将直接对饲料养分消化利用产生影响。本研究将通过对各日龄成年蛋鸡消化道食糜pH、含水量以及小肠的长度进行实际测定，探讨成年蛋鸡消化道食糜pH值、含水量以及小肠长度随日龄的发育情况。消化道内酶活水平将直接对饲料养分利用和生产性能产生影响。为此，本试验将分别对24-54周龄的成年蛋鸡腺胃和肌胃食糜屮的胃蛋白酶，空肠食糜中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪輛等4种酶活随周龄变化情况进行研究。1试验材料与方法1.1试验动物及饲养管理 试验动物：选择20周龄健康海蓝褐产蛋鸡1440只，随机分为4组，每组8个重复，每个重复45只鸡。以重复为单位笼养群饲。饲养管理：按养殖场原来的管理方式；免疫程序按常规进行；口由采食。1.2试验日粮H粮组成及营养水平见表1。表1日粮组成和营养水平Table1Compositionandnutrientlevelofexperimentaldiet饲粮成分(%)Composition(%)营养水平NutrientLevels玉米Corn58.70代谢能ME(MJ/Kg)10.82豆粕Soybeanmeal16.50粗蛋白CP(%)17.05棉粕Cottonseedmeal9.00钙Ca(%)3.41秋皮Rapeseedmeal5.00有效磷AP(%)0.35磷酸氢钙Dicalciumphosphate1.33赖氨酸Lys(%)0 .72石粉Limestone8.60蛋氨酸Met(%)0.35食盐Salt0.20色氨酸TryO.18氯化胆碱Cholinechloride0.10苏氨酸ThrO.61微量元素Traceelements0.30维生素Vitamins0.04蛋氨酸Met0.13赖氨酸Lys0.10总计Total10071.3试验样品的釆集与预处理在自由采食和饮水的条件下，分别于24、25、34、44、54周龄每个重复随机选择健康的蛋鸡6只，断颈致死，迅速取出嗦囊、胃和空肠食糜放入不同烧杯中混匀。取部分胃（腺胃、肌胃）及空肠食糜装入离心管内迅速放于・80°C的冰箱屮保存备用；准确称取2g空肠鲜食糜于・4°C12000r/min条件下离心15min,,取上清液放于・80°C冷冻保存备用。1.4检验指标与测定方法1.4.1成年蛋鸡消化道内食糜pH值、水分含量及小肠长度指标测定食糜pH值测定：用SPH-3C型pH计直接测定鲜食糜pH值；食糜水分含量测定：分别准确称取2g嗦囊、胃（腺胃与肌胃）和空肠（空肠：胆管入口处至憩室）食糜测定水分含量；小肠长度测定：用精确度为0.1mm的刻度尺分别测定十二指肠、空肠及回肠的自然长度。1.4.2成年蛋鸡消化道内食糜中几种主要消化酶活指标将各日龄胃（腺胃、肌胃）和空肠食糜解冻，混匀，按照各种酶测定方法的要求进行匀浆、酶活测定。胃蛋白酶活性测定：南京建成公司的胃蛋白酶试剂盒（A080J）测定；测定仪器：UV-2102PCS型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司），恒温水浴锅。胰蛋白酶活性测定：南京建成公司的胰蛋白酶试剂盒（A080-2）测定；测定仪器：UV—2102PCS型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司），恒温水浴锅。糜蛋白酶活性测定：根据Wirnt[47]方法以BTEE⑸gmaB6125）为底物测定，糜蛋白酶活性定义单位为在25°C,pH7.80下每分钟释放1umol苯甲酰精氨酸时所具有的活性;测定仪器：UV—2102PCS型紫外可见分光光度计淀粉酶活性测定：南京建成公司的淀粉酶试剂盒测定仪器：UV-2102PCS型紫外可见分光光度计脂肪酶活性测定：南京建成公司的脂肪輛试剂盒测定仪器：UV—2102PCS型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）,（C016）测定；（尤尼柯仪器有限公司）,（A054）测定。（尤尼柯仪器有限公司）,恒温水浴锅。恒温水浴锅。恒温水浴锅。1.4.3成年蛋鸡消化道食糜总胆汁酸含量指标取出空肠食糜上清液迅速解冻，测左总胆汁酸含量。总胆汁酸含量测定：应用北京九强生物技术限公司的总胆汁酸试剂盒（GS061G）测定，方法为酶循环法。82结果2.1成年蛋鸡各段消化道内pH值、水分含量及小肠长度随周龄的变化情况消化道内pH是各种消化酶活性高低的主要条件，水是消化道内各种成分消化吸收的中间介 质，小肠是营养物质消化吸收的主要部位，小肠的发育情况与饲料营养物质的消化吸收直接相关。2.1.1成年蛋鸡各消化道内pH值随周龄的变化规律成年蛋鸡各段消化道内pH随周龄的变化情况见图lo由图可知，嗦囊、胃（腺胃和肌胃）和空肠食糜的pH分别在4.16~5.20、2.59~4.10和6.32^6.38之间。嗦囊内食糜的pH值随周龄的增加逐渐升高；胃及空肠内食糜的pH值总体來看逐渐升高，但在34〜54周龄内变化幅度不大。图1成年蛋鸡食糜pH随周龄的变化规律Fig.lChangesofthymepHindifferentpartofgastro-intestinaltractinadultlayerwithweeks对pH值数据进行统计分析获得pH值与周龄关系的回归方程：方程中的y为pH值，x为周龄数，嗦囊：y=2E-05x3-0.0022X2+0.0819X+5.38&R2=0.7982；胃：y=0.0002x3-0.0208X2+0.8922x-7.3816,R2=0.9826；空肠：y=lE-04X3-0.0131X2+0.5891X-5.1842,R2=0.9248o2.1.2成年蛋鸡各段消化道内水分含量随周龄的变化情况成年蛋鸡各段消化道内水分含量随tl龄的变化情况见图2。