哺乳动物精子质量评定方法研究进展[1]

'四川动物2007年第26卷第1期SichuanJournalofZoologyVol126No112007哺乳动物精子质量评定方法研究进展1,231231张明,鲜红,朱庆,侯蓉,郑鸿培(11四川农业大学动物科技学院胚胎工程实验室,四川雅安625014;21成都大熊猫繁育基地,濒危野生动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室;31成都市妇产科医院生殖不孕研究所)　　摘要:哺乳动物精子质量的评估,对于人工授精技术和体外受精技术的应用具有重要意义。目前,可用于反映精子质量的指标和评估方法有:精子活力、精子活率、顶体膜完整性检测、顶体状态与获能的检测、精子线粒体活性、受精能力检测以及其他一些相关的精子质量检测方法。在生产上,进行多指标联合检测,是目前评定精子质量有效的方法。随着技术的进步,更加快速、准确、安全和高效的精子质量检测的新方法将被应用到人类生殖临床和畜牧生产中。关键词:精子质量;评定;哺乳动物;受精能力中图分类号:Q492文献标识码:A文章编号:1000-7083(200)01-0230-05ProgessesontheMethodsforAssessingMammalianSpermatozoaQuality1,231231ZHANGMing,XIANHong,ZHUQing,HOURong,ZHENGHong2pei(1.TheLaboratoryofReproductiveBiologyandTechnology,CollegeofAnimalScience&Technology,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan,SichuanProvince625014;2.TheKeyLaboratoryofReproductionandConservationGeneticofEndangeredWildlifeofSichuanProvince,ChengduResearchBaseofGiantPandaBreeding;3.TheDepartmentofHumanReproductionandSterility,MaternityHospitalinChengdu)Abstract:Itpsveryimportanttoassessmammalianspermqualityforartificialinseminationandinvitrofertilization.Atpresent,theitemsorparameterssuchasspermmotility,spermviability,acrosomalmembraneintegrity,acrosomalandcapacitationstate,mitochondrionactivity,fertilityandotherrelativetechniquesareusedforevaluatingspermquality.Inpractice,multi2parametersandmulti2methodsareusedforevaluatingspermqualitywhichisthemosteffectiveandexacttechnique.Thefster,theexacter,thesaferandthemoreeffectivemethodwillbedevelopedandappliedtohumanrepro2ductiveclinicandfarmingproductionwithtechniquedeveloping.Keywords:spermquality;assessment;mammalian;fertilizingcapacity　　哺乳动物精子质量直接关系到精子的受精能力与受胎1　精子运动能力率,如何评定精子质量一直是人们关心的问题。准确、客运动能力是保证了精子在受精过程中,与卵子相遇和观地评价精子的质量和受精能力是人工授精和体外受精技完成对卵膜的机械穿透作用,同时也是精子许多功能的一术成功的关键。精子的活率、运动性、精子形态、精子结种综合直观的表现。通常精子的运动能力用精子活力构的完整性以及精浆蛋白质情况等指标可以直接或间接反(spermmotility)来评价,它是直线运动精子数与精子总数[1]映精子的质量。