由图可知：嗦囊、胃和空肠食糜的水分含量分别在55.84~61.28%、57.45~61.08%、77.51~83.41%之间。随周龄变化，消化道不同部位食糜含水量无明显的增加或降低趋势，均保持相对稳定，但空肠食糜的含水量均明显高于嗦囊和胃内食糜。食糜pH值04680102030405060周龄pH 值嗦囊食糜pH值胃食糜pH值空肠食糜pH值9图2成年蛋鸡食糜水分随FI龄的变化规律Fig.2Changesofthymemoisture(%)inbroilergastri-ointestinaltractinadultlayerwithweeks对食糜水分含量的数据进行统计分析获得水分含量与周龄关系回归方程：方程中y为水分含量，x为周龄数，嗦囊：y=-0.0009x3+0.1229X2-5.3341X+130.42,R2=0.9545,胃：y=-0.0002x3+0.0296X2-1.4298X+80.753,R2=0.9503；空肠:y=-0.0013x3+0.1664X2-6.8446X+170.14,R2=0.99082.1.3成年蛋鸡小肠长度随周龄的变化规律小肠各段氏度随周龄变化规律见图3。成年蛋鸡小肠在24周龄吋已发育完全，小肠长度随周龄的增加几乎无变化，小肠的空肠最长，十二指肠最短。可见空肠是鸡小肠消化吸收的主要部位。小肠长度0204060802425344454周龄度(cm)长十二指肠长度空肠长度回肠长度图3成年蛋鸡小肠长度随日龄的变化规律Fig.3Changesofsmallintestinelengthinadultlayerwithweeks 2.2消化道食糜中几种主要消化酶活性随周龄的变化规律2.2.1成年蛋鸡胃蛋白酶水平随周龄的变化规律成年蛋鸡胃蛋白酶水平随周龄的变化情况见图4。本实验结果表明：在24周龄时胃蛋口酶活己达到最高水平，在24~34周龄Z间相对稳定，食糜水分含量0501000102030405060周龄水分含量(%)嗦囊水分含量胃水分含量空肠水分含量10但44周龄后酶活迅速下降。图4胃蛋口酶活性随周龄变化的规律Fig.4Changesofpepsininchyeminadultlayerwithweeks对胃蛋白酶活性数据进行统计分析获得胃蛋白酶活性与周龄关系回归方程：方程中y为胃蛋白酶活性，x为周龄数，胃蛋白酶活性:y=-0.1564x2+7.011X+185.343,R2=0.9679,222成年蛋鸡空肠食糜消化酶活性随周龄的变化规律成年蛋鸡空肠食糜内消化酶活性变化规律见图5、6、7。总体看来空肠内胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性随周龄增加而逐渐降低。这说明成年蛋鸡消化道内消化酶在24周龄吋达到最佳水平。24^34周龄淀粉酶和脂肪酶活相对稳定，活力较高，34周龄后消化酶活水平明显下降(图5)；胰蛋白酶和糜蛋白酶活亦在24~34周龄酶活水平相对较高，34周龄后活力降低(图6、7)。图5脂肪酶和淀粉酶随Id龄的变化规律Fig5Changesoflipaseandamylaseinchyeminadultlayerwithweeks胃蛋白酶活性0.00050.000100.000150.000200.000 250.000300.0000102030405060周龄胃蛋白活性(u/g)胃蛋白酶酶酶活0.00100.00200.00300.00400.00500.000102030405060周龄酶活性(u/g)淀粉酶脂肪酶11对脂肪酶和淀粉酶活性数据进行统计分析活的脂肪酶及淀粉酶活性与周龄关系回归方程:方程中y为脂肪酶活性或淀粉酶活性，x为周龄数，脂肪酶活性与周龄关系：y=-0.2567x2+13.679X+224.3,R2=0.9291；淀粉酶活性与周龄关系：y=-0.0011x2-4.0912X+497.03,R2=0.9326；图6胰蛋白酶随口龄变化规律Fig6Changesofrypsintinchyeminadultlayerwithweeks对胰蛋白酶活性数据进行统计分析获得胰蛋白酶活性与周龄关系的回归方程:方程中y 为胰蛋白酶活性，x为周龄数，胰蛋白酶活性与tl龄关系回归方程：y=27.956x2-31641X+3E+06,R2=0.942；图7糜蛋白酶随H龄增加变化规律Fig7Changesoftrypsininchyeminadultlayerwithweeks对糜蛋白酶活性数据进行统计分析获得糜蛋白酶活性与周龄关系回归方程:方程屮y为糜蛋白酶活性，x为周龄数，糜蛋白酶活性与tl龄关系冋归方程：y=-0.0056x2+0.2011X+13.474,R2=0.9584o2.3成年蛋鸡空肠食糜屮胆汁酸含量随周龄的变化规律成年蛋鸡空肠食糜中胆汁酸含量随周龄的变化规律见图8。胰蛋白酶活性0500000100000015000002000000250000030000000102030405060周龄活(u/g)胰蛋白酶糜蛋白酶活性051015200102030405060周龄酶活(u/g)糜蛋白酶12试验研究结果表明：成年蛋鸡在24T4周龄间空肠食糜内胆汁酸含量随日龄的增加而升高,34 周龄时含量最高，而后降低，在44-54周龄时趋于稳定，但是降低后的含量比24周龄前的含量髙。图8蛋鸡消化道胆汁酸含量的变化规律Fig8Changesofbileacidcontentinchyeminadultlayerwithweeks对食糜中服汁酸含量数据胆汁酸含量数据进行统计分析获得服汁酸含量与周龄关系回归方程：方程屮y为胆汁酸含量，x为周龄数，胆汁酸含量与周龄关系冋归方程：y=0.0061x3-0.764X2+30.926X-175.32,R2=0.897503讨论3.1成年蛋鸡各段消化道内pH值、水分含量及小肠长度随周龄的变化规律消化道pH值是保证消化酶正常反应和消化道有益微生物繁殖的一个重要因素，对饲料养分消化利用具有关键作用。鸡嗦囊不分泌消化液，仅分泌粘液软化饲料，主要起贮存、湿润、浸泡和软化食物的作用，而有利于进食养分在胃及后段消化道内进一步消化。嗦囊弱酸性环境主要是通过嗦囊内微生物发酵产生的酸性物质和由胃内容物逆流入嗦囊的内容物来维持，比较容易受日粮组成的影响[48]o本试验结果表明，蛋鸡嗦囊食糜pH在4.16~5.2之间，呈弱酸性，随周龄的增加嗦囊食糜的pH值有增加的趋势。鸡的胃分为腺胃和肌胃，腺胃富有发达的腺体，可以分泌盐酸和粘蛋白、胃蛋白酶等。腺胃分泌的盐酸对饲料蛋白质的消化起着至关重要的作用。本试验结果表明：蛋鸡胃食糜的pH值在2.59-4.10之间，呈酸性，这与Gordon等[49],张铁鹰等测定的结果接近。本次试验屮24~34周龄蛋鸡胃食糜的pH值接近胃蛋白酶的最适pH值2.5-3[50],但是，34^54周龄蛋鸡胃食糜pH值却已超出胃蛋白酶pH值的最适范围，由此可见在蛋鸡产蛋高峰的后期胃食糜pH值的变化对饲料蛋白质的消化有影响。胃内酸性环境对一些矿物质元素的利用也产生影响，蛋鸡产蛋后期需要加大钙的补充量，而石粉或补钙饲料等碱性物质是影响胃内酸性环境的变化的原因胆汁酸含量190.00200.00210.00220.00230.00240.002425344454 周龄胆汁酸含量mmol/L()胆汁酸含量13小肠屮的十二指肠上有胰腺，胰腺分泌的胰液含有大量的碳酸氢钠。碳酸氢钠可以川和从胃中排空的食糜中的酸度。在整个实验过程中成年蛋鸡空肠食糜pH值在6.32-6.38之间呈中性，随周龄变化较小，基本保持在6.35左右。这说明肠液有很强的pH调节能力，能使肠道内pH值始终保持稳定平衡状态。水是一种溶剂，体内各种营养物质的吸收转运和代谢废物的排泄都必须溶于水后才能进行。水还是化学反应的介质。但是家禽胃的持水力有限。动物体内水的來源主要有三方面：饮水(75%)、饲料水(6%)和代谢水(19%),所以体内水份主要来自饮水。本试验中成年蛋鸡各消化器官食糜含水量相对稳定，表明成年蛋鸡通过饮水对体内水分的调解能力很强。小肠是营养物质消化吸收的主要场所，小肠的发育情况与营养物消化率的高低密切相关[51]9成年蛋鸡小肠反度随tl龄的增加儿乎不变，由此可见，24周龄时蛋鸡消化器官已发育完善，达到成熟标准，这一结果与安永义等[52]报道结果一致，即家禽消化器官在其生长过程屮优先发育，以便摄入和消化足够养分为后期机体生反创造条件。成年蛋鸡空肠最长，十二指肠最短，可见空肠是小肠消化吸收的主要部位。3.2成年蛋鸡空肠食糜消化酶活性随周龄的变化规律胃蛋白酶是由腺胃混合分泌细胞分泌[53]，是饲料蛋白质消化的关键酚[54]o饲料蛋白质在胃蛋白酶的作用下被水解成多肽[55],进而在小肠内进一步消化利用。因此，胃蛋白酚活水平的高低与饲料蛋白质消化利用率密切相关。Johnson等[56]研究表明：饲料中蛋白质只有经过胃蛋白酶初步水解后，在肠内才能被消化的更充分。本试验中成年蛋鸡胃蛋白酶活水平24~44周龄相对较高，44周龄后迅速降低，说明成年蛋鸡生长后期胃蛋白酶处于分泌不足状态，这对能是成年蛋鸡生长后期饲料蛋白质消化利用率降低的原因之一，此外，胃内pH值的上升是影响胃蛋白酶活性的又一因素。鸡胰管开口于十二指肠和空肠的交界处，部分胰腺分泌的消化液和消化酶进入十二指肠内， 一些则直接进入空肠。随着小肠有节律的收缩运动，进入十二指肠和空肠的消化酶随同食糜一起被逐渐转运至回肠。Krogdahl等[57]认为，胰腺合成的各种消化酶只有分泌到家禽消化道内，并以激活状态存在才对禽的养分消化具有实际意义。因此，以消化道内消化酶活水平为参比，才能够真正反应出成年蛋鸡消化道酶活随tl龄的变化规律。食糜在十二指肠内的停留吋间非常短[58]9些消化酶可能还处于未被激活的状态。另外进入十二指肠的消化酶只是胰腺分泌消化酶的一部分，不能够完全反映出肠道酶活水平。食糜在空肠内的停留时间远远大于十二指肠，胰腺分泌的消化酶可充分地被激活，空肠的长度最长，大部分饲料养分的消化和吸收也主要是在空肠内完成[59],所以以空肠内酶活水平来研究成年蛋鸡消化道酶活发育规律最为合理。在本实验中空场食糜内的各种消化酶在24-34周龄时酶活水平较高且相对稳定，说明成年蛋鸡在24-34周龄时空肠各种消化酶分泌充足，对常规日粮中营养物质的消化利用率高。饲料中脂肪利用率的高低除与脂肪组成有关外，家禽消化道内的脂肪酶水平，也直接对脂肪的消化率产生影响。消化道内脂肪酶的活性受口粮中脂肪含量的影响，饲喂畜禽高水平的脂肪日粮时脂肪酶的分泌量也相应增加。