随着精子检测技术的快速发展,精子质量的比例。有研究认为,活力的评定易受主观因素影响,因此活力对于精子潜在受精能力的评估并不是一个可靠的检测的内容已经从常规检查发展到精子生化、免疫等方面[2]指标。精子的运动能力虽然不能直接反映其受精能力,的检测,染色技术也从普通损伤性染色发展到活体染色,但精子的正常运动是生理状态下完成受精过程的基础。精从精子整体染色发展到顶体染色和DNA染色技术,从精子[3,4]子的运动性与受精水平存在相关,因此正确分析精子的超微结构的检测发展到功能的检测。本文对精子的运动能[5]运动能力仍具有重要的意义。力、活率、顶体膜完整性、顶体状态、获能检测、精子线[6]正常运动精子在普通光学显微镜下可直接观察记录。粒体活性、穿卵能力和其他与精子质量相关的指标的检测这种方法带有一定的人为误差,但操作简便快捷,不需要方法进展进行了总结,并对精子质量评估方法的要求和发昂贵仪器,特别适于临床和现场应用;光镜检测人的精子[7]展方向提出了新的见解。活力与穿卵实验结果的相关系数为0172,羊的精子活力收稿日期:2006-01-22基金项目:中国大熊猫繁育研究基金“提高大熊猫冷冻精子受精能力研究”项目资助,No12003010第一作者简介:张明(1975～),讲师,博士研究生,主要从事动物繁殖生物技术相关研究。　3通讯作者230 四川动物2007年第26卷第1期SichuanJournalofZoologyVol126No112007[8]与穿卵实验结果的相关系数为0176～0190。这表明光镜光染料对细胞的损害很小,因此用活体荧光染色得到的活直接观察测定精子的活力仍是一种简单有效的方法。率结果是比较准确的。但应用荧光染色技术需要配备荧光现在多运用计算机辅助精子分析仪(CASA)来分析精显微镜,仪器较为昂贵。子的密度、运动状态。这是在光学技术的基础上结合计算3　精子质膜完整性机图象识别、运动图象处理技术发展起来的精子运动能力冷冻过程容易造成精子质膜的损伤,在应用冷冻精液的综合分析方法。利用CASA分析精液的运动指标,不仅进行人工授精时,人们通常只检查精子的活力。但现代实提高了检查结果的客观性,而且提供了许多传统精液分析验证明,活力高不等于精子质膜未受到损伤,质膜受到损所不能提供的参数。准确的CASA分析结果,能反映精子伤的精子己丧失了受精能力。因此,精子质膜完整性是影[9]的受精能力和预测人工授精的受胎率。但CASA分析的响冷冻精液受胎率的一个重要因素。[10]准确性受诸多因素影响,如精子浓度、精液中细胞成分精子质膜完整性是其死活的一个间接指标,可利用死和非细胞颗粒值的干扰、测量中液体的流动。精子质量分活精子的辨别方法来间接辨别精子质膜的完整性。精子质析仪(spermqualityanalyser,SQA)是1991年发展起来的膜能够有选择地运输分子,当质膜完整的精子被放到低渗[11]一种高效、方便、全自动的精子质量评估系统,它通过溶液中时,水会进入精子内部并达到一种平衡,内流的水检测精子运动引起的精液光密度(OD)变化来,综合评价会使精子体积增大、顶体肿胀、尾部弯曲,尤其以尾部弯精子的运动状态。第一代SQA主要通过精子运动指数曲这一特征比较明显,因此可以用弯尾率作为评价精子质(spermmotilityindex)来评估精子质量,发展到现在,SQA膜完整性的标志[15]。可以检测精子运动指数(SMI)、总功能精子密度(Total1966年,Drevius和Eriksson就描述过哺乳动物精子的functionalspermconcentration,TFSC)、精子密度(sperm弯尾现象(tailcoiling)[16]。低渗肿胀实验(hypoosmotictotalconcentration,STC)、活动精子百分率(Spermmotilityswellingtest,HOST)可预测精子对卵子的受精能力:用狗percentage,SMP)和正常形态精子百分率(Spermnormal精子进行HOST,结果表明精子肿胀弯尾率与精子获能率、[12]morphologypercentage,SNMP)等指标。