本试验屮脂肪酶活性变化范围不大。淀粉酶主要消化可溶性碳水化合物，本试验中淀粉酶活性变化范围较小。14胰蛋白輛在蛋白质的水解过程中起重要作用，饲料氨基酸消化主要収决于胰蛋白輛[60]。胰蛋白酶在pH为7~9时活性最高。本试验中胰蛋白酶较高。糜蛋白酶又叫a■胰凝乳蛋白酶,与胰蛋白酶一样也是在胰腺内形成，先形成胰凝乳蛋白酶原，既可以被胰蛋白輛自己又可以被胰蛋白酶和其它蛋白酶激活，只有进入肠道才具有活性并发挥作用，在pH为7~9时活性最髙[61]o本试验中糜蛋白酶活性比胰蛋白酶活性差异较大，测定方法不同可能是其差异较大的主要原因。3.3空肠食糜胆汁酸含量随周龄的变化规律胆汁酸是胆汁主要的有效成分，对脂肪的利用至关重要。胆汁酸能提高脂肪颗粒的比表面积,有利于脂肪颗粒与酶结合，而且胆汁酸具有特殊的生物活性，可以被肠上皮细胞识别，反馈性调节胆汁的分泌，并且能与脂肪酸形成脂肪酸-胆汁酸复合物，改变脂肪酶的性质，提高脂肪酶活性，成年蛋鸡食糜中胆汁酸具有乳化脂肪和促进脂肪吸收等多种功能[62]owalker[63]报道添加0.1%胆酸盐玉米中淀粉体外水解速度提高了30%。武中会等[64]报道添加胆汁酸复合乳化剂提高肉鸡肠道内消化酶活性。本试验中总胆汁酸含量变化范围较大，在34周龄时含量最高，在降低后 的44~54周龄趋于稳定的时候，含量比25周龄前的含量高，表明在成年蛋鸡生长后期胆汁酸对饲料中脂肪的利用具有一定作用。4结论4.1嗦囊、胃食糜pH值均随周龄增加而逐渐升高，空肠pH值相对稳定，介于6.32-6.38之间。建立食糜pH值与周龄关系的冋归方程：嗦囊：y=2E-05x3-0.0022X2+0.0819X+5.388,R2=0.7982；胃：y=0.0002x3-0.0208X2+0.8922x-7.3816zR2=0.9826；空肠：y=lE-04X3-0.0131X2+0.5891X-5.1842,R2=0.9248o4.2嗦囊、胃和空肠食糜的水分含量随周龄增加无明显变化，但空肠食糜含水量明显高于嗦囊和胃内食糜。建立食糜水分含量与周龄关系的回归方程：嗦囊：y=-0.0009x3+0.1229X2-5.3341X+130.42,R2=0.9545,胃：y=-0.0002x3+0.0296X2-1.4298X+80.753,R2 =0.9503；空肠：y=-0.0013x3+0.1664X2-6.8446X+170.14,R2=0.9908o4.3胃蛋白酶随周龄增加而降低，在24-34周龄时相对稳定，酶活水平较高，44周龄后酶活明显降低。建立胃蛋白酶活性水平与周龄关系的回归方程:y=-0.1564x2+7.011X+185.343,R2=0.9679o4.4空肠内淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性及胆汁酸含量随周龄的增加而逐渐降低，44周龄后下降较快。建立空肠食糜消化酶活性水平与周龄关系的冋归方程：脂肪酶活性与周龄关系：y=-0.2567x2+13.679X+224.3,R2=0.9291；淀粉酶活性与周龄关系：y=-0.0011x2-4.0912X+497.03,R2=0.9326；15胰蛋白酶活性与日龄关系回归方程：y=27.956x2-31641X+3E+06,R2=0.942；糜蛋白酶活性与tl龄关系回归方程：y=-0.0056x2+0.2011X+13.474,R2=0.9584。4.5空肠食糜总胆汁酸含量随周龄增加先高后低，在34周龄吋含量最高，34周龄后含量将底,在44~54周龄时含量趋于稳定。建立空肠食糜总胆汁酸含量与周龄关系的回归方程： y=0.0061x3-0.764X2+30.926X-175.32,R2=0.8975016第二章成年蛋鸡消化代谢试验消化代谢试验在动物正常生理状态和肠上皮细胞的代谢活动及功能正常的水平下，研究营养物质的吸收变化，能够比较准确地对饲料营养价值进行评定。而体外消化模拟技术是处于非正常生理状态下的，其结果能否用于说明体内情况，需要经过消化代谢试验所测定的动物常规日粮营养物质的消化利用率来衡量，同时为消化代谢试验为体外消化方法进行优化提供依据，运用此方法测得的结果与体外消化方法测定的结果进行统计分析，建立饲料营养物质体内消化率的估计方程。1试验材料与方法1.1试验设计本试验选取31周龄健康海蓝褐蛋鸡240只，随机分为4组，每组2个重复，每个重复30只鸡。日粮为玉米■豆粕常规日粮，日粮中添加0.2%外源指示剂三氧化二珞，预试期为1周，试验期为3周。免疫程序按常规进行。1.2试验日粮口粮组成见表2表2日粮组成和营养水平Table2Compositionandnutrientlevelofexperimentaldiet饲粮成分(%)Composition(%)营养水平NutrientLevels玉米Corn58.70代谢能ME(MJ/Kg)10.82豆粕Soybeanmeal16.50粗蛋白CP(%)17.05棉粕Cottonseedmeal9.00钙Ca(%)3.41鉄皮Bran5.00有效磷AP(%)0.35磷酸氢钙Dicalciumphosphate1.33赖氨酸Lys(%)0.72石粉Limestone8.40蛋氨酸Met(%)0.35食盐Salt0.20色氨酸TryO.18氯化胆碱Cholinechloride0.10苏氨酸ThrO.61 微量元素Traceelements0.30维生素Vitamins0.04蛋氨酸Met0.13赖氨酸LysO.lO三氧化二辂Cr2O30.2总计Total100171.3试验样品的采集及预处理试验结束时连续收集3天粪样，然后将收集的所有粪样混匀，放入65°C烘箱屮烘干，回潮24h后称重粉碎，存于・20°C冰柜中贮存备用。同时釆取日粮样品备用。1.4检测指标与测定方法1.4.1检测指标Fl粮成分：粗蛋白质、能量和氨基酸；粪便成分：粗蛋白质、能量、氨基酸和Cr2O3浓度。1.4.2检测方法1.4.2.1粗蛋白质测定样品粗蛋白质采用国标法(GB/T6432-1994)进行测定；1.4.2.2能量测定样品能值采用氧氮式能量侧热仪测定；1.4.2.3氨基酸测定样品氨基酸系经6NHCI(含1%苯酚)于110°C水解24h,后用PITC衍生，用高效液相色谱仪进行氨基酸测定；1.4.2.4Cr2O3测定标准曲线的绘制：称取标准Cr2O3样品，加入氧化剂后在电炉上消化至溶液呈橙黄色，将此溶液用蒸馄水按一定比利稀释后，测定其吸光度，以Cr2O3浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线；Cr2O3浓度测定：样品用上述方法进行消化后定溶至100ml容量瓶屮，侧其吸光度，查标准曲线得到其Cr2O3浓度。1.5营养物质表观消化率表观消化率测定采用外源指示剂法。计算公式：某养分表观消化率(%)=100-(a4-b)X(c4-d)X100其屮：a—饲料屮三氧化二侪；b—粪样中三氧化二钻；c—粪样中某养分含量；d—饲料中某养分含量。182结果及分析35周龄成年蛋鸡常规饲料营养物质体内消化利用率。各营养物质体内消化率见表3、4o营养物质体内表观消化利用率高，且相对稳定。成年蛋鸡消化系统已发育成熟个体Z间对营养物质的表观消化利用率差异不大，35周龄吋消化道内各种消化酶活性相对较高，对饲料营养物质的消化利用能力较高。表3粗蛋白质和代谢能的消化率Table3Crudeproteinandmetabolismofdigestiverate指标粗蛋白质代谢能表观消化率(%)57.55±1.4070674.3085±0.89299 表4氨基酸的消化率Table4Aminoaciddigestibility名称表观消化率(％)天门冬氨酸86.64067±1.361088谷氨酸90.00950±1.077772丝氨酸85.22600±1.263114精氨酸93.50600±0.761347tt氨酸38.63400±5.856733苏氨酸81.52750±1.701369脯氨酸86.87450±1.215795丙氨酸82.03083±1.652434缠氨酸78.59467±2.006624蛋氨酸79.49017±2.846491胱氨酸88.13817±3.228199异亮氨酸84.45300±1.988786亮氨酸87.29417±1.311986苯丙氨酸89.08550±1.381778组氨酸82.62983±3.094664赖氨酸86.53483±1.084810酪氨酸86.91300±1.613558总计84.50080±1.31540019第三章体外消化模拟方法装置的研究及条件的确立家禽体外消化的研允虽然己达到应用家禽肠液评定饲料营养物质消化利用率的的阶段，但是实际生产屮多是应用多酶法，多酶连续透析法是目前应用最广泛的。体外酶解法既在模拟体内条件下把待测样用各种消化輛溶解水解，然后测定过滤后的滤渣或滤液中营养物质的含量，最后根据待测营养物质的消失率和体内实测消失率Z间的相关性，建立饲料营养物质体内消化率估计方程，用方程估计其体内消化率。人工配置的消化液与家禽消化液相比具有稳定性高、制取简便、 耐储存等优点。连续透析与沉淀、离心和过滤等分离己消化养分的方法相比，它能够消除消化产物对酶促反应的抑制作用，提高体外营养物质消化率。目前应用体外酶解法评定单胃动物饲料的营养物质消化率已被广泛接受。连续透析法的工作原理是利用透析袋内外己消化养分浓度差，使己消化养分从透析袋内不断扩散到透析袋外侧的透析液屮，并随透析液的流动不断被带走，模拟小肠对己消化养分的吸收过程。体外营养物质消化利用率的高低与透析袋内外已消化养分浓度差大小成反比。透析袋内外已消化养分浓度差一方面取决于酶促反应的反应速度，另一方面测取决于透析液流速的大小。在酶促反应速度一定的情况下，增加透析液流速，体外营养物质消化利用率也随之增加，所以在连续透析法中透析液流速对体外营养物质消化利用率起着至关重要的作用。透析液流速必须能够始终维持透析袋内外已消化养分存在一定的浓度差，及时将己消化养分转移走，消除其对酶促反应的抑制作用。根据成年蛋鸡体外消化参数及体外消化操作程序进行体外消化试验対饲料粒度和透析液流速进行选择。1体外消化模拟方法确立1.135周龄成年蛋鸡体外消化环境参数的确定1.1.1体外消化环境参数确定的依据根据本实验第一章（2）中获得的成年蛋鸡消化道消化环境参数随周龄变化的回归方程，计算出所需成年蛋鸡体外消化环境的消化参数。1.1.235周龄成年蛋鸡体外消化环境参数的确定家禽消化道中的消化酶是一个复杂的多酶系统，消化酶的活力受各种因素的影响较大，在体外酶解法屮彫响消化酶活力的因素应尽量考虑全面，减小误差。体外消化参数主要有：食糜PH值、水分含量、消化酶活水平及总胆汁酸含量。