SQA的SMI与穿卵率和精子活力显著相关[17];对猪精进行HOST,并与CASA分析的前向运动精子密度(Concentrationofprogres2伊红、CDT荧光染色结果进行比较,证明HOST是一种敏[11]sivelymotilesperm,CPMS)之间相关系数达0187,证明感的、可重复检测精子膜功能完整性的方法[18]。在研究降SQA分析精子的综合运动能力具有一定的可靠性,但同一温、冷冻、解冻过程对羊精子的影响[19];和检验不同稀释样品SMI的变异程度较大,而且SQA不适合SNMP指标液对猪精液冷冻效果时[20],以HOST作为检测标准,均获的检测。自动、快速分析精子质量是今后精子质量检测的得较好的预测。对狐精子进行了HOST试验,发现狐精子发展方向,但建立一种标准条件下的CASA分析方法和进的HOST与常规精液品质检查中的活力测定相关关系显一步研究精子活力、活率、穿卵能力等指标与SQA分析指著[21]。此外,HOST还在人精子功能检测中应用得很有效,标(SMI、TFSC、STC和SMP等)之间更精确的多参数数可育组精子肿胀弯尾率显著高于不育组[22],并且受胎率与学模型非常必要。精子活力、精子活率及正常形态精子百分率呈明显正相关。2　精子活率HOST因为具有简便、快速和廉价的优点,目前已经用于精子活率(spermviability)是指活精子数与总精子数牛、猪、羊、狗、小鼠等动物和人精子的质膜功能完整性[23]的比率。在应用中常常把普通光镜下观察到的运动的精子的检测。HOST是一种简便、高效、准确衡量精子质膜当作活精子。在离体条件下,精子运动表现要受到温度、完整性的方法。液体粘稠度和稀释液的影响,所以精子活率受多种因素影4　精子顶体状态响。常规染色方法如伊红染色、伊红2苯胺黑、姬姆萨染色顶体为精子头部帽状结构,内含与穿卵有关的水解酶[13]等是常用的活体染色技术,已广泛应用于人、猪、牛和类。在受精之前,具有完整顶体的精子是受精成功的关键,兔等动物精子活率的检测中。姬姆萨染色等可以着色死精也是精子能够发生顶体反应(acrosomereaction,AR),穿子,并以此来计算精子活率。但是在常规染色过程中,精[24]过透明带使精子质膜和卵质膜融合的必要前提。顶体反子容易受到损伤而死亡,使活率低于实际情况。应是受精过程中精子顶体的胞吐现象。发生在活精子中的随着染色技术地发展,活体荧光染色技术弥补了这一顶体反应称为真顶体反应(TAR),这种精子可以获得穿透缺陷。死精子特异性荧光探针有碘化丙锭(PI)、溴化乙锭卵子透明带并与卵质膜融合的能力。而当精子死亡时失去(EB)、溴乙啶二聚体(EH)和Hoechst33258等,活精子顶体或顶体破损,称为假顶体反应(FAR)。只有顶体完整特异性荧光探针有羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)、羧基二或顶体反应适时发生的精子才能受精。如果精子的顶体脱甲基荧光素双醋酸盐(CDMFDA)、钙黄绿素乙酰基甲基酯落、破损,顶体中的酶类丢失,受精过程就不能进行。因[14](CAM)、Hoechst33342等。死活精子荧光探针一般结合此,对顶体完整性的检测是评价精液冷冻、解冻效果的一使用,从而使死精子和活精子能够同时得到鉴定。活体荧项重要指标。精子顶体状态的评价方法包括电镜观察和顶231 四川动物2007年第26卷第1期SichuanJournalofZoologyVol126No112007[27]体染色法。有应用前景的功能性方法。但对于大多数哺乳动物而透射电镜是常用的检测精子顶体状态(包括顶体反应)言,要获取大量新鲜卵母细胞用于精子功能的评价是比较的方法之一:如果顶体外膜完整,顶体内膜与质膜连续,困难的。人们将卵母细胞长期保存在一定浓度盐溶液[28]则所观察到的顶体正常;如果顶体外膜出现规则性断裂,中。在金黄地鼠和人类,精子能够穿入盐溶液保存的同顶体内膜与质膜融合,则所观察到的精子顶体已发生真顶种卵母细胞透明带内,与新鲜卵母细胞透明带穿透试验结[29,30]体反应;如果顶体外膜出现不规则性断裂,尽管顶体内容果一致。此后,盐溶液保存卵母细胞透明带穿透试验[31～36]物仍然存在,所观察到的顶体变化是假顶体反应。尽管电也在一些动物中得到广泛应用。但对野生动物而言,镜方法所获得的精子顶体状态的结果真实可靠,但该方法由于其同种卵子难以获得,因此同种透明带穿透试验一般的样品制备过程复杂,电镜仪器设备昂贵,不适于一般实不易进行,此时常采用异种透明带穿透来检测这些野生动验室的常规检测。[37][38][39]物精子的受精能力。在猫科动物、灵长类以及牛精子顶体的存在与否还通过染色来判断。顶体染色通的异种透明带穿透试验中,该方法被证实对精子功能的检常用异硫氰荧光标记的外源性植物凝集素(FITC2PHA:测是有效的。FITC2PNA、FITC2PCA2Ⅱ、FITC2ConA、FITC2PSA)染色此外,体外精子穿入去透明带卵子的能力也常用于检法、CTC法、考马斯亮蓝染色法和Hoechst33258结合的植测精子的受精能力,该方法在同源卵子较难获得的情况下物凝集素(PHA)标记法等。精子的荧光染色技术是近年多采用去透明带异种卵子进行分析。Yanagimachi最早报道来兴起的染色,用这种技术来检测精子的活率和顶体状态了精子穿卵试验(spermpenetrationofzona2freehamsteregg十分准确。FITC2PHA已经用于人、牛和马等精子的顶体assay)[40],后经改良和标准化使之在精子受精能力检测的检测。用荧光检测需使用荧光显微镜,而且荧染标本难于临床应用中得到了广泛的认同。该法不仅可用于精子获能、长期保存。考马斯亮蓝染色法是评价精子顶体完整性的一顶体反应、精卵融合能力的检测,还可检验精核解聚能力,种简便染色方法,目前已用于评价小鼠、仓鼠、兔、牛以目前已经用于检测大多数哺乳动物和人精子的受精能力,及人精子的顶体状态。荧光染色和考马斯亮蓝染色方法在精子穿卵率表现出与受精能力显著相关。当精子穿卵试验辨别真顶体反应和假顶体反应上存在局限性。但牛和猪精与精子顶体反应测定相结合时,可作为评价精子受精能力子顶体染色检测的结果与直线运动精子数、HOST等方法的依据[41]。精子穿卵实验检测精子受精能力科学、准确、的结果呈高度相关,而且用电镜技术也证实了染色检测的可靠,但检测过程复杂,难以快速完成。[14]可靠性。在对检测结果精度要求不高的情况下,染色检7　其他与精液品质相关物质的检测测顶体状态是一种有效的方法。711　精浆蛋白电泳谱带分析5　线粒体活性精液由精子和精浆组成,精浆由睾丸液、附睾液和几线粒体能够不断产生精子运动所需要的ATP来提供能种副性腺分泌物混合而成。精浆内含有蛋白质、脂类、碳量,因此精子的运动能力与线粒体活性密切相关。在精子水化合物、维生素、激素及微量元素等物质,是射精后精穿过子宫颈时,线粒体的呼吸起重要作用,在冷冻过程中子生存的环境,对调节精子的成熟以及为精子提供能量和线粒体受到伤害,对于阴道底部输精的动物来说,精子的营养物质具有重要作用。精浆中的蛋白成分主要来自前列[25]受精能力将受到显著影响。因此线粒体的功能状态也是腺、附睾、精囊腺等性腺。蛋白质中的获能因子能够影响精子质量的关键指标之一。检测线粒体活性最常用的方法精子的成熟和生存,因此精浆蛋白对生殖功能有重要影响。是使用特异性的荧光探针如若丹明(Rh123)、MITO和JC2测定某些精浆蛋白含量的高或低,反映出精子的成熟度、[26]1等。精子的获能、顶体状态。如精浆中的转铁蛋白、精子运动[42]6　穿卵能力检测相关蛋白,能影响精子的数量和质量。精子的活力、质膜完整的重要性也反映在与受精能力张杰等采用不连续SDS2PAGE分析精浆蛋白带谱变化,[43]相关的体外功能检测中,如与卵子结合并穿入同种透明带用以判断人梗阻性无精子症。对啮齿类动物、猪、马和的能力,即精子的穿卵能力。这种检测能更准确地评价精牛的精浆蛋白多态性曾作过广泛研究,但没有探讨与精子子的受精能力。质量的相关性。主要由于普通电泳技术的分辨率不高。新透明带是体内受精的第一道屏障,在精子与卵子质膜的SDS2PAGE平板电泳可以在同一张凝胶上直接比较分析融合并进入卵细胞前,精子必须粘附、结合并穿入透明带精浆蛋白组分的改变,而且具有分辨率高,带谱丰富和结[44]内,这种结合是由透明带和精子上的亲和素2受体介导的,果准确可靠等优点。高效毛细管电泳技术、双向蛋白电是透明带结合分析精子受精能力的理论基础。大多数能够泳技术是近年发展起来的一种新型分离技术,尤其对蛋白与透明带结合的精子形态正常,因此,精子与透明带的结质和核酸的分析技术日趋成熟,将其用于精浆蛋白成分的合分析能够准确评价精子的受精能力。只要我们能获得足分析也更加有效。