1.1.2.135周龄成年蛋鸡体外消化食糜中pH值、水分和胆汁酸含量的确定35周龄成年蛋鸡体外消化嗦囊、胃和空肠食糜中pH值、水分和胆汁酸含量的确定（表5）。20表5食糜中ph值、含水量及胆汁酸含量Table5phvalue,inwaterandbileacidcontentofchyme指标嗦囊胃空肠pH5.123.676.42水份含量（％）55.6958.4078.68胆汁酸含量（mmol/L）-232.731.1.2.235周龄成年蛋鸡体外消化食糜屮儿种消化酶的水平由于饲料种类较多，很难找到一种蛋白酶便能反映出其蛋白质简介特色证的处理方法，因此在体外消化中多用复酶。鸡消化道中的消化酶主要有以下几种：胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶。依据各消化酶的活力水平的确定（表6）。表6食糜屮消化酶活性水平Table6Digestiveenzymesactivitylevelofchyme消化酶种类i蛋白酶胰蛋白酶糜蛋白酶淀粉酶脂肪酶酶活（u/g食糜鲜重）249.14192681113.62337.19388.611.1.23体外消化模拟时间的确定根据营养物质在鸡体内消化时间为依据确定食糜在各消化道内的停留时间。营养物质在家禽体内的主要的消化吸收时间为4-5h；根据Shires等（198刀确立的食糜在鸡各段消化道内停留吋间为依据，确定体外消化模拟时间（表7）。 表7食糜在嗦囊、胃和小肠内道的停留时间Table7Retentiontimeofchymeincrop,proventriculusandgizzardandsmallintestine消化道嗦囊腺胃和肌胃空肠食糜停留时间消化时间(min)10601201.2生物反应器的设计与消化液的配制1.2.1生物反应器设计鸡体外消化主要是対饲料在嗦囊、胃和小肠三部分进行模拟。生物反应器即体外消化体外消化模拟过程中的模拟装置。其组成部分主要有消化装置、恒温混合装置、透析液流速控制装置和已消化养分接收装置四部分组成。消化装置:嗦囊及胃消化器、小肠消化装置及透析袋(截留分子量12000Da,直径2cm)；恒温混合装置：带摇床的恒温水浴锅；透析液流速控制装置：蠕动泵(BT00-60OM,保定兰格公司)；已消化养分接受装置：容量瓶(250ml)o1.2.2所需溶液及其配制1.2.2.1消化酶溶液及胆汁酸溶液的配制首先对各种商品消化酶的活力及胆汁酸含量进行测定，簡品消化酶的活力及胆汁酸含量测定结果(表8)。21表8各商品消化酶的活性及胆汁酸含量Table8Digestiveenzymesactivitiesinseveraldigestiveenzymeproductsandbileacidcontentinbileacidextract商品消化輛名称胃蛋白酚(p-7000sigama)胰蛋白酶(T-7409sigama)糜蛋白酶(0164Amresco)淀粉酶(A-3176sigama)脂肪酶(L-3126sigama)胆汁酸提取物(B-8631sigama)酶活(u/mg、 mmol/mg干物质中)201.341722424.0130120279.05143根究所测消化酶的活性配制35周龄成年蛋鸡体外消化所需消化酶溶液：胃蛋白酶：0.2905g胃蛋白酶溶于50mlpH值3.67的盐酸溶液中；胰蛋白酚：0.3425g胰蛋白酶溶于50ml磷酸盐缓冲溶液中；糜蛋白酶：0.0139g糜蛋白酶溶丁50ml磷酸盐缓冲溶液中；淀粉酶：0.8605g淀粉酶溶于50ml磷酸盐缓冲溶液中；脂肪酶：0.4265g脂肪酶溶于50ml磷酸盐缓冲液屮；胆汁酸：0.4984g胆汁酸提取物溶于50ml磷酸盐缓冲液中。1.2.2.2酸盐溶液及缓冲液的配制（1）lmol/L盐酸溶液，取8.3ml盐酸定容至100ml；（2）0.2mol/L盐酸：取20mllmol/L盐酸用去离子水定溶至100ml；（3）0.05mol/L盐酸:取5ml以上A溶液用去离子水定溶至100ml；（4）lmol/L碳酸氢钠溶液取8.4g碳酸氢钠溶于100ml去离子水中；（5）0.2mol/L碳酸氢钠溶液：取20mllmol/L的碳酸氢钠溶液，用去离子水定溶至100ml；1.3体外消化方法操作程序的确立体外消化操作步骤分为嗦囊消化期、胃消化期和小肠消化期。嗦囊消化期：准确称取1.0000g饲料样品，放入嗦囊消化室内。加入适量盐酸溶液，使体外消化食糜pH值和水分含量与成年蛋鸡体内食糜的相符。将食糜混合均匀后，放入40°C的恒温水浴锅内。预热5min后振荡（120次/min）开始计时，继续消化10mino胃消化期：取出嗦囊消化器，小心取下橡胶塞，向消化室器内加入一定浓度体积（0.5ml0.9mol・LJ）的胃蛋白酶盐酸溶液，使体外消化食糜的消化参数与成年蛋鸡体内的参数保持一致。（将食糜pH调至3.56,封口）食糜混合均匀后放入41°C的恒温水浴锅内继续消化，不断振荡（120次/min）。预热5min后开始计时，继续消化60min。小肠消化期：取出胃消化室，将食糜转入透析袋中，并用一定量的碳酸氢钠溶液调整食糜PH值是其与体内相符，混合均匀后想透析袋中加入小肠消化酶磷酸盐缓冲液和胆汁溶液，排出透析袋内的残余气体，扎紧透析袋，混合均匀后将装有食糜的透析袋放入小肠消化器。将小肠消化室放入41°C的恒温水浴锅内，不断振荡（120次/min）,预热15min后开始讣时，继续消化至食糜在小肠中的消化时间。