够的卵子,透明带结合分析是一种检测精子受精能力非常712　精液中酶类的检测232 四川动物2007年第26卷第1期SichuanJournalofZoologyVol126No112007精子含有一个与受精密切相关的酶系,当精子受到损[8]SuttiyotinCJ,ThwatiesLG,anchez2Pantida,etal.Evaluationofa伤时,膜的渗透性增加,使酶得以穿过细胞膜而进入精浆。modifiedspermpenetrationtestinramsemen[J].Theriogenology,在精液冷冻、解冻过程中,精子超微结构的破坏必然伴随1995,44(1):29～40.[9]ClareH,WilliamH,HarryDM,etal.Objectivelymeasuredboar着精子生物化学物质的变化和细胞内容物的丢失,其中包spermmotilityparameterscorrelatewiththeoutcomesofon2farmin2括酶的渗漏。哺乳动物精子酶学在冷冻精液的品质评定及semination:resultsoftwofertilitytrials[J].JAndro,1997,18受精过程中的调控作用早在20世纪70年代就引起有关学(3):312～313.者的极大关注。精子酶学理论的研究对控制受精过程、检[10]HoltC,HoltWV,MooreHDM.Choiceofoperatingconditionsto测冷冻精液品质、预测受胎率具有一定意义。现在,对于minimizespermsubpopulationsamplingbiasintheassessmentof[45]精液中酶的研究主要包括透明质酸酶、酸性磷酸酶、唾boarsemenbycomputer2assistedsemenanalysis[J].JAndro,液酸苷酶、β2N2乙酰氨基葡萄糖苷酶等顶体酶类和乳酸脱1996,17(5):587～595.氢酶(LDH)、甘油醛一磷酸脱氢酶(GPD)、谷丙转氨酶[11]BartoovB,Ben2BarakJ,MayevskyA,etal.Spermmotilityin2(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶des:anewparameterforhumanspermevaluation[J].FertilSteril,[46]1991,56:108～112.等,以及最近研究者们关注较多的血小板激活因子乙酰水解酶(platelet2activatingfactoracetylhydrolase,PAF2[12]易蜀蓉,孟珊珊,张敬建.精子质量分析仪Ⅱ型的临床应用研AH)[47～50]等,这些酶在精子发生和受精过程中都起着重要究[J].中国男科学杂志,2002,16(1):50～51.[13]PintadoB,delaFuenteJ,RoldanER.Permeabilityofboarand的作用,并被研究者们用于评定精液品质的优劣和预测受bullspermatozoatothenucleicacidstainspropidiumiodideor精能力或受胎率,取得了一定的效果。在精液中寻找一种Hoechst33258,ortoeosin:accuracyintheassessmentofcellvia2或几种与精子质量高度相关的酶类还需要进一步研究。bility[J].JReproductionandFertility,2000,118(1):145～8　结束语152.精子受精能力评估的方法很多。比较科学准确的评定[14]GarnerDL,ThomasCA,JoergHW,etal.Fluorometricassess2方法是穿卵率测试;简便适用的是活力、活率、常规染色mentsofacrosomalintegrityandviabilityincryopreservedbovine和HOST检测;能够实现快速自动检测的方法是CASA和spermatozoa[J].BiologyofReproduction,1997,56(4):1401～SQA检测。要实现精子质量和受精能力的准确、科学、方1407.便、快速的检测,目前还比较困难。进一步优化或标准化[15]MalmgrenL.Assessingthequalityoframsemen[J].Theri2ogenology,1997,48(4):523～530.