（120mino）同时，打开蠕动泵透析袋外侧不断流动pH为6.0的磷酸盐缓冲液，将已消化养分带走，收集流出的透析液。小肠消化期结束后，关闭蠕动泵。221.4体外消化模拟试验条件的优化饲料样品粒度大小和透析液流速是影响体外消化模拟技术消化率与体内消化率相关性的重要因素。试验采用双因素3水平试验设计，分别研究当饲料样品粒度为40目、60目和80目，流速分别为1.5.2.0、2.5ml/min时对成年蛋鸡玉米•豆粕日粮粗蛋白质和代谢能体外消化率的影响。1.4.1试验操作步骤嗦囊消化期:分别准确称取l.OOOOg过40、60、80目的饲料样品，放入嗦囊消化室内。加入(1.3ml0.12mol・LJ)盐酸溶液，将食糜pH调至5.12,用橡胶塞封口。将食糜混合均匀后，放入41°C的恒温水浴锅内，开启水浴锅振荡器，振荡频率为120次/min。放入5min后开始计时，继续消化lOmino胃消化期:取出嗦囊消化室，小心取下橡胶塞。向消化室内加入(0.5ml0.9mol・L・l)的胃蛋白酶盐酸溶液，将食糜pH调至3.56,封口。将食糜混合均匀后放入41°C的恒温水浴锅内消化， 开启水浴锅振荡器，振荡频率120次/min。放入5min后开始计时，继续消化60mino小肠消化期:取出胃消化室，向胃消化室内加入0.8ml0.54mol・LJ碳酸氢钠溶液(并冲洗橡胶塞上的食糜)，使食糜pH调至6.33。然后将食糜转入透析袋小，加入pH为6.3的小肠消化酶磷酸盐缓冲液0.5ml,混合均匀后再加入0.5ml胆汁酸溶液，排出透析袋内的残余气体，扎紧透析袋。混合均匀后将装有食糜的透析袋放入小肠消化室。将小肠消化室放入41°C的恒温水浴锅内，开启水浴锅振荡器,振荡频率为120次/min。放入15min后，开始计时，继续消化150mino同时，打开蠕动泵，调整透析液流速分别为1.5.2.0、2.5ml/min,透析袋外侧不断流动pH为6.3的磷酸盐缓冲液，收集流出的透析液。小肠消化结束后，关闭蠕动泵。测定透析液中粗蛋白质量和能量。计算不同样品粒度和不同流速时玉米■豆粕饲料营养物质的体外消化率。1.4.2测定指标与方法测定指标：分别测定不同流速、不同样品粒度时，透析液屮粗蛋白质和能量的含量。测定方法：粗蛋白质和能量测定方法同第二章(142)。1.4.3体外消化率的计算体外消化率根据式差法计算。计算公式：某养分消化率二(a-b)/c其屮：a—透析液中某养分的量；b—空白透析液屮某养分的量；c—饲料样品屮某养分的量。1.4.4结杲采用不同样品粒度和不同流速吋蛋鸡玉米■豆粕日粮粗蛋白质和代谢能体外消化率见表9。由表9可见随着样品粒度的变小，相同流速时营养物质消化率增加；当样品粒度相同时，营养物质消化率随透析液流速的增大而增加，即样品粒度越小、透析液流速越大营养物质消化率越高。与体内实测营养物质消化率相比较，样品粒度为40目、当透析液流速为2.5ml/min吋，饲料23体外消化率与体内消化率相近；样品粒度为60目、透析液流速为1.5ml/min时，饲料样品体外消化率与体内消化率相近；样品粒度为80目、透析液流速为1.5ml/min时，体外消化率与体内消化率相近。对所得数据进行统计分析，当饲料样品粒度为60目，透析液流速为1.5ml/min时，蛋白质与代谢能体外消化率与体内消化率差异不显著；对此组数据进行相关性分析，体内外消化率的相关性：粗蛋白质相关性：*0.839,代谢能相关性为：“0.857,相关性较高；建立冋归模型:粗蛋白质回归模型为y=1.613x-32.682,R2=0.704,经方差分析F=4.754,P=0.161,代谢能回归模型y=0.211x+58.655,,R2=0.875,经方差分析F=11.043,P=0.029o方程中y为体内消化率，x为体外消化率，表9体内外粗蛋白质和代谢能消化率Table9Crudeproteinandmetabolismdigestibilityoninvitrodigstionandbodydigstion体外消化因素消化率样品粒度（目）透析液流速（ml/min）粗蛋白质（％）代谢能（％）1.538.7767±0.37501b58.0325±1.42689b402.049.2067±0.26502b62.3025±1.05418b2.553.2867±0.74795b76.4775±.84972b1.555.1667±0.19502a73.5675±2.04552a602.067.8800±0.79196b77.9075±.78475b 2.573.4000±0.73000b86.0275±2.14058b1.557.6867±0.82501b75.1175±2.15852a802.061.5233±0.55591b84.4025±2.38313b2.576.0900±2.00940b86.7425±1.31756b体内55.5470±1.40706a74.3085±0.89299a注：同列肩标无相同小写字母者表示差异显著（PV0.05）。Inthesamecolumrevalueswithdifferentlettersuperscriptsmeansignificantdifference（P<0.05）.2讨论2.1透析液流速大小对体外营养物质消化率的影响饲料营养物质在家禽体内经过嗦囊和胃消化后，经胃肠运动准运至小肠，在小肠消化酶的作用下进一步分解为可吸收的小分子形式，同时，这些小分子的营养物质在小肠内经主动转运和被转运等方式被肠壁吸收，进入血液循坏。