各种精子质量检测的条件,增加其可靠性和重复性;同时[16]CorreaJR,ZavosPM.Thehypoosmoticswellingtest:itsemploy2开发新的复合检测技术,才能满足精子质量和受精能力的mentasanassaytoevaluatethefunctionalintegrityofthefrozen2检测。利用精子穿卵实验的原理,利用免疫技术开发卵子thawedbovinespermmembrane[J].Theriogenology,1994,42:透明带亲合素染色试剂盒,采用快速染色与HOST结合,351～360.并通过SQA分析精子运动能力和形态的动态变化,来进行[17]Kumi2DiakaJ.Subjectingcaninesementothehypo2osmotictest精子质量和受精能力的检测,可望发展成为一种准确、科[J].Theriogenology,1993,32:1279～1289.学、方便、快速的复合检测技术。[18]VazquezJM,MartinezEA,MartinezP,etal.Hypoosmoticswellingofboarspermatozoacomparedtoothermethodsforanalyz29　参考文献ingthespermmembrane[J].Theriogenology,1997,47:913～[1]PayneSR,OliverJE,UpretiGC.Effectofantifreezeproteinson922.themotilityoframspermatozoa[J].Cryobiology,1994,31(2):[19]OlleroM,Perez2peR,Munino2BlancoT,etal.Improvementof180～184.ramspermcryopreservationprotocolsassessedbyspermqualitypa2[2]SmithJF,AsherGW,BriggsRM,etal.Effectofdiluentandstor2rametersandheterogeneityanalysis[J].Cryobiology,1998,37agetimeonpregnancyrateinewesafterintra2uterineinsemination(1):1～12.[J].AnimalReproduction,1993,53:295～298.[20]周佳勃.猪精液冷冻及室温保存技术研究[D].山东农业大学[3]JaskoDJ,LeinDH,FooteRH.Determinationbetweenspermmor2硕士学位论文,2000.phologicalclassificationsandfertilityinstauions:166cases(19872[21]刘国世.狐精子生物学研究[D].东北林业大学博士论文,1988)[J].JAmVetMedAssoc,1990,197(3):389～394.1999.[4]MalmgrenL,Spermmorphologyinstallioninrelationtofertility[22]DeCastroM,JeyendranRS,ZaneveidLJ.Hypo2osmoticswelling[J].ActaVetScandSuppl,1992,88:39～47.test:analysisofprevasectomyejaculates[J].ArchAndrol,1992,[5]岳焕勋.精子运动[J].男性学杂志,1993,7(1):54～57.24(1):11～17.[6]张秀成.精子检测与分离[M].北京:科技出版社,1993.[23]NieGJ,WenzelJG.Adaptationofthehypoosmoticswellingtestto[7]刘金荣,路华,任春山,等.男性生育力的研究:三种精子测assessfunctionalintegrityofstallionspermatozoalplasmamem2定方法的比较[J].男性学杂志,1992,6(1):18～21.branes[J].Theriogenology,2001,55(4):1005～1018.233 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