己消化养分的分离技术是模拟营养物质体内吸收的过程，连续透析法与过去使用的沉淀、过滤和离心等分离已消化营养物质的方法相比，解决了消化产物对酶促反应的抑制作用对消化率产生彫响这一问题。透析液屮已消化养分含量的高低与透析液流速大小直接相关，所以透析液流速大小与营养物质消化率相关，在本实验屮主要通过调节透析液流速的大小来调解消化产物对酶促反应的抑制作用，Cave等[65]利用半透膜分离已消化养分时也24发现，利用缓冲液间歇过滤时体外养分消化率低于连续过滤，但高于三氯乙酸沉淀法的体外消化率。本实验中，饲料营养物质体外消化率随透析液留的增大而增加，这与Savoie等[66]和张铁鹰的试验结果一致。本实验中当样品粒度为60目、透析液流速为1n时，饲料粗蛋白质和代谢能的消化率与体内消化率差异不显著，所以成年蛋鸡体外消化方法中透析液最适流速为1.5ml/min,Savoie等的体外消化最适透析液的流速值1.6ml/min接近；饲料样品粒度为60目，与张铁鹰等体外消化饲料样品粒度一致；与Drake[67]报道的1000ml的透析液体液相差较大。2.2样品粒度大小对体外营养物质消化率的影响禽类主要通过嗦囊内的砂砾和肌胃的收缩运动将饲料磨碎，来增加饲料表面积。进而使消化酶与饲料营养物质有效结合，提高其消化率。增加饲料粉碎粒度可提高饲料消化率，但在实际生产中并不是饲料粉碎越细越好，而是有一定的适宜范围。Nir等[67]研究表明，0-21日龄肉仔鸡采食中等粉碎粒度(0.97~1.27mm)谷物口粮时，生产性能最好，而粉碎粒度过大(2.01~2.10)或过小(0.57~0.67mm)生产性能均会降低。现在家禽的体外消化模拟中均未考虑砂砾和肌胃收缩对饲料的物理消化作用，大多釆用将饲料样品粉碎值一定力度的方法，但采用何种粒度最为合理并没有明确标准，不同的体外消化方法中采用不同的粉碎粒度。但体外消化过程中均未设计粉碎饲料的装置，因此在选择饲料样品粒度时，均认为应选择消化道内饲料粒度最小时的粉碎力度值为样品的粉碎粒度。家禽采食饲料后， 消化器官内的各种物理消化从未间断，但物理消化作用主要在嗦囊和胃内进行，当食糜到达小肠时，消化器官对饲料的物理消化作用也已基木完成，所以，家禽体外消化所采用的饲料粒度应与小肠内食糜粒度保持一致。张铁鹰报道肉仔鸡空肠内食糜粒度50%能通过60目筛子。因此本实验中应饲料样品力度定位40目、60目和80So饲料粉碎粒度对营养物质消化率的影响子在体外消化中也得到了证明。Drake等试验证明减小饲料粒度能够提高体外干物质和粗蛋白的消化率。本实验中饲料粉碎粒度由40目降到60目吋，在相同流速下，饲料粗蛋白质和代谢能消化率均显著提高。在单胃动物屮，鸡具有消化道短，排泄快缺点，因此食糜在消化道内的停留时间短，而体外消化的消化时间是根据饲料在动物体内的停留时间来决定的。因此在体外消化时，必须将饲料样品粉碎成较细的颗粒，才有助于饲料营养物质的消化。根据体内是侧消化率，当透析液流速为1.5ml/min时，样品粒度为60、80目时，代谢能的消化率与体内消化率差异均不显著，但是粗蛋白质只有在60目时差异不显著。因此在成年蛋鸡体外消化饲料样品粒度应为60目比较适宜。3结论3.1成年蛋鸡体外消化方法的优化条件，饲料粒度为60目，流速为1.5ml/mino3.2成年蛋鸡粗蛋白质和代谢能体内消化率估计模型的建立：粗蛋白质回归模型为:y=1.613x-32.682,R2=0.704；代谢能回归模型为：尸0.221X+58.655,,R2=0.875。25第四章体外消化方法的检验体外消化法的目的是通过对饲料的实验室检测来估计可利用营养物质的含量。估计率的高低在饲料生产中的意义重大，所以体外消化法稳定性的检验至关重要。饲料中蛋白质和淀粉等营养物质在家禽消化道内各种消化酶的催化作用下，逐渐被水解成可吸收的小分子物质，然后被肠壁吸收进入血液循环。蛋白质首先在盐酸和胃蛋白酶的作用下被分解成少量的氨基酸，大部分以较大的多肽形式进入后段消化道。在小肠中经胰腺分泌的多种蛋白质水解酶的作用下进一步被水解成氨基酸和小肽。氨基酸和小肽在空肠和回肠内不断被吸收。因此，本试验通过测定饲料氨基酸体内外消化率的相关性来检验成年蛋鸡体外消化方法的稳定性。1试验材料与方法1.135周龄成年蛋鸡体外消化环境参数的确定35周龄成年蛋鸡体外消化环境参数的确定见第三章l.lo1.2试验仪器及溶液配制试验材料及溶液配制见第三章1.1.1.3试验设计采用饲料样品粉碎粒度为60目，流速为1.5ml/min为体外消化的前提条件，通过测定饲料氨基酸体内外消化率的相关性对成年蛋鸡体外消化方法进行检验。1.4试验步骤嗦囊消化期:分别准确称取l.OOOOg60目筛子的饲料样品，放入嗦囊消化室内。加入(1.3ml0.12mol-L-l)盐酸溶液，将食糜pH调至5.12,用橡胶塞封口。将食糜混合均匀后，放入41°C的恒温水浴锅内，开启水浴锅振荡器，振荡频率为120次/min。放入5min后开始计时，继续消化6min。胃消化期:取出嗦囊消化室，小心取下橡胶塞。向消化室内加入(0.5ml0.9mol・L・l)的胃蛋 白酶盐酸溶液，将食糜pH调至3.56,封口。将食糜混合均匀后放入41°C的恒温水浴锅内消化，开启水浴锅振荡器，振荡频率120次/min。放入5min后开始计时，继续消化60mino小肠消化期:取出胃消化室，向胃消化室内加入0.8